Techniques d'analyse permettant de doser la bioactivité d'oxyde nitrique

L’objectif général de l’expérience suivante est de démontrer comment détecter avec précision et précision les métabolites de l’oxyde nitrique dans des échantillons biologiques. Pour ce faire, il traite d’abord les échantillons de sang immédiatement après le prélèvement afin d’éviter la perte de métabolites ou la formation d’artefacts. En même temps, un prélèvement rapide et efficace de tissus est effectué pour minimiser les effets d’un environnement hypoxique sur les métabolites de l’oxyde nitrique.

Les anneaux aortiques sont collectés et suspendus dans un bain d’organe pour évaluer leur fonction endothéliale. De plus, des tests biochimiques sont utilisés pour quantifier les niveaux de nitrates, les niveaux de nitrites et les niveaux relatifs de nitrothiols et d’autres produits nitrosaturés dans les tissus. À l’aide de ces tests, une comparaison appropriée entre les animaux de laboratoire et les animaux témoins peut générer des informations précieuses sur la production et le métabolisme de l’oxyde nitrique.

Le principal avantage de l’utilisation de cette approche multisystémique par rapport à des méthodes ou des tests uniques est qu’elle permettrait d’obtenir une image plus large de la biochimie de l’oxyde nitrique dans plusieurs systèmes d’organes. Ainsi, nous pouvons commencer à comprendre lesquels de ces métabolites peuvent avoir une utilité pronostique ou diagnostique, et comment le répertoire de métabolites de l’oxyde nitrique reflète la formation et la disponibilité de l’oxyde nitrique endothélial. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car chaque étape du processus est essentielle pour maintenir l’intégrité de l’échantillon.

Certaines de ces étapes ne sont pas apparentes dans la section des méthodes de lecture d’une revue typique en raison de la finesse des détails de la collecte d’échantillons et de l’extraction des tissus. La démonstration de cette procédure sera le Dr Hong Jing. Un chercheur scientifique senior de mon laboratoire Pour ce protocole dispose d’une personne ou d’un animal de laboratoire pour une collecte de sang pour des animaux de laboratoire dont les tissus seront également examinés.

Tout d’abord, prélevez du sang total en insérant une aiguille de calibre 25 dans la veine cave inférieure. Une fois que 500 à 1000 microlitres ont été prélevés, perfuser l’animal sans sang restant en injectant un tampon physiologique à travers l’apex du ventricule gauche et permettre un remplacement complet du sang lorsque le sang et le tampon sortent par l’AVC ven inférieur. Le sang veineux doit être prélevé dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre contenant du NEM et de l’EDTA immédiatement après le prélèvement.

Faites tourner le sang à 14, 300 RCF pendant sept minutes après la centrifugation. Aspirez le plasma de la pastille de globule rouge à l’aide d’une pipette et transférez-le dans un tube séparé. Préparez les échantillons de plasma isolés pour la HPLC en ajoutant d’abord un volume individuel de méthanol froid à 50 microlitres de la collection de plasma.

Vortex, le mélange vigoureusement pendant trois à cinq secondes jusqu’à ce qu’il soit trouble. Centrifugez ensuite le mélange à 14, 300 RCF pendant sept minutes. Pour précipiter les protéines plasmatiques, collectez le supernat dans un tube séparé de 1,5 millilitre et stockez-le à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il puisse être analysé.

Pour préparer le plasma à l’analyse par chimiluminescence, prenez le volume de plasma restant, qui doit être d’environ 200 à 400 microlitres, et divisez-le en deux volumes. Préparez la moitié du plasma en ajoutant un volume de 10 % de sulfure acidifié à 5 %, et attendez 10 minutes. Cet échantillon est maintenant prêt pour l’analyse CLD.

Préparez une autre moitié du plasma en ajoutant 10 % de volume de chlorure mercurique à 2 % après cinq minutes. À température ambiante, ajoutez 10 % de volume de sulfamide acidifié. Attendez encore 10 minutes et injectez cet échantillon dans le CLD comme le plasma.

La pastille de globules rouges peut être préparée pour la HPLC et la CLD pour l’une ou l’autre analyse. Commencez par mélanger une partie de pastille de cellule à quatre parties de solution de lyse hypotonique. Tourbillonnez soigneusement le mélange pour l’analyse CLD.

La préparation pour les cellules est la même que celle effectuée pour le plasma. Commencez par ajouter un volume égal de méthanol. Ensuite, faites tourbillonner vigoureusement le mélange pendant trois à cinq secondes, puis faites-le tourner pendant sept minutes à 14 300 RCF.

Maintenant, pipetez le surnageant et stockez-le à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il puisse être analysé par HPLC pour déterminer les niveaux tissulaires de métabolites de l’oxyde nitrique. Dans les tissus d’intérêt provenant d’animaux de laboratoire, le sang doit d’abord être prélevé et préparé comme décrit dans la section précédente, la récolte des tissus doit être effectuée comme d’habitude avec une attention particulière portée à la vitesse et à l’efficacité afin que les tissus ne deviennent pas hypoxiques. Une fois prélevés, les échantillons de tissus ont été homogénéisés dans un rapport de un à cinq de N-E-M-E-D-T-A contenant du PBS.

Préparez ensuite les tissus homogénéisés pour l’analyse HPLC et CLD comme décrit dans les sections précédentes pour les GR. Après avoir anesthésié une souris adulte avec de l’éther dathylique et confirmé qu’elle ne répond pas à un pincement de l’orteil, effectuez une thoracotomie. Une incision médiane est pratiquée du sternum jusqu’à la région pubienne pour exposer les cavités thoracique et abdominale.

Ensuite, perfuser l’animal avec un tampon oxygéné Krebs Alite. Utilisez une seringue de calibre 25 pour injecter le tampon dans l’apex du ventricule gauche. Avec l’oreillette droite est ouverte pour fournir une sortie pour le sang.

Après la perfusion, isolez l’aorte abdominale en coupant et en enlevant le foie, les poumons et d’autres tissus qui peuvent recouvrir l’aorte. Ensuite, tenez le cœur avec une paire de pinces et coupez l’aorte de la paroi postérieure de l’animal de manière douce. Placez le cœur et l’aorte dans une boîte de Pétri remplie de glace.

Tampon Krebs froid dans le plat. Coupez soigneusement et nettoyez la graisse et les adventices de l’aorte. Évitez d’endommager l’endothélium à l’intérieur du vaisseau pendant le nettoyage.

Gardez le métabolisme de l’aorte lent pour éviter l’hypoxie en le transférant dans un tampon oxygéné frais et glacé toutes les cinq minutes. Utilisez maintenant un scalpel pour couper l’aorte en segments en forme d’anneau de trois millimètres de long. Transférez les segments dans un bain d’organe tissulaire à quatre canaux de 10 millilitres chargé d’un tampon Krebs oxygéné.

À l’aide du bouton du transducteur, appliquez 1,5 gramme de prétension à chaque anneau aortique. Selon les résultats empiriques. 1,5 gramme est la tension de départ appropriée pour une fonction vasomotrice optimale.

Dans le moniteur de la souris, enregistrez la mesure de la force à l’aide d’un pont octal à huit canaux et d’un logiciel d’acquisition de données, laissez les anneaux s’équilibrer pendant 80 minutes, en changeant la mémoire tampon toutes les 20 minutes, puis procédez à l’expérimentation. Une fois que la tension tissulaire s’est équilibrée, ajoutez 100 rine de fenouil nanomolaire à chaque anneau pour une contraction sous-maximale. Une fois que la tension de l’anneau s’est stabilisée et qu’il y a un niveau de tonus stable, effectuez une analyse dose-réponse à un agoniste endothélial tel que l’acétylcholine.

Cela déterminera la production d’oxyde nitrique et le degré de relaxation du récipient. Après la dose-réponse à l’acétylcholine, rincez les bains avec un tampon Krebs et ajoutez 100 nanomolaires de fenouil rine à chaque bain d’organe pour contracter les vaisseaux. Encore une fois, déterminez la réactivité des anneaux musculaires lisses à une source exogène d’oxyde nitrique telle que le nitropresse de sodium avec et sans ODQ, un inhibiteur de la guile cyclase soluble.

Ce type d’approche déterminera une valeur de relaxation de 100 % pour les vaisseaux et démontrera également la nature essentielle de la guile cyclase soluble dans la médiation de la réponse de l’oxyde nitrique à la relaxation vasculaire. Étant donné que l’ODQ empêchera la relaxation à l’acide nitrique de sodium en réponse à l’acétylcholine, les anneaux aortiques du contrôle sain, les souris se sont détendues tandis que les anneaux aortiques des souris présentant un dysfonctionnement endothélial ont montré une relaxation réduite en raison d’une réduction de la production d’oxyde nitrique. Des essais de nitrosation spécifiques au groupe ont également été effectués sur la chimiluminescence des nitrites chez les animaux témoins.

RSNO et RNNO ont été détectés à l’aide d’un test de nitros réducteur. En soustrayant les zones de pic, les niveaux de nitrite et de r sno ont été mesurés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’oxyde nitrique et de la biologie vasculaire, telles que : comment les niveaux circulants de ces métabolites de l’oxyde nitrique reflètent-ils les niveaux tissulaires et comment les métabolites de la maladie changent dans différentes conditions de maladie ?

La détermination des concentrations à l’état d’équilibre et de la demi-vie de ces métabolites d’oxyde nitrique pertinents dans plusieurs systèmes d’organes et tout au long de la circulation d’un seul animal permettra d’identifier des signatures moléculaires spécifiques des processus pathologiques et nous aidera à définir de nouvelles modalités de traitement basées sur l’oxyde nitrique, ce qui permettra au clinicien d’être armé de meilleurs biomarqueurs de la gravité ou de la progression de la maladie. En général, les personnes novices dans le domaine de l’acide nitrique auront des difficultés parce que beaucoup minimisent suffisamment pour détecter et quantifier ces faibles niveaux de métabolisation de l’acide trique trouvés dans les échantillons biologiques. Tout d’abord, une non-compétence en art créera probablement des artefacts pendant le traitement de l’échantillon qui nécessitent des données erronées et une mauvaise interprétation des données.