Name: Quantification de la colonisation fongique, sporogénèse, et la production de mycotoxines utilisant Bioassays noyau (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Découvrez la quantification de la colonisation fongique et des mycotoxines par bioassais sur noyaux. Cette méthode standardisée permet d'étudier les interactions graines-champignons et d'améliorer la protection des cultures céréalières.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous tenons à remercier Brandon Hassett et Carlos Ortiz pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par la NSF subventions IOB-0544428, 0951272-IOS, IOS et-0925561 au Dr Michael Kolomiets, et par l&#39;Institut national de l&#39;USDA pour l&#39;alimentation et l&#39;agriculture (NIFA), l&#39;amélioration des plantes et de l&#39;éducation AFRI Grant # 2010-85117 -20539 à MM. Seth Murray, Thomas Isakeit, et Kolomiets Michael.

1. Essais biologiques grain de maïs <ol><li> Deux semaines avant, la culture des champignons pathogènes sur Potato Dextrose Agar (PDA) à 28 ° C. </li><li> Sélectionnez les noyaux avec la taille et de forme semblables, de préférence aplatie afin qu&#39;ils jeter au niveau du fond des flacons de dosage biologique, et les placer dans des tubes de 50 ml de faucon. Noyaux sélectionnés doivent avoir été produites simultanément dans un même environnement pour assurer l&#39;âge de semences ou de composition analogue métabolite. </li><li> Surface stériliser les noyaux en secouant tubes à température ambiante pendant 5 minutes avec de l&#39;éthanol 70%, 1 minute à l&#39;eau stérile, et à 10 minutes avec de l&#39;hypochlorite de sodium à 6%. Rincez, trois fois, pendant 5 minutes à chaque fois, avec de l&#39;eau stérile tout en secouant continue. Séchez noyaux sur des serviettes en autoclave. </li><li> Pour faciliter l&#39;infection par Aspergillus flavus, créer une petite plaie sur l&#39;embryon à côte avec une aiguille G 18 à la profondeur de 0,5 cm. Cependant, dans notre expérience une grande blessure est nécessaire pour Fusarium verticillioides infection. Therefore, utilisez une lame de rasoir pour couper dans l&#39;embryon à côte à une profondeur de 0,5 mm. </li><li> Préparer suspension de l&#39;inoculum en grattant les plaques de culture dans environ 5 ml de autoclavé 0,01% de Tween-20 une solution pour libérer des spores et mycélium retirer par la gravité de filtrage à travers au moins 4 couches de gaze stérilisé à l&#39;autoclave. Calculer la concentration de spores avec hémocytomètre et ajuster à 10 6 spores / ml pour A. flavus ou F. verticillioides. Si vous utilisez d&#39;autres espèces de pathogènes ou de l&#39;hôte, il est important d&#39;évaluer les concentrations d&#39;inoculum pour l&#39;infection appropriées. </li><li> Créer une chambre d&#39;humidité dans un récipient en plastique (29,2 cm X 18,7 cm X 8,3 cm) bordée de cinq feuilles de papier essuie-tout et 100 ml d&#39;eau stérile. Chambre n&#39;est pas à l&#39;eau ou à l&#39;air et l&#39;eau supplémentaire devrait être ajoutée tout au long de l&#39;expérience pour garder des serviettes en papier humide. </li><li> Placer les quatre noyaux dans une fiole de 20 ml autoclavé à scintillation en verre et d&#39;enregistrer leur masse. Inoculer avec 200 ul suspension de spores,bouchon, et le vortex de noyaux enrober avec la suspension. Desserrer les écrous de permettre un échange librement l&#39;air et le lieu dans la chambre de l&#39;humidité. </li></ol> Remarque: Pour les graines ou les champignons autres que ceux décrits dans ces méthodes, la quantité d&#39;inoculum requis peut être différente et doit être déduit empiriquement. <ol start="8"><li> Incuber les noyaux sous une photopériode 12-h-light/12-h-dark à 28 ° C pendant 7 jours ou jusqu&#39;à ce que désiré. </li></ol> 2. Énumération conidies <ol><li> Après la période d&#39;infection, ajoutez 5 ml d&#39;autoclave 0,01% de Tween-20 dans des flacons à scintillation contenant des grains infectés et vortex à fond pendant 1 minute. </li><li> En utilisant une pointe de gros calibre pipette, diluer immédiatement en transférant deux séparés 200 aliquotes de suspension de spores dans des tubes Eppendorf 2,0 ml contenant 1,8 ml de 0,01% de Tween-20 (ou diluer au besoin en fonction de l&#39;infection). </li><li> Dénombrer chaque partie aliquote de 200 ul à deux reprises avec un hémocytomètre 4et comparer les niveaux de conidies entre les traitements. </li></ol> 3. Quantification par l&#39;aflatoxine <ol><li> Ajouter les grains de 1 échantillon à 50 ml tasse de mélangeur avec 20 ml de méthanol à 80% et de 0,05 g de NaCl, la couverture et de mélange à haute vitesse pendant 1 min. </li><li> Placer un papier filtre plissé sur un navire de collecte propre et verser dans le filtre extrait. </li><li> Transférer 10 ml du filtrat dans un récipient propre, ajouter 20 ml d&#39;eau distillée H 2 O, et bien mélanger. </li><li> Échantillon de filtre à travers un filtre 1,5 um en microfibres de verre dans une tasse propre. </li><li> Appliquer une ml d&#39;extrait filtré pour colonne d&#39;essai AFLA et, à l&#39;aide d&#39;air comprimé, forcer l&#39;extrait filtré à travers la colonne à une vitesse de 1-2 gouttes par seconde jusqu&#39;à ce vidés. </li><li> Laver la colonne deux fois avec 1 ml d&#39;eau distillée H 2 O et de passer à travers la colonne à 1-2 goutte / seconde jusqu&#39;à ce que l&#39;air qui en sort. </li><li> Colonne Eluer avec 1ml de 100% méthanol de qualité HPLC à un 1-2 goutte / seconde vitesse collectées dans une cuve en verre. </li><li> Ajouter1 ml de Developer test AFLA à éluat et bien mélanger. Cuvette en place fluorimètre calibré et lire à 60 sec. </li></ol> Remarque: Lorsque vous utilisez le protocole Aflatest FGIS, la mesure de la fluorimètre est calculée sur la base environ 50 grammes d&#39;échantillon initiales extraites dans 100 ml. Si vous considérez la dilution de l&#39;échantillon avec de l&#39;eau, le ml 1 appliqué à une colonne représente 0,166 grammes d&#39;échantillon. Ainsi, lors de la modification du protocole, vous devez prendre en compte les différences de taille de l&#39;échantillon et la solution d&#39;extraction initiale. Par exemple, 2 grammes de grains sont extraits dans 20 ml de méthanol à 80%. C&#39;est 0,1 grammes par ml. Lorsque 1 ml de l&#39;échantillon est mélangé avec 2 ml d&#39;eau, la proportion de l&#39;échantillon dans le liquide est 0,033 grammes par ml. Si cet échantillon donne une lecture fluoromètre de 100 ppb, la concentration réelle est basée sur la proportion de l&#39;échantillon à 0,166, c&#39;est-à-ppb = (0,166 gramme X 100 ppb) / 0,1 gramme), ou 166 ppb. Pour l&#39;aflatoxine autre quantificationcation des méthodes, voir la référence 7. 4. Fumonisine B1 (FB1) Analyse <ol><li> Lorsque champignon est cultivé sur des grains de maïs, d&#39;extraire des échantillons de nuit avec 10 ml d&#39;acétonitrile / eau (50/50, v / v) à température ambiante sans agitation. Par la suite, mélanger l&#39;extrait (2 ml) avec de l&#39;eau déminéralisée (6 ml), et appliquer ce mélange (8 ml) directement à l&#39;extraction en phase solide C-18. </li><li> Avant de charger l&#39;échantillon, condition sine qua non de la colonne en phase C-18 solide d&#39;extraction par rinçage avec 2 ml d&#39;acétonitrile suivie par 2 ml d&#39;eau. </li><li> Après chargement de l&#39;échantillon, la colonne est lavée avec 2 ml d&#39;eau suivi par 2 ml d&#39;acétonitrile / eau (15/85, v / v). Exemple de l&#39;analyse HPLC (contenant FB1) est élue avec 2 ml d&#39;acétonitrile / eau (70/30, v / v). </li><li> Dérivatiser FB1 avec o-phtaldéhyde (OPA) par le transfert de 0,1 ml de la éluat de la colonne à un flacon contenant 0,1 ml de tampon borate (0,05 M borique acid/0.05 de sodium M borate [50/50, v / v], pH 8,5) et 0,1 ml OPA (0,1 mg / ml dans l&#39;acétoneitrile avec 0,5% - mercaptoéthanol). </li><li> Arrêter la réaction après 10 minutes en ajoutant 0,5 ml d&#39;acide acetonitrile/0.01 M borique (40/60, v / v). </li><li> Analyser FB1 sur un Shimadzu HPLC LC-20AT système équipé d&#39;une colonne analytique Zorbax ODS (4,6 à 150 mm) et une longueur d&#39;onde variable Shimatzu RF-10Axl détecteur de fluorescence (excitation 335 nm / émission 440 nm). </li><li> Un gradient linéaire est utilisé (solvant A: acetonitrile/0.1 M phosphate de sodium (40/60), pH 3,3; solvant B: acétonitrile / phosphate de sodium 0,1 M (60/40), pH 3,3) et le programme de gradient est la suivante: Un 100%. à 100% de B en 10 min, B 100% pendant 5 minutes </li><li> Analyser FB1 normes par HPLC, et les mesures de surface de pic sont utilisées pour générer la courbe standard. Par la suite, de quantifier le niveau FB1 dans un échantillon en comparant les zones de pointe avec FB1 courbe standard. </li></ol> 5. L&#39;ergostérol Analyse <ol><li> Culture du champignon sur les grains de maïs pendant 7-14 jours. </li><li> Après la période d&#39;incubation, ajouter 10 ml de chloroforme: methAÑOL (2:1, v / v) dans chaque flacon. Une fois ajouté, secouez bien et échantillons puis incuber les flacons dans l&#39;obscurité, à température ambiante pendant 24 heures. </li><li> Après 24 heures, centrifuger les échantillons, et de recueillir le surnageant et le filtrer à travers une membrane de nylon 0,45 um. </li><li> Injecter l&#39;échantillon directement dans un Shimadzu HPLC LC-20AT système équipé d&#39;un 4,6 U ODS C18 (200 A, 250 ± 4,6 mm) et un Shimadzu SPD-20A UV / VIS détecteur réglé pour surveiller à 282 nm. </li><li> Utilisation du méthanol (100%) à un débit de 1,5 ml / min, tel que la phase mobile. Déterminer la quantification de l&#39;ergostérol dans les échantillons en comparant les zones de pointe d&#39;échantillons à une courbe standard générée à partir de HPLC ergostérol. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Après ensemencement et l&#39;incubation dans une chambre humide pendant deux à trois jours, l&#39;apparition de champignons commencent à apparaître sur les grains. Sept jours après le traitement, la croissance végétative des plantes traitées devraient être clairement visibles, tout en recueillantcontrôles électroniques des simulacres devrait être infectés (figure 1B, en haut). Les périodes de plus d&#39;incubation sont propices à la croissance végétative plus abondante (figure 1B, en bas). Dans les conditions décrites dans les présentes (figure 2G), A. flavus de type sauvage NRRL 3357 affichaient des valeurs maximales de la colonisation, l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine, et la production des conidies à 8, 6, et 8 jours, respectivement (figure 2, AC). Toutefois, lorsque la contamination par les mycotoxines et conidiation ont été comparés par unité de l&#39;ergostérol, les plus grands niveaux ont été observés à 4 et 6 jours, respectivement (figure 2, DE). Figure 2F résume ces fongiques biomasse dépendant de valeur maximale observations. Fait intéressant, entre 4-6 jours après l&#39;inoculation, les noyaux subissent une dégradation acide nucléique, comme on le voit par l&#39;ARN total à partir d&#39;échantillons sur l&#39;évolution temporelle (Figure 2H, en bas). Plusieurs études, y compris la nôtre, ont examined F. verticilliodies infection sur les grains de maïs 2,8,9,10,11,12 et utilisé avec succès 7-13 jours que le temps des points d&#39;observations. En utilisant les méthodes décrites ici, les fumonisines niveaux allant de 3,500-8,000 ng / g gamme noyau 4,13 et niveaux d&#39;ergostérol de 5.000-10.000 ng / g de noyau 14,13. Figure 3 montre des pics représentatifs pour les fumonisines (en haut) et l&#39;ergostérol (en bas ) à partir de chromatogrammes HPLC. Mesure de l&#39;ergostérol peut également être réalisée via 15 des spectres d&#39;absorption. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig1.jpg" /> Figure 1. Diagramme pour la quantification de la biomasse fongique, sporogénèse, et la production de mycotoxines et des résultats représentatifs pour la croissance végétative à partir de bio-essais du noyau. Diagramme A) décrivant la méthode décrite pour la quantification des paramètres fondamentaux biologiques utilisés pour évaluer la pathogénie des champignons sur les grains de maïs. B) Représentantrésultats pour bioessais noyau. Haut, A. flavus (NRRL3357) sur la croissance végétative des grains de maïs dans l&#39;arrière-plan B73 génétique. Les graines ont été inoculés avec 200 ul de 10 6 spores / mL et photos ont été prises 7 jours après l&#39;inoculation. Bas, F. verticillioides inoculés dans les noyaux B73 fond après l&#39;infection de 13 jours. Noyaux ont été inoculés avec 200 pi de 10 6 spores / mL. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig2.jpg" /> Figure 2. Bioessai Aspergillus flavus noyau temps-cours. B73 noyaux ont été inoculés avec 200 pi de 10 6 spores / ml Aspergillus flavus suspension de conidies et incubées pendant 2-8 jours (G). Toutes les valeurs ont été déterminées à partir de la moyenne du poids sec de 4 noyaux (n = 3-4; moyenne ± SE). A) La colonisation (basé sur l&#39;ergostérol), (B) l&#39;aflatoxine, et (C) ont été quantifiées à l&#39;aide conidiation méthodes décrites ci-dessus. E) l&#39;aflatoxine et (F) conidiation sont affichésen fonction de la biomasse fongique, telle que mesurée à h ergostérol. F) Les valeurs maximales pour l&#39;ergostérol, l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine, et conidiation en fonction de la biomasse fongique - les valeurs maximales pour chaque quantité observée a été fixé à 100%. (H) 1 mg par voie d&#39;ARN total de temps bien sûr. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig3.jpg" /> Figure 3. Représentant chromatographie liquide haute performance (HPLC) chromatogrammes pour les fumonisines B1 (en haut) et l&#39;ergostérol (en bas) isolée à partir de grains infectés par Fusarium verticillioides (M3125).

<ol><li>Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxylipins+as+developmental+and+host-fungal+communication+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals.</a> Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).</li>
<li>Gao, X., Shim, W. -B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+a+maize+9-lipoxygenase+results+in+increased+resistance+to+fungal+pathogens+and+reduced+levels+of+contamination+with+mycotoxin+fumonisin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).</li>
<li>Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+oxylipin-mediated+cross-talk+in+the+Aspergillus+-+seed+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus - seed pathosystem.</a> Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).</li>
<li>Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+lipoxygenase+ZmLOX3+increases+susceptibility+of+maize+to+Aspergillus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).</li>
<li>Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-derived+lipids+and+oxylipins+are+crucial+signals+in+modulating+mycotoxin+production+by+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Toxin+Rev%22%5BJournal%5D)">Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi.</a> Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).</li>
<li>Mukherjee, M., Kim, J. -E., Park, Y. -S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+G+protein+signaling+in+F.+verticillioides+mediate+differential+host-pathogen+responses+on+non-viable+versus+viable+maize+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels.</a> Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).</li>
<li>Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+rapid+methods+for+the+analysis+of+mycotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins.</a> Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).</li>
<li>Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+Fusarium+moniliforme+within+asymptomatic+maize+kernels+and+kernels+associated+with+equine+leukoencephalomalacia%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia.</a> Plant Dis. 76, 144-148 (1992).</li>
<li>Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fumonisin+concentrations+in+kernels+of+transgenic+Bt+maize+hybrids+and+nontransgenic+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids.</a> Plant Dis. 83, 130-138 (1999).</li>
<li>Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusarium+verticillioides+GAP%21%2C+a+gene+encoding+a+putative+glycolipid-anchored+surface+protein%2C+participates+in+conidiation+and+cell+wall+structure+but+not+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence.</a> Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).</li>
<li>Shim, W. -B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Fumonisin+B1+biosynthesis+in+maize+germ+and+degermed+kernels+by+Fusarium+verticillioides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Protect%22%5BJournal%5D)">Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides.</a> J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).</li>
<li>Shim, W. -B., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fumonisin+B1+biosynthesis+and+conidiation+in+Fusarium+verticillioides+by+a+cyclin-like+%28C-type%29+gene%2C+FCC1%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Micrbiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1.</a> Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).</li>
<li>Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).</li>
<li>Shin, J. -H., Shim, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+PPR1+and+PPR2%2C+genes+encoding+regulatory+subunits+of+protein+phosphatase+2A+in+Fusarium+verticillioides%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides.</a> Phytopathol. 99, S119(2009).</li>
<li>Breivik, O. N., Owades, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+Semimicrodetermination+of+Ergosterol+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast.+Agric.+and+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast.</a> Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Je n&#39;ai rien à communiquer.</p

<p class="jove_content"&gt; Les méthodes décrites ici ont été largement testées et éprouvées pour être robuste dans la génération des résultats quantifiables pour la colonisation fongique, sporogénèse, et la production de mycotoxines. En outre, ces méthodes devraient être applicables aux semences des espèces végétales autres qui sont sensibles à la contamination par des champignons (par exemple les arachides mycotoxigéniques, blé, coton, pistaches, etc.) Pour compétentes analyses d&#39;interaction plante-pathogène, il est impératif que les grai...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue # </td></tr><tr><td> Potato Dextrose Agar </td><td> Fisher Scientifique </td><td> S71659A </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Scientifique </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Récipient d &#39;incubation en plastique </td><td> Sterilite </td><td> 1713LAB06 </td></tr><tr><td> Mixer </td><td> Vicam </td><td> 20200 </td></tr><tr><td> 24 cm Filtres plissés </td><td> Vicam </td><td> 31240 </td></tr><tr><td> 1,5 microfibres de verre pm </td><td> Vicam </td><td> 31955 </td></tr><tr><td> Colonne de test afla </td><td> Vicam </td><td> G1024 </td></tr><tr><td> Afrla test pour un développeur </td><td> Vicam </td><td> 32010 </td></tr><tr><td> Le méthanol </td><td> Vicam </td><td> 35016 </td></tr><tr><td> Acétonitrile </td><td> Fisher Scientifique </td><td> AC14952-0025 </td></tr><tr><td> L&#39;éthanol </td><td> Fisher Scientifc </td><td> AC39769-0025 </td></tr><tr><td> Colonne C-18 extraction en phase solide (SPE Prep septembre colonne C18) </td><td> Fisher Scientifique </td><td> 60108-304 </td></tr><tr><td> O-phtalaldéhyde (OPA) </td><td> Sigma Chemical Co </td><td> 79760-5g </td></tr><tr><td> L&#39;acide borique </td><td> Fisher Scientifique </td><td> BP168-500 </td></tr><tr><td> Le borate de sodium </td><td> Fisher Scientifique </td><td> RDCS0330500 </td></tr><tr><td> Mercaptoéthanol </td><td> Fisher Scientifique </td><td> 45-000-231 </td></tr><tr><td> Shimadzu HPLC LC-20AT (pompe) </td><td> Shimadzu Scientific Instruments, Inc </td><td> CL-20AT </td></tr><tr><td> Zorbax ODS colonne (4.6x150mm) </td><td> Agilent Technologies </td><td> 443905-902 </td></tr><tr><td> Shimatzu RF-10Axl détecteur de fluorescence </td><td> Shimadzu Scientific Instruments, Inc </td><td> RF-10AXL </td></tr><tr><td> Phosphate de sodium </td><td> Fisher Scientifique </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> FB1 normes </td><td> Sigma Chemical Co. </td><td> F1147-1mg </td></tr><tr><td> Chloroforme </td><td> VWR </td><td> MK444410 </td></tr><tr><td> Filtre 13 mm seringue à 0,45 um membrane de nylon (HPLC) </td><td> Pall Life Science </td><td> 4426 </td></tr><tr><td> L&#39;ergostérol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 45 480-50G-F </td></tr><tr><td> Flacons à scintillation </td><td> VWR </td><td> 66021-602 </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> Vicam </td><td> G1124 </td></tr></tbody></table>

quantification de la colonisation fongique, sporogénèse, et la production de mycotoxines utilisant bioassays noyau

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Le pourrissement des grains par moisissures infectant les semences constitue l&#39;un des plus grands défis économiques dans le monde entier à la production de céréales, sans parler des risques graves pour la santé humaine et animale. Parmi la production céréalière, le maïs est sans doute la culture la plus touchée, en raison de pertes dues à des agents pathogènes dans l&#39;intégrité du grain et de la contamination des semences par les mycotoxines. Les deux mycotoxines les plus répandues et problématiques pour les producteurs de maïs et de la nourriture et les transformateurs d&#39;alimentation sont les aflatoxines et les fumonisines, produite par Aspergillus flavus et Fusarium verticillioides, respectivement. Des études récentes dans moléculaires des interactions plante-pathogène ont montré prometteur dans la compréhension des mécanismes spécifiques associés à des réponses de plantes à l&#39;infection fongique et 1,2,3,4,5,6 contamination par les mycotoxines. Parce que de nombreux laboratoires sont en utilisant des tests du noyau pour étudier les interactions plante-pathogène, il existe un besoin pour une méthode normalisée pour quantifier différents paramètres biologiques, de sorterésultats des différents laboratoires peuvent être contre-interprété. Pour un moyen fiable et reproductible pour des analyses quantitatives sur les semences, nous avons développé des essais du noyau en laboratoire et des méthodes suivantes pour quantifier la croissance fongique, la biomasse, et la contamination par les mycotoxines. Quatre grains de maïs stérilisés sont inoculés dans des flacons en verre avec une suspension fongique (10 6) et incubé pendant une période prédéterminée. Flacons à échantillon sont ensuite sélectionnés pour le dénombrement des conidies par l&#39;analyse de la biomasse hémocytomètre, basée sur l&#39;ergostérol par chromatographie liquide haute performance (HPLC), la quantification aflatoxine en utilisant une méthode AflaTest fluorimètre, et la quantification des fumonisines par HPLC.

La dévastation des cultures céréalières par moisissures infectant les semences a incité de nombreux efforts de recherche afin de mieux comprendre les interactions plante-pathogène. Pour étudier les semences fongiques interactions dans un environnement de laboratoire, nous avons développé une méthode robuste pour la quantification de la reproduction des champignons, la biomasse et contamination par les mycotoxines en utilisant des essais biologiques du noyau.

Quantification de la colonisation fongique, sporogénèse, et la production de mycotoxines utilisant Bioassays noyau

La pourriture des grains causée par des champignons infectant les semences représente l'un des plus grands défis économiques pour la production céréalière mondiale, sans parler des risques graves...

L'objectif général de cette procédure est de quantifier avec précision la biosynthèse des mycotoxines, l'altération et la croissance afin d'étudier les interactions moléculaires entre les graines et les champignons. Ceci est réalisé en mettant d'abord en place un bioessai sur grains. Ensuite, les kédia sont dénombrés, puis les mycotoxines sont quantifiées.Enfin, la biomasse fongique est mesurée. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant les effets de la physiologie des graines sur le développement de la reproduction et le métabolisme secondaire des champignons mycotoxinogènes, par quantification de la biomasse de kédia et des métabolites secondaires à l’aide de techniques de dénombrement des spores couplées à la chromatographie liquide à haute performance. Le principal avantage de la propagation de cette technique est de normaliser les méthodes dans plusieurs laboratoires afin que les résultats provenant de différents laboratoires puissent être interprétés de manière comparative.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des interactions moléculaires entre les graines et les micro-organismes, comme le mode par lequel les champignons pathogènes détournent le métabolisme lipidique des plantes comme stratégie de virulence. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés, car différentes souches d'angi présentent des schémas de croissance et de développement différents. Il est donc essentiel d'optimiser les conditions pour votre interaction fongique préférée avec les graines deux semaines avant d'effectuer le labyrinthe.Culture d'essai biologique sur les grains. Les agents pathogènes fongiques sur de l'agar de pomme de terre et de dextrose ou PDA à 28 degrés Celsius. Lorsque vous êtes prêt à commencer, sélectionnez des grains similaires par âge, forme et taille, et placez-les dans des tubes de 50 millilitres. Surface.Stérilisez les grains en ajoutant de l'éthanol à 70 % et en agitant les tubes à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, agitez avec de l'eau stérile pendant une minute et avec de l'hypochlorite de sodium à 6 % pendant 10 minutes. Rincez trois fois avec de l'eau stérile en agitant cinq minutes à chaque fois.Ensuite, séchez délicatement les grains sur des serviettes pour autoclave afin de les infecter avec Aspergillus flavus. Utilisez une aiguille de 18 gauge pour créer une petite plaie de 0,5 centimètre de profondeur sur le côté de l'embryon de chaque grain. Pour une infection par Fusarium verticillioides, faites une incision de 0,5 millimètre de profondeur à l’aide d’un rasoir.Préparer la suspension d'inoculum en ajoutant cinq millilitres de solution d'autoclave contenant 0,1 % de Tween 20 aux plaques cultivées, puis utiliser un répandeur cellulaire pour racler les spores. Éliminer le mycélium par gravité en filtrant la solution à travers au moins quatre couches de gaze autoclavée. Utiliser un hémocytomètre pour calculer la concentration de spores et ajuster à 10⁶ spores par millilitre.Pour les deux espèces de champignons, créez une chambre d'humidité dans un récipient en plastique en le tapissant de cinq feuilles de papier essuie-tout et en y ajoutant 100 millilitres d'eau stérile. Ensuite, placez quatre grains dans chaque autoclave.Fiole en verre de 20 millilitres. Pesez-les et enregistrez leur masse. Ajoutez 200 microlitres de suspension de spores dans chaque bouchon de fiole et vortexez pour recouvrir uniformément les grains avec la suspension.Ensuite, desserrer les bouchons pour permettre librement les échanges d'air et placer les flacons dans la chambre d'humidité. Incuber les grains sous un photopériode de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité à 28 degrés Celsius pendant sept jours ou jusqu'à l'obtention du stade souhaité. À la fin de la période d'infection, ajouter cinq millimètres d'autoclave 0,01 % entre 20 et les flacons de simulation contenant les grains infectés et vortexer soigneusement pendant une minute. À l'aide d'une pipette large VRE, diluer immédiatement la suspension de spores en transférant deux aliquots séparés de 200 microlitres dans deux tubes einor de 2 millilitres contenant 1,8 millilitre de Tween 20 à 0,01 %.Utilisez un cytomètre hématique pour compter chaque aliquote deux fois. Pour quantifier l'aflatoxine, ajoutez les grains d'un échantillon unique dans un gobelet de blender de 50 millilitres contenant 20 millilitres de méthanol à 80 % et 0,05 gramme de chlorure de sodium. Fermez et mélangez à vitesse élevée pendant une minute.Placer un papier filtre humidifié au-dessus d’un récipient de collecte propre et verser l’extrait dans le filtre. Transférer 10 millilitres de filtrat dans un récipient propre. Ajouter 20 millilitres d’eau distillée et bien mélanger.Filtrez l'échantillon à travers un filtre en microfibres de verre de 1,5 micron dans un gobelet propre. Appliquez un millilitre d'extrait filtré sur une colonne de test ALE et, à l'aide d'air comprimé, faites passer l'extrait filtré à travers la colonne à un débit d'une à deux gouttes par seconde. Lavez la colonne deux fois avec un millilitre d'eau distillée en la faisant passer à travers la colonne à un débit d'une à deux gouttes par seconde, jusqu'à ce que l'air traverse.Éluez la colonne avec un millilitre de méthanol de qualité HPLC à un débit d'une à deux gouttes par seconde, en recueillant dans un Q VET en verre. Ajoutez un millilitre de réactif de développement ale test à l'EIT et mélangez soigneusement. Placez le Q VET dans un fluorimètre étalonné et lisez la mesure après 60 secondes. Pour l'analyse de l'acine B un ou FB un, ajoutez 10 millilitres d'une solution 50/50 d'acétonitrile dans l'eau à chaque échantillon de bioessai par grain et extrayez toute la nuit à température ambiante sans agitation.Mélanger l'extrait avec six millilitres d'eau déionisée et appliquer sur une colonne en phase solide C18 préconditionnée avec deux millilitres d'acétonitrile, suivis de deux millilitres d'eau. Après le chargement de l'échantillon, laver la colonne avec deux millilitres d'eau, puis avec deux millilitres d'acétonitrile dans l'eau. Éluer l'échantillon contenant le FB1 destiné à l'analyse par HPLC avec deux millilitres d'acétonitrile dans l'eau.Dérivatiser le FB un en transférant un millilitre de la colonne EIT dans un flacon contenant 0,1 millilitre de tampon borate et 0,1 millilitre d'aldéhyde, puis incuber pendant 10 minutes. Arrêter la réaction en ajoutant 0,5 millilitre d'acétonitrile et une solution d'acide borique à 0,01 molaire. Analyser le FB un par HPLC en utilisant un gradient linéaire d'acétonitrile et de phosphate de sodium à 0,1 molaire.Comparer les échantillons à une courbe standard de FB afin d'analyser la culture de stérols, le champignon sur maïs pendant sept à quatorze jours. Après la période d'incubation, ajouter 10 millilitres de chloroforme-méthanol à chaque flacon. Agiter soigneusement les échantillons, puis incuber les flacons à l’abri de la lumière à température ambiante pendant 24 heures.Centrifuger les échantillons à 5 000 tr/min pendant trois minutes. Ensuite, filtrer le surnageant à travers une membrane en nylon de 0,45 micron. Injecter l'échantillon directement dans une colonne HBLC et éluer avec du méthanol à 100 % à un débit de 1,5 millilitre par minute.Quantifiez les échantillons en comparant les aires des pics à une courbe standard établie à partir de grade HPLC ou de goole. Après l'ensemencement et l'incubation dans une chambre d'humidité pendant deux à trois jours. La croissance fongique devrait commencer à apparaître sur les grains comme illustré ici.La croissance végétative observée sept jours après le traitement sur les grains inoculés devrait être nettement visible, tandis que les témoins non infectés doivent rester sains ; des périodes d'incubation plus longues favorisent une croissance végétative plus abondante. Cette figure montre que la souche sauvage de flavus NR RL 3 3 5 7 présentait des valeurs maximales de colonisation, d’accumulation d’aflatoxine et de production de kedia respectivement à quatre, six et huit jours. Toutefois, lorsque la contamination par les mycotoxines et la production étaient comparées par unité de rol, les niveaux les plus élevés ont été observés respectivement à quatre et six jours.Des chromatogrammes représentatifs pour la fumonisine et le rol issus de la chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC), selon les méthodes présentées dans cette vidéo, sont montrés ici. Les concentrations de fumonisine varient de 3 500 à 8 000 nanogrammes par gramme de grain, tandis que celles du rol varient de 5 000 à 10 000 nanogrammes par gramme de grain. Une fois les bioessais sur grains terminés, l’activité, les mycotoxines et la biomasse fongique peuvent toutes être mesurées en deux à quatre jours, selon le nombre d’échantillons expérimentaux.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir d'effectuer les méthodes dans un champ aussi stérile que possible. D'autres méthodes, telles que la phytochimie, les harmoniques, la lipidomique, la protéomique, la transcriptomique ou d'autres « inter-omiques », peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme quels gènes, protéines et voies hormonales sont impliqués dans ces importantes interactions inter-règnes.

quantification-fungal-colonization-sporogenesis-production-mycotoxins

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Pour étudier les processus de développement des ascospores dans Gibberella zeae, une procédure de collecte dans des conditions stériles est filmé afin de générer le plus haut niveau de l'information pour la description du protocole. Ceci devrait faciliter la reproductibilité de l'expérience, un aspect crucial lorsqu'il est plein des tests d'expression du génome profil sont mis en œuvre.

Gibberella zeae ascospores production et la collecte d&#39;expériences sur biopuces.

Extraction de protéines pour les analyses protéomiques espèces fongiques nécessite un niveau élevé de standardisation d'être accomplie selon le minimum d'informations sur une expérience de protéomique (MIAPE) des lignes directrices. Nous vous présentons une vidéo-protocole qui comprend une procédure pour minimiser les biais expérimentaux lors de l'induction de toxines et d'extraction de protéines à...

L&#39;induction ou à toxines et d&#39;extraction de protéines à partir Fusarium Spp. Cultures pour les études protéomiques

Croisements sexués et l'isolement de la descendance recombinante sont des outils de recherche importants pour le champignon...

Développement sexuel et la libération des ascospores dans Fusarium graminearum</em

Nous décrivons ici un protocole visant à déterminer les poids de fongiques pulmonaires chez les souris présentant l’aspergillose invasive par quantification de mis à jour le méthanamine coloration à l’argent de Gomori dans les coupes histologiques. Utilisation de cette méthode aboutit à des résultats comparables avec moins animaux par rapport à l’évaluation du fardeau fongique par PCR quantitative de l’ADN fongique de poumon.

Histologique Quantification pour déterminer la charge fongiques dans les poumons dans l’aspergillose expérimentale

Nous présentons ici un protocole pour analyser la croissance d’Aspergillus flavus et la production d’aflatoxine dans les grains de maïs exprimant une protéine antifongique.  En utilisant une souche exprimant le GFP a. flavus , nous avons suivi l’infection et la propagation du champignon dans les grains mûrs en temps réel. L’essai est rapide, fiable et reproductible.

Inhibition de la croissance d’Aspergillus flavus et la Production d’aflatoxine dans l’expression de maïs transgénique l’inhibiteur de le α-amylase de Lablab purpureus L.

Nous décrivons une méthode modifiée à base d’agar conçue pour quantifier les effets antifongiques des produits dérivés des plantes. Les contributions volatiles et non volatiles à l’activité antifongique peuvent être évaluées par ce protocole. En outre, l’efficacité contre les champignons peut être mesurée à des stades clés de développement dans une seule configuration expérimentale.

Mesure de l’activité antifongique volatile et non volatile des produits de lutte biologique

Nous présentons un protocole d’imagerie en direct sans étiquette utilisant des techniques de microscopie optique transmise pour capturer des images, analyser et quantifier la cinétique de croissance du champignon filamenteux A. nidulans dans les cultures submergées et les milieux solides. Ce protocole peut être utilisé en conjonction avec la microscopie à fluorescence.

Analyse quantitative du taux de croissance d’Aspergillus nidulans à l’aide de la microscopie en direct et d’un logiciel open source

Nous présentons ici un protocole basé sur le système d’appât du ver de farine (Tenebrio molitor) qui a été utilisé pour isoler et sélectionner les champignons entomopathogènes (EPF) à partir d’échantillons de sol. Une formule de nombre de conidies efficaces (ECN) est utilisée pour sélectionner un EPF à haute tolérance au stress en fonction des caractéristiques physiologiques de la lutte microbienne des ravageurs sur le terrain.

Isolement et sélection de champignons entomopathogènes à partir d’échantillons de sol et évaluation de la virulence fongique contre les insectes nuisibles

Ce protocole vise à fournir des procédures détaillées pour la collecte, la fixation et la conservation d’échantillons de plantes mycohétérotrophes, en appliquant différentes techniques de microscopie telles que la microscopie électronique à balayage et à transmission, la microscopie optique, confocale et à fluorescence pour étudier la colonisation fongique dans les tissus et les graines des plantes germées avec des champignons mycorhiziens.

Techniques de microscopie pour interpréter la colonisation fongique dans les tissus végétaux mycohétérotrophes et germination symbiotique des graines

Ce manuscrit détaille un protocole d’inoculation optimisé qui utilise des gaines de feuilles de maïs détachées pour des études cytologiques, physiologiques et moléculaires reproductibles des interactions du maïs avec les agents pathogènes fongiques des plantes. Les gaines foliaires facilitent l’observation en temps réel des interactions cellulaires entre la plante vivante et le champignon dans les tissus non fixés.

Gaines de maïs détachées pour l’imagerie de cellules vivantes d’une infection par des agents pathogènes fongiques foliaires du maïs

Découvrez la quantification de la colonisation fongique et des mycotoxines par bioassais sur noyaux. Cette méthode standardisée permet d'étudier les interactions graines-champignons et d'améliorer la protection des cultures céréalières.

Quantification de la colonisation fongique, sporogénèse, et la production de mycotoxines utilisant Bioassays noyau

Explorer plus de vidéos