Name: I ·クライオキットを使用してマウスの精子の凍結保存と回復 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 学ぶマウス精子の凍結保存と回復法。I・Cryoキットを用いて液体窒素で長期保存し、体外受精で遺伝子改変マウス系統を効率的にアーカイブする技術を解説。

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ここで紹介する研究は、チャールズリバーによってサポートされていました。著者らは、動物のケアとホルモンの注射のための遺伝子組み換えモデルとサービスのグループと発生学のスタッフに最も感謝しています。

1。マウス精子の凍結保存<ol><li>凍結保存される各行は、開始前に以下を準備。 <ol><li>キットCPAの240リットルの4ウェルディッシュの1ウェル</li><li>次のように15精子の凍結保存ストロー<ol><li>注射器に最も近い綿栓で1 mLシリンジに0.25mlのストローを接続します。それぞれのわらでは、次に体外受精培地の8センチメートル（約160μl）を、空気の1cmをロードする。保持される行の名前で藁にラベルを付けます。 </li></ol></li></ol></li><li> LN 2は泡箱の奥深くに15センチメートルでなければなりません。蓋を閉じます。 </li><li>凍結保存される各行から2雄マウスを安楽死させる。マウスは、10〜60週齢の間でなければなりません。各マウスから輸精管と一緒に2つ尾副睾丸を削除します。 </li><li>事前に準備されたCPA -含む4ウェルディッシュ（ステップ1.1）のウェルに上体を置きます。 </li><li>各精巣上体5-7長手方向のカットを作成し、静かに精子を押し出すために、各輸精管を絞る。 </li><li> 3〜5分間、室温で軽く手でCPAおよび精巣上体混合物を振る。これは、精子が出て泳ぐことができるようになります。 </li><li>事前に準備したわらを使用して、精子懸濁液の5mmの（約10μl）を吸引除去し、空気の1cm。 </li><li> 15ストローの合計で最大で、このプロセスを繰り返します。最高の精子の生存のための10分以内にロードし、シールのストロー。 </li><li>慎重にわらの両側をシール加熱する。第一精子の列で凍結キャニスターにストローを置きます。 </li><li>ハンドルを延長するキャニスターにキットの一部として提供されている1 mlのピ​​ペットを取り付けます。蓋の穴から泡箱にLN 2のキャニスターを置きます。 10分間LN 2で垂直に浮いてキャニスターを許可する。 </li><li> LN2のキャニスターを浸し。精子は、現在凍結されており、長期的なLN 2ストレージに移動することができます。 </li><li>キャニスターはには使用しないでください次の行はそれまで、室温まで加温している。 </li></ol> 2。マウスの過剰排卵<ol><li>一般的に、精子のドナーと同じ背景の若いメスのマウスを使用してください。 </li><li>マウスは〜12グラム（生後3〜4週間）になります。 </li><li>妊馬血清ゴナドトロピン（PMSG）の5〜10 IUと腹腔内注射を行います。 </li><li> 46〜48時間を待つ。 </li><li>ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）の5〜10 IUと腹腔内注射を行います。 </li><li>収穫の卵母細胞後述するようにhCGを注射後14〜16時間。 </li></ol> 3。マウスの精子の回収と体外受精<ol><li>体外受精の前に、各ストロー融解するため、以下を準備し、37℃CO 2インキュベーターで1時間以上平衡化します。 <ol><li>精子の培養皿：ある35ミリメートルペトリ皿、油で覆われた精子処理媒体（STM）の90μlのドロップで。 </li><li>料理を切断：卵のコレクションには10秒の最大値からuperovulated女性、体外受精培地3mlワン35ミリメートルペトリ皿。 </li><li> IVFも：体外受精のための5過排卵女性、体外受精培地の500μlの（。。。あなたが10過排卵女性を使用している場合、たとえば、あなたは2井戸が必要となります）4ウェルディッシュの1つのウェルの各グループについて</li><li>洗濯料理：使用される4もIVFディッシュの各ウェルを洗浄するためのカリウムシンプレックス最適化された培地（KSOM）3mlのワン35ミリメートルペトリ皿</li><li>培養皿：IVFディッシュの各ウェルから胚培養のためのオイルで覆わKSOM培地50μl滴ワン35ミリメートルペトリ皿。 </li></ol></li><li> LN 2からわらを外し、2〜3分間37℃の水浴中での場所。 </li><li>水浴からストローを取り出して、余分な水分を除去するために拭きます。綿栓最も近い第1の空気の列の近くに最初のカットを行います。体外受精培地にストローをカットすることも、精子の列の前に表示される気柱が存在します。 </li><li>その後、s内のストローの端をカットecond気柱、精子の列をカットするように注意しながら。 45の角度でカット - これは、精子を吸引することが容易になります。 </li><li> 200μlのピペッターとストローの先端から精子懸濁液を吸引除去する。 </li><li> STMのドロップの中心に精子懸濁液を置き、37℃、5％CO 2インキュベーターで45〜60分間皿をインキュベートする。 </li><li>精子のインキュベーションの間に、切削皿に過剰排卵の雌の卵管を細かく分析。卵丘 - 卵子複合体（COCs）を放出、各卵管を引き裂くために30gの針やピンセットを使用してください。汚れたメディアが余分な洗浄ステップのためになるように体外受精培地の脂肪と血を避けてください。 </li><li>一度、すべての卵管が引き裂かれて、雌5から各IVF井戸にCOCsを転送する。排卵によって生成COCsの数は非常に依存株である。 </li><li> STMのドロップの周辺から精子の10〜15μlを収集し一体外受精の受精も約14-16時間はhCGのINJを投稿するection。よく使用されるそれぞれの受精を繰り返します。最終的な精子の濃度は約100万/ mlとなります。 </li><li> 37℃5％CO 2インキュベーターで4〜6時間共培養精子と卵母細胞。 </li><li> 37℃5％CO 2インキュベーター内で開発するためのKSOM降下で2倍と文化のKSOM最小で胚を洗浄してください。 </li><li>体外受精率は、一晩培養した後に使用される総卵母細胞の二つ細胞期胚外として算出した。 </li></ol> 4。代表的な結果 5チャールズリバーマウス近交系から精子を凍結させた。保護率は新鮮精子の評価値によって凍結精子の評価値で割って算出されています。精子の運動性の保護率はそれぞれ60.2パーセント、81.3パーセント、78.6パーセント、66.5パーセント、C57BL/6NCrl、129S2/SvPasCrl、FVB / NCrl、DBA/2NCrl、およびBALB / cAnNCrlのための61.0パーセントであった。急速な進歩的な運動のための保護率は47.3％、69.4パーセント、57.0パーセント、52.8パーセント、C57BL/6NCrl、129S2/SvPasの54.1％であった<html> CRL、FVB / NCrl、DBA/2NCrl、それぞれBALB / cAnNCrl、（図1）。 凍結融解精子で体外受精率はそれぞれ55.7パーセント、26.4パーセント、87.3パーセント、C57BL/6NCrl、129S2/SvPasCrl、FVB / NCrl、DBA/2NCrl、およびBALB / cAnNCrlで87.8パーセントと26.2％（図2）であった。 1.5年の期間にわたって、49 GMのマウス系統は、精子の凍結保存によってアーカイブされた。これらの行は、後に正常女性4系統の体外受精（C57BL / 6、BALB / C、DBA / 1と129Sv）（図3）で（として生まれたライブ子犬によって定義される）を回収した。 <img alt="図1。" src="/files/ftp_upload/3713/3713fig1.jpg" /> 図1マウスにおける精子の運動性と急速な進歩運動の保護比<img alt="図2。" src="/files/ftp_upload/3713/3713fig2.jpg" /> マウスにおける凍結融解精子と図2。体外受精3713fig3.jpg&quot;/&gt; 図3。GMのマウスにおける凍結融解精子による体外受精で

<ol><li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li>
<li>Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+normal+young+following+transfer+of+mouse+embryos+obtained+by+in+vitro+fertilization+using+cryopreserved+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa.</a> Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).</li>
<li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+of+cryopreserved+mouse+spermatozoa+affected+by+temperature+of+collection+and+rate+of+thawing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing.</a> Cryobiology. 35, 46-52 (1997).</li>
<li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa%3A+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks%2C+mutagenesis+screens%2C+and+mouse+backcrosses%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.+Genome%22%5BJournal%5D)">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li>
<li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li>
<li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li>
<li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li>
<li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li>
<li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li>
<li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li>
<li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserving%2C+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li>
</ol>

著者らは、チャールズ川、このキットのメーカーの社員です。

1990年以来、18％ラフィノース、3％スキムミルクを使用して基本的な精子の凍結プロトコルは、マウスの多くの株で信頼性が証明されているとマウス系統の多数は、1,2,3,4,5,6,7を凍結保存されている。凍結と融解過程で精子細胞の損傷の主な原因は、氷の形成8,9および活性酸素種10に関連している。凍結培地のようなモノチオグリセロールなどのアミノ酸などのフリーラジカルスカベンジャー、および還元剤、、補充を調査し、大幅にC57BL / 6 11,6含む近交系における凍結融解精子で体外受精率を高めることが証明されました。 現在のプロトコルでは、我々は市販の抗酸化物質と氷のブロッカーとの基本的なCPAを最適化することで、精子の凍結や体外受精の手順を変更することにより、マウスの精子の凍結保存のために新しいI•クライオキットを開発しました。精子の運動性の保護率（&gt; 60％）と急速進行性の運動性は、（&gt; 45％）I•クライオキットで凍結five近交系マウスからの精子のために見られた。 5マウス近交系における凍結融解精子2細胞期の胚発生率が著しく基本的なCPA 11,6とそれに比べて改善されました。 キットを使用して、ユーザは、各行の2人の男性からの凍結精子で濃縮された精子懸濁液を作成します。唯一の凍結15ストローによってプロセスが簡単に、高速で、短期または長期の保管のための少ないストレージスペースを占有。ほとんどの時間は、マウスの線は、1または2ストローを融解​​することによって回復することができます。

<table><tbody><tr><td>CPA</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>キットに付属</td></tr><tr><td>STM</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>キットに付属</td></tr><tr><td>IVF培地</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>キットに付属</td></tr><tr><td>0.25 ml プラスチックストロー</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>キットに付属</td></tr><tr><td>精子凍結キャニスター</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>キットに付属</td></tr><tr><td>ケーンおよびゴブレット</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>キットに付属</td></tr><tr><td>ミネラルオイル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>胚テスト済みであること</td></tr><tr><td>KSOM培地</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>35 mm ペトリ皿</td><td>Falcon BD</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>ヒートシーラー</td><td>ABTEC</td><td>TISH-200</td><td></td></tr><tr><td>4ウェルマルチディッシュ</td><td>Nalge Nunc international</td><td>73521-424</td><td></td></tr><tr><td>ピペッター</td><td>Gilson, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td>各種</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C + 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; インキュベーター</td><td>各種</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LN&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 保存システム</td><td>各種</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C ウォーターバス</td><td>VWR international</td><td>89032-196</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Intervet Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>EMD Millipore</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>1cc シリンジ（26G 3/8 針付き）</td><td>BD Biosciences</td><td>BD309625</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖用はさみ</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>30ゲージ &amp;frac12; 針</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6802</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5135, RS-5110, RS-5005</td><td></td></tr></tbody></table>

i ·クライオキットを使用してマウスの精子の凍結保存と回復

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

マウスの新たな遺伝子組み換え（GM）株の何千もの遺伝子導入やノックアウト技術の出現以来、作成されている。これらの貴重な動物の多くは、緊急の場合のバックアップなしプランで、生きている動物としてのみ存在します。胚の凍結保存は、このバックアップを提供するが、高価であることができる、長い手順である、と一般的には成功のための動物の多数を必要とすることができます。マウスの精子が正常に18％ラフィノース、3％スキムミルクで構成される基本的な凍結防止剤（CPA）で凍結保存することができることが発見されて以来、精子の凍結保存は、アーカイブの配布およびこれらの貴重な株の回復のために受け入れ可能でコスト効果の高い手順となっている。 ここでは、マウス精子の凍結保存のための新開発のI•クライオキットを示しています。近交系マウス五一般的に使用されている菌株からの精子は、このキットを使用して凍結し、回収した。精子の運動性の高い保護率（&gt;60％）と制御（基本CPA）に比べて急速に進行性の運動性（&gt; 45％）5近交系マウスで、このキットで凍結精子のために見られた。回収した精子で体外受精後の二細胞期胚の開発は、調査全5マウス系統で一貫して改善された。 1.5年の期間にわたって、49 GMのマウス系統は、I•クライオキットで精子の凍結保存によってアーカイブされ、後にIVFにより回収。

ここでは、マウス精子の凍結保存のための新開発のI•クライオキットを示しています。凍結融解精子を持つ二細胞期胚の開発は、このキットの使用で5マウス系統で一貫して改善された。 1.5年の期間に、49遺伝子改変マウス系統は、I•クライオキットで精子の凍結保存によってアーカイブされ、後に正常IVFによって回収。

I ·クライオキットを使用してマウスの精子の凍結保存と回復

トランスジェネシスおよびノックアウト技術の登場以来、数千もの新しい遺伝子組換え（GM）マウス系統が作製されてきました。これらの多くは……

この手順の全体的な目的は、マウス精子を凍結保存することです。まず、凍結保存用ストローを用いてマウスの精巣上体（EPI）から精子を回収します。次に、ストローを液体窒素中で凍結させ、温水で解凍して回収するまで保存します。回収されたマウス精子は、最終的に体外受精に使用されます。既存の手法に対する本キットの主な利点は、マウス精子の凍結保存および回収に必要なすべての材料がキットに含まれていることです。一般的に、この手法に不慣れな方は、ストローの取り扱いおよび充填に苦労することがあります。まず、凍結保存するマウスの系統あたり15本の精子凍結保存用ストローを準備します。まず、各0.25 milliliterストローを1 milliliterシリンジに接続します。このとき、綿プラグがシリンジに近い側にくるようにしてください。次に、各ストローにIVF培地を8 centimeters分、続いて空気を1 centimeter分充填します。最後に、凍結保存する各系統について、保存対象の系統名を15本の各ストローに記載します。4ウェルディッシュのウェルに240 µLの凍結保護剤を満たします。凍結キャニスターのハンドルに1 mLピペットを取り付け、ハンドルの長さを延長します。最後に、キットに付属のフォーム断熱ボックスに15 cmまで液体窒素を満たし、蓋を閉じて安楽死させます。生殖能のある成体雄マウス2匹を用意します。凍結保存および外科的手法を用いる各系統について、尾側EPIを除去します。マウスを背臥位にし、腹壁を切開します。広背筋をそっと引っ張り、余分な脂肪を除去します。次に、精巣上体を特定し、少量の広背筋と共にそのまま摘出します。解剖顕微鏡下で、CPAを満たした準備済みの4ウェルディッシュのウェルに精巣上体を入れます。各精巣上体に5〜7本の縦切り目を入れます。次に、ピンセットを用いて、各切り目を軽く圧迫します。精子を押し出すため、CPAと精巣上体の混合液を室温で3〜5分間インキュベートします。インキュベーション中に、ディッシュを手で2〜3回そっと揺らします。これにより、精子が吸引によって泳ぎ出します。準備した各ストローに、精子懸濁液を5 mm分ロードし、続いて空気を1 cm分入れます。凍結工程において、すべてのストローに均等に充填することが重要です。15本すべてのストローに充填した後、各ストローの両端を注意深く熱シールします。精子の生存率を確保するため、15本すべての工程を10分以内に完了させてください。すべてのストローの準備が完了したら、それらを凍結キャニスターの精液カラムに装填します。まず、キャニスターをフォームボックスに入れ、液体窒素中で垂直に浮遊させます。精液の凍結速度に影響が出るため、キャニスターは10分間垂直に浮遊させておく必要があります。次に、キャニスターを液体窒素に浸します。これにより精子は凍結保存され、液体窒素による長期保存が可能な状態になります。予定している精子回収の約60時間前に、IVFの前に、記載のプロトコルに従って雌に超排卵処置を行います。解凍するストローごとに、すべての培地を準備し、37 °C、5% carbon dioxideの条件下で少なくとも1時間平衡化させます。これらの材料には、オイルで覆われた90 µLの精子処理培地のドロップが入った35 mmペトリ皿が含まれます。切断用ディッシュとして、3 mLのIVF培地を入れた35 mmペトリ皿を用意し、さらに、超排卵させた雌5匹につき1つのIVFディッシュ（500 µLのIVF培地を満たした4ウェルプレートの1ウェル）を用意します。各IVFディッシュに対して、洗浄用ディッシュ（3 mLのKSOMを入れた35 mmペトリ皿）と、胚培養用ディッシュ（オイルで被覆された50 µLのKSOM培地ドロップを配置した35 mmペトリ皿）を準備します。必要な材料がすべて揃ったら、速やかにストローを保管場所から取り出し、37 °Cの恒温水槽に2〜3分間浸します。ストローの水分を拭き取ります。次に、綿プラグの下にある空気柱に斜めに切り込みを入れます。ストローの反対端で、もう一つの空気柱に同様に斜めの切り込みを入れます。精子カラムを切断しないように注意してください。次に、200 µL ピペットを用いてストローの端から精子懸濁液を吸引し、精子処理培地ドロップの中央に滴下します。その後、ディッシュを 45 〜 60 分間インキュベートします。精子のインキュベーション中に、超排卵させた雌から子宮角を摘出し、カッティングディッシュに移します。30ゲージの針またはピンセットを用いて各輸卵管を破裂させ、卵丘細胞複合体を放出させます。5匹の雌から回収した卵丘細胞複合体を、各IVFに移します。培地を最小限の量で採取します。不純な培地は受精効率を低下させるため、脂肪や血液の混入は避けてください。インキュベーション後、STM液滴の周辺から精子懸濁液を10〜15 µL回収し、IVF用容器の1つに注入します。次に、受精させるために細胞を4〜6時間共培養します。受精後、洗浄皿を用いて胚を少なくとも2回のSOM洗浄にかけます。その後、培養します。目的の発達段階に達するまで、胚をKSOMで培養します。Charles River社の5種類の近交系マウス由来の精子を凍結しました。これらの精子における精子運動率および快速前進運動率の保持率は、5株間で81%から47%の範囲でした。凍結融解精子を用いたIVF率は、1年半にわたる異なる系統間で26%から88%まで変動しました。合計49株のGMマウスラインが精子凍結保存によってアーカイブされ、その後、C57BL/6、BC DBA/1、129SVの4つの異なる雌系統でのIVFによって回収されました。精子凍結保存技術を習得すれば、適切に実施することで30分以内に完了させることができます。この手順では、キャニスターに垂直に流し、液体窒素を用いることが重要です。

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