Isolement de cellules basales et les cellules sous-muqueux du canal de la glande de la souris Trachée

L'objectif de cette méthode est d'isoler des cellules souches à partir des conduits des glandes sous-muqueuses de la trachée de souris afin d'étudier la réparation et la régénération. Premièrement, la trachée est disséquée à partir d'une souris euthanasiée. La trachée est nettoyée, coupée et digérée.

Ensuite, l'épithélium est décollé mécaniquement et soumis à une digestion supplémentaire afin d'obtenir une suspension monocellulaire. Les cellules sont alors marquées par immunomarquage, triées et finalement préparées pour être utilisées dans des tests in vivo et in vitro. En définitive, cette méthode peut aider à identifier les voies clés régulant les voies respiratoires, les cellules souches épithéliales, l'auto-renouvellement et la différenciation.

Ces techniques sont importantes car elles nous fournissent des modèles d'airway in vitro et ex vivo, ainsi que de réparation et de régénération épithéliale. Cela nous permet d'étudier la réparation normale des voies respiratoires ainsi que les maladies des voies respiratoires, telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique, la fibrose kystique et l'asthme. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous n'avons pas réussi à trouver des marqueurs spécifiques à la surface permettant d'isoler les cellules basales des cellules souches ductales, et nous avons donc décidé d'écarter l'épithélium de surface avec les cellules basales pour laisser derrière les cellules ductales. Démonstration des procédures de dissection trachéale.

Le prélèvement des cellules épithéliales des voies respiratoires, la création d'une suspension monocellulaire et le tri cellulaire seront réalisés par Heega. Un chercheur postdoctoral de mon laboratoire démontre les procédures de traitement des cellules triées dans des modèles in vitro et ex vivo ; il s'agit de Yes, notre gestionnaire de laboratoire. Commencez cette procédure en incisant la paroi abdominale d'une souris euthanasiée.

Déplacez les intestins sur le côté afin d'exposer l'aorte abdominale, puis effectuez la dissection. Ouvrez la cage thoracique en coupant le diaphragme et la paroi thoracique inférieure des deux côtés pour exposer le cœur et les poumons. Poursuivez la coupe vers le haut du cou, retirez la graisse et les glandes salivaires afin d'exposer la trachée à l’aide de ciseaux fins.

Retirer le thymus et détacher le poumon du tissu conjonctif situé en dessous et derrière celui-ci. Insérer ensuite la pince entre la trachée et l'œsophage pour les séparer. Couper la trachée à sa partie la plus haute, au-dessus de son raccordement avec le larynx.

Ensuite, maintenez la trachée avec la pince et disséquez-la de son point d'insertion. Poursuivez vers le bas pour l'extraire avec le cœur et le bloc pulmonaire ; sectionnez le cœur et les poumons près du hile afin d'inclure la majeure partie des bronches principales droite et gauche. Placez la trachée dans une petite boîte de Pétri contenant du milieu de collecte placée sur de la glace, sous le microscope stéréoscopique.

Utilisez une pince très fine de numéro cinq, un tube veineux et des ciseaux pour retirer tout tissu attaché à la trachée. Cela inclut les ganglions lymphatiques, la graisse du nerf laryngé récurrent, la glande thyroïde et les vaisseaux pulmonaires résiduels. La partie supérieure de la trachée nécessite une attention particulière afin de retirer les gros morceaux de cartilage laryngé sans compromettre le plus gros groupe de glandes sous-muqueuses logé entre le cartilage CRICO et le premier anneau cartilagineux trachéal C un.

Ensuite, sectionnez la trachée en une partie supérieure et une partie inférieure entre C4 et C5, puis effectuez une coupe. Ouvrez les deux parties par la lumière de la trachée. Transférez la partie inférieure de la trachée dans des tubes microcentrifugeurs de un millilitre et la partie supérieure de la trachée dans un tube conique de 15 millilitres pour la digestion enzymatique et la préparation de suspensions cellulaires uniques.

Dans la partie suivante de la procédure, les portions inférieure et supérieure de la trachée sont traitées pour générer des suspensions uniques de cellules. Bien qu'elles doivent être traitées simultanément ici, les deux méthodes seront démontrées de manière séquentielle. Pour traiter la partie inférieure de la trachée, ajoutez-la à un millilitre d'espace 16 unités dis dans un tube microcentrifuge, incubez à température ambiante pendant 30 minutes.

Ensuite, transférez la trachée dans un nouveau tube contenant 0,5 milligramme par millilitre d'ADN1 dans du DMM pendant 20 minutes supplémentaires à température ambiante après la digestion. À l’aide de pinces fines, transférez le tissu dans une boîte de Pétri stérile contenant un milieu de collecte frais. Puis, au microscope stéréoscopique, décollez l’épithélium de surface en tirant doucement sur les feuillets épithéliaux afin de les séparer de la membrane basale sous-jacente. Ensuite, utilisez une pipette pour transférer le milieu contenant l’épithélium décollé dans un tube conique de 50 millilitres et centrifugez à 1000 ×g à quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, retirez le SNAT et ajoutez de la trypsine-EDTA à 0,1 % ; incubez le tube dans un incubateur agité à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. À l’issue de l’incubation, utilisez une pipette munie d’une pointe de 1000 microlitres pour aspirer et expulser plusieurs fois afin de rompre les agrégats cellulaires et garantir la formation d’une suspension monocellulaire. Placez la partie supérieure de la trachée dans un tube conique contenant un millilitre de pronase à 0,15 %, puis incubez à quatre degrés Celsius pendant quatre heures. Transférez la partie inférieure de la trachée dans un tube micro-centrifuge de un millilitre contenant un millilitre de milieu renfermant 16 unités de discase.

Après l'incubation, vortexer doucement le tube, puis placer la trachée dans un milieu de collecte frais. Au microscope stéréo, vérifier le détachement complet de l'épithélium de surface. Utiliser de fines ciseaux pour hacher la trachée et ouvrir les compartiments des glandes sous-muqueuses.

Incuber pendant encore une heure dans de la pronase à 0,15 % à température ambiante avec agitation lente. Centrifuger le tissu trachéal après avoir retiré la pronase. Ajouter de la trypsine-EDTA à 0,1 % et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avec agitation.

Ensuite, filtrez les gros morceaux à l’aide d’un tamis de 70 microns. Puis rincez le tamis avec du milieu. Faites passer les agrégats cellulaires digérés et tous les morceaux résiduels de glandes à travers des aiguilles de 20, 23 et 26 gauge à l’aide d’une seringue de 10 millilitres.

Répétez l’emballage plusieurs fois avec chaque taille d’aiguille avant de passer à la suivante. À présent, la majorité des cellules devraient se trouver en suspension monocellulaire. Filtrez la suspension à travers un tamis de 40 microns, puis rincez le tamis avec du milieu et centrifugez les cellules.

Ensuite, reconstituez les cellules dans le volume approprié de milieu, comptez les cellules et procédez immédiatement au marquage par anticorps et au tri. Prélevez un nombre suffisant de cellules pour préparer les tubes de compensation non marqués et simplement marqués. Marquez ensuite le reste des cellules avec les anticorps primaires dirigés contre trop tube et I TGA six pendant 15 minutes à température ambiante. Après l'incubation, lavez avec du milieu PBS ou milieu de collecte, puis retirez très soigneusement le surnageant.

Disperser le culot cellulaire avec l'anticorps secondaire approprié. Incuber à l'abri de la lumière à température ambiante pendant 10 minutes. Puis laver et éliminer le surnageant, puis disperser le culot.

Les cellules peuvent désormais être triées par tri cellulaire activé par fluorescence. Une fois les cellules triées, elles peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes de réparation et de régénération afin de générer des cultures formant des sphéroïdes in vitro. Mélangez 100 microlitres de matri gel avec des facteurs de croissance réduits à 100 microlitres de milieu complet contenant jusqu'à 50 000 cellules triées.

Introduisez ce mélange dans la chambre supérieure d'une plaque transwell 24 puits. Dans la chambre inférieure, ajoutez 400 microlitres de milieu complet et incubez à 37 degrés Celsius. Renouvelez le milieu de la chambre inférieure tous les deux jours et ajoutez 100 microlitres supplémentaires de matrigel chaque semaine, ou plus tôt si celui-ci devient trop mince.

Les sphères se forment généralement après sept jours et peuvent être cultivées pendant plusieurs semaines ou repiquées de façon sérielle. Pour le modèle in vivo, resuspendre le culot de cellules triées dans du milieu complet mélangé au matri gel en proportion égale, à une concentration de 5 000 à 10 000 cellules par 50 microlitres. Après avoir anesthésié la souris C57BL/6 réceptrice, stériliser et raser son dos, puis la région supérieure du dos.

Effectuez une incision cutanée longitudinale médiane. Utilisez le côté contondant de la lame des ciseaux pour élargir les poches entre la peau et la paroi thoracique postérieure des deux côtés. Poussez la patte de la souris vers le haut et vers l'arrière afin de déplacer et d'identifier le bord médial de l'omoplate.

Ensuite, à l’aide d’une seringue à insuline de 300 microlitres, injecter 50 microlitres de la suspension cellulaire dans le bourrelet adipeux situé juste médialement à l’omoplate et latéralement par rapport aux vertèbres. Un bouton d’injection doit se former ; répéter l’injection de l’autre côté, puis clipser ou suturer l’incision cutanée après trois semaines. Ouvrir la peau de la souris euthanasiée comme précédemment et disséquer l’ensemble du bourrelet adipeux des deux côtés avec une marge de sécurité.

Pour éviter de manquer toute structure tissulaire ayant pu se former et s'étendre autour, fixez le bourrelet adipeux disséqué dans du PFA et incluez-le dans du paraffine afin d'éviter de contourner ou d'omettre des structures lors de la coupe du bloc. Ajustez de 40 microns une fois, puis effectuez une coupe de quatre microns.

Placez-le sur une lame de verre, puis examinez-le au microscope pour déterminer si des structures épithéliales sont présentes. S’il n’y a rien à voir, effectuez une nouvelle coupe et répétez cette étape. Le décapage de la trachée de souris tel que décrit dans cette vidéo entraînera une trachée dénudée, visible en microscopie optique comme illustré ici avec des trachées dénudées.

Après 30 minutes de digestion par la dispase, les tissus digérés sont montrés à gauche et les trachées dénudées. Après quatre heures de digestion par la pronase, les résultats sont montrés à droite. Après le retrait de l'épithélium, les glandes sous-muqueuses sont libérées des tissus et ressemblent à des grappes de raisin.

La suppression des cellules épithéliales de surface est indiquée par des flèches noires. La suppression des cellules des glandes sous-muqueuses et des canaux est indiquée par des flèches vertes. La cytométrie en flux des suspensions uniques de cellules doit montrer des graphiques de diffusion avant et de diffusion latérale tels qu'illustrés ici.

Bonne séparation des cellules ductales par rapport au reste. Si les cellules trachéales doivent être détectées avec l'anticorps Trop deux en cytométrie en flux pour le tri cellulaire activé par fluorescence, après environ une semaine en culture, des sphéroïdes devraient être visibles dans le matri gel et de type luminal lorsqu’ils proviennent de cellules basales, et de type din à l’aspect lorsqu’ils proviennent de cellules ductales. L'efficacité de ce processus est de l'ordre de 1 à 2 %, et des cellules isolées seront encore présentes dans le matrigel, probablement des cellules des canaux des glandes sous-muqueuses qui ne possèdent pas la capacité d'auto-renouvellement.

Les sphères basales sont plus grandes et présentent un aspect luminal. L'injection de cellules souches ductales dans la couche grasse de la souris entraîne la formation de structures semblables à des glandes sous-muqueuses, de forme sphérique et possédant une lumière centrale. Ces structures sont visibles dans les coupes, même sans coloration à l'hématoxyline et à l'éosine.

De nombreuses sections transversales doivent être réalisées à travers le bourrelet adipeux afin d'obtenir une section contenant ces structures épithéliales. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler une population de cellules souches à partir des cellules ductales de la glande subiacoïde, et une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 10 heures. Suite à cette procédure, les conditions de culture peuvent être modifiées afin de répondre à plusieurs questions différentes relatives à la formation de sphéroïdes et à la stimulation de facteurs de croissance régénératifs.