Name: Isolement de cellules basales et les cellules sous-muqueux du canal de la glande de la souris Trachée (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Découvrez l'isolement de cellules souches des canaux des glandes sous-muqueuses trachéales chez la souris. Cette méthode permet d'étudier la régénération épithéliale et les voies de renouvellement cellulaire in vivo.

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Nous tenons à remercier les grandes souches cellulaires FACS Centre de Recherche et surtout remercier Jessica Scholes et Felicia Codrea pour leur aide dans le tri cellulaire. Le travail a été financé par le CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, l&#39;American Thoracic Society / MPOC Fondation ATS-06-065, La Fondation Concern, UCLA Jonsson Le Comprehensive Cancer Center SPORE thoracique Cancer Oncology Program / poumon, le cancer de l&#39;Université de Californie coordination de la recherche et du Comité Gwynne Hazen cerise Memorial Laboratories (BG).

Aperçu des étapes 1. Dissection de la trachée 2. Nettoyage de la trachée et le couper 3. Digestion enzymatique et la transformation en suspension cellulaire unique 4. Coloration pour FACS et le tri 5. Le traitement de cellules triées in vivo et in vitro sur des modèles 1. Dissection de la trachée <ol><li> Euthanasier la souris avec une injection intrapéritonéale de 0,1 mg/0.2 cc de pentobarbital. </li><li> Couper la paroi abdominale, et déplacer l&#39;intestin vers le côté pour exposer l&#39;aorte abdominale et ensuite le disséquer. </li><li> Ouvrez le coffre en coupant à travers la membrane et la paroi thoracique antérieure des deux côtés pour exposer le cœur et les poumons. Continuer la découpe dans le col enlever les glandes salivaires gras et d&#39;exposer la trachée. </li><li> Retirer le thymus et couper le poumon de ses liens ci-dessous et derrière. Separmangé la trachée de l&#39;oesophage par l&#39;insertion d&#39;une pince entre eux puis couper la trachée, à sa partie supérieure la plus au-dessus de sa liaison avec le larynx. Ensuite, maintenez la trachée avec une pince et le disséquer de son attachement et de continuer vers le bas pour l&#39;enlever du cœur et des poumons en bloc. Découpez le coeur et les poumons à proximité du hile pour inclure la plupart des bronches droite et gauche principale. </li><li> Placez la trachée dans une petite boîte de Petri contenant la collecte moyenne sur la glace. </li></ol> 2. Nettoyage de la trachée et Cutting It <ol><li> Sous le microscope de dissection, utiliser une pince pointe très fine (n ° 5) et Vannas ciseaux Tübingen (FST 15003-08 finescience.com) pour nettoyer la trachée à partir de tous les autres tissus qui s&#39;y rattachent. Cela comprend: les ganglions lymphatiques, du nerf laryngé récurrent, la graisse, la glande thyroïde et des autres vaisseaux pulmonaires. La partie supérieure de la trachée nécessite une attention particulière, pour enlever les cartilages du larynx grands sans pour autant compromettre le plus grand groupe de SMGqui est logé entre le cartilage cricoïde et le premier anneau de la trachée cartilagineux (C1) 4. </li><li> Couper la trachée dans la partie supérieure et la partie inférieure entre C4 et C5, puis découpé les deux parties à travers la lumière de la trachée. </li></ol> 3. Digestion enzymatique et Transformation en suspension cellulaire unique (SCS) <ol><li> Incuber la partie inférieure de la trachée dans 1 ml de 16 dispase U dans un tube Eppendorf à température ambiante (RT) pendant 30 min, tel que décrit précédemment 5. Ajoutez ensuite 0,5 mg / ml de DNase I dans du DMEM pendant 20 minutes supplémentaires à température ambiante. </li><li> Retirez les trachées digérés dans le milieu de la collecte de frais dans une boîte de Pétri stérile, et de retirer l&#39;épithélium de surface sous la loupe binoculaire. Utiliser une pipette pour transférer le milieu contenant l&#39;épithélium dépouillés dans un tube conique de 50 ml. </li><li> Isoler l&#39;épithélium dénudé à 1000 xg à 4 ° C. Enlever le surnageant et ajouter 0,1% de trypsine / EDTA et incuber en agitant eTube électronique à un 37 ° C Incubateur agitateur (200 rpm) pendant 30 min. Après l&#39;incubation, avec une pointe de 1000 pi, pipeter de haut en bas pour briser les mottes et forment une suspension cellulaire unique. </li><li> Placer la trachée supérieure dans un tube conique contenant 1 ml de pronase 0,15%. Puis incuber à 4 ° C pendant 4 heures. </li><li> Vortexer doucement le tube, puis placer la trachée dans le milieu de collecte frais et confirmer sous le microscope de dissection qu&#39;il ya un complet détachement de l&#39;épithélium de surface (SE). </li><li> Hachez la trachée avec une paire de ciseaux fins d&#39;ouvrir les compartiments SMG puis incuber pendant une heure de plus dans la pronase à température ambiante sous agitation lente. </li><li> Isoler le tissu trachéal, retirez la pronase, ajouter 0,1% de trypsine / EDTA et incuber à 37 ° C pendant 30 min en agitant comme ci-dessus. </li><li> Passage des cellules digérées, des bouquets et des morceaux restants de glandes à travers des aiguilles 20G, 23G 26G et en utilisant une seringue de 10 ml. Répéter les passages fois plusieurs les uns avec les aiguilles avantdémissionner. Maintenant, la plupart des cellules doit être dans un SCS. </li><li> Filtrer la suspension à travers un filtre 40 uM puis laver le filtre et centrifuger les cellules. Puis reconstituer les cellules dans le volume approprié de milieu, compter les cellules et passer immédiatement à coloration FACS et le tri. Ne laissez pas les cellules à 4 ° C ou sur de la glace pendant plusieurs heures, car nous avons trouvé que cela affecte la viabilité et réduit considérablement la sphère constituant efficacité. </li></ol> 4. Coloration pour FACS et tri <ol><li> Prenez suffisamment de cellules pour préparer les tubes non colorées et unique compensation teinté puis colorer le reste des cellules avec des anticorps primaires, TROP2 chèvre et le rat ITGA6, pendant 15 min à température ambiante. Ensuite laver avec du PBS ou de collecte moyen, dissolvant le surnageant avec beaucoup de soin et de briser le culot cellulaire. </li><li> Colorer avec l&#39;anticorps secondaire approprié, incuber dans l&#39;obscurité à température ambiante pendant 10 minutes, laver et enlever le surnageant et le culot puis casser. </li><li> Sur le FACSARIA, après avoir réglé votre tension et de compensation, porte sur les débris, les cellules très petites, doublets cellulaires et les cellules mortes. Ensuite, la plupart des cellules en provenance du SE devrait être TROP2 positif, tandis que 20-50% des cellules SMG sera TROP2 + 6. </li><li> Réglez votre porte de tri pour TROP2 + + ITGA6 cellules du SE (cellules basales) et pour TROP2 + cellules (+ /-ITGA6 cellules positives) de SMG (cellules des canaux). </li></ol> 5. Traitement cellules triées pour: culture in vitro et in vivo dans le modèle de la 5.1 Dans la sphère vitro formant 5-9 culture <ol><li> Mélanger 100 ul de &quot;Facteur de croissance réduite Matrigel&quot; avec 100 ul de milieu complet 10,11 (voir tableau 1) contenant jusqu&#39;à 50.000 cellules triées puis mettre ce mélange dans la chambre supérieure de 24 et trans-même. Ensuite, mettre 400 ul de milieu complet dans la chambre inférieure et incuber à 37 ° C. Changer le milieu de la chambre basse tous les jours et ajouter supplément de 100 ul de Matrigelchaque semaine ou plus tôt si elle devient mince. </li></ol> 5.2 Dans le modèle in vivo <ol><li> Reconstituer la cellule triée culot dans du milieu complet mélange 1:1 avec matrigel à une concentration de 5.000-10.000 cellules par 50 pl. </li><li> Anesthésier les bénéficiaires C57/BL6 souris. Administrer carprofène (5 mg / kg) subcutaenously comme analgésique. Stériliser et raser le dos, puis faire une incision cutanée longitudinale centrale dans le haut du dos. L&#39;incision doit être assez grand pour identifier le site du coussinet adipeux par injection ainsi que la bulle qui se forme après l&#39;injection. Utilisez le côté non tranchant des ciseaux pour élargir poches entre la peau et l&#39;arrière de la paroi thoracique, des deux côtés afin de maximiser l&#39;accès et la visualisation. </li><li> Identifier le bord interne de l&#39;omoplate en appuyant sur la patte avant de la souris et en arrière pour voir le mouvement omoplate. Prenez 50 ul de la suspension cellulaire dans un 300 seringue d&#39;insuline BD ul et l&#39;injecter dans le coussinet adipeux juste en dedans de l&#39;omoplate et latéraleles vertèbres. Vous devriez être capable de voir une bulle, sinon vous êtes trop profonde. Répétez la même chose de l&#39;autre côté puis clip ou point de l&#39;incision cutanée. Vérifiez souris et donner carprofène (5 mg / kg, SC) une fois par jour pendant 48 h. </li><li> Après 3 semaines, euthanasier les souris avec pentobarbatol (0,1 mg/0.2 cc, IP), ouvrez la peau comme ci-dessus et de disséquer le pavé toute la graisse des deux côtés avec une marge de sécurité pour éviter de manquer une structure de tissu qui pourrait avoir été formé et étendu autour. Fixer en PFA et embed dans la paraffine 12. Un soin extrême doit être employée pendant le parage et le découpage du bloc de ne pas contourner ou d&#39;ignorer une structure. La meilleure pratique consiste à couper 40 pm une fois puis couper une tranche 4 pm, placez-le sur une lame de verre et l&#39;examiner au microscope afin de confirmer s&#39;il ya des «structures épithéliales» dans cette partie du bloc ou non. S&#39;il n&#39;y a rien vu, puis coupez une fois de plus et répétez cette étape. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Stripping des trachées de souris se traduira par une trachée dénudée qui est visible par microscopie optique comme indiqué sur la figure 1A. figure 1B montre la vue en fond clair d&#39;une trachée après épithéliale stripping avec glandes sous-muqueuses étant libérés par les tissus et les grappes qui ressemblent à des raisins. Pronase supprime l&#39;épitope ITGA6 et c&#39;est pourquoi les TROP2 cellules des canaux ne peuvent pas être séparés en ITGA6 + et - des populations. Cependant, la dispase, qui préserve l&#39;épitope ITGA6, digère tout l&#39;épithélium de surface et les cellules des canaux même avec des temps d&#39;incubation très courte, et ne peut donc pas être utilisé pour séparer conduit à partir des cellules basales 3. La cytométrie en flux des suspensions de cellules isolées doivent montrer en avant des diagrammes de dispersion dispersion et le côté qui sont représentés dans la figure 2A. Une bonne séparation des cellules du canal du reste, si les cellules trachéales doivent être considérés avec l&#39;anticorps TROP2 en cytométrie en flux pour cellules activées par fluorescence Sorting (FACS) comme on le voit sur ​​la figure 2B. Sphères doit être visible dans le matrigel après environ 1 semaine de culture et sont denses en apparence comme le montre la figure 3. L&#39;efficacité de ce processus est de l&#39;ordre de 1-2% et des cellules individuelles seront toujours présents dans le matrigel et représentent probablement les cellules des canaux des glandes sous-muqueuses qui ne possèdent pas la capacité d&#39;auto-renouvellement. L&#39;injection de cellules souches conduit à des résultats du coussinet adipeux de souris dans la formation de sous-muqueuse glandulaire comme des structures qui sont présentés Figure 4. Ceux-ci sont visibles dans les blocs de même sans coloration H &amp; E. Ceux-ci sont sphériques et possèdent une lumière centrale. Beaucoup de sections doivent être faits par l&#39;intermédiaire du coussinet adipeux afin de ne pas manquer ces structures épithéliales. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig1.jpg" /> Figure 1. Digestion enzymatique de l&#39;épithélium trachéal. Extraction des cellules épithéliales de surface est représenté avec blacflèches k, la suppression des cellules dans les conduits des glandes sous-muqueuses est indiqué par des flèches vertes. Trachées dénudées qui sont visibles au microscope optique sont présentés après 30 min de la digestion dispase et après 4 heures de digestion pronase. <img alt="Figure 2A" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2A.jpg" /> La figure 2A. I. La cytométrie en flux des suspensions cellulaires simples montrant représentant diffusion vers l&#39;avant et des diagrammes de dispersion secondaires de trachées de souris après décapage surface épithéliale. ii. Représentatifs des parcelles FACS pour TROP2 expression dans les cellules des canaux de trachées de souris. <img alt="Figure 2B" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2B.jpg" /> La figure 2B. I. La cytométrie en flux des suspensions de cellules isolées à partir de l&#39;épithélium de surface dénudée des deux tiers inférieurs de la trachée de souris montrant dispersion représentant l&#39;avant et des diagrammes de dispersion secondaires. ii. Typique parcelle FACS de l&#39;expression dans ITGA6 surface épithélium. iii. Un autre tracé représentatif FACS de l&#39;avant et la diffusion latérale de l&#39;épithélium de surface montrant retour déclenchement de la population cellulaire basale en vert. iv. ITGA6 typique et TROP2 population de cellules exprimant en vert. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig3.jpg" /> Figure 3. Évolution dans le temps de développement des sphères. A. sphères conduits. Sphères doit être visible dans le matrigel après environ 1 semaine dans la culture et la quasi-totalité sont denses en apparence. Les cellules individuelles qui ne font pas sphères sont également observées. (Échelle = 50 pm). B. sphères basales sont plus grandes et luminale en apparence. Les cellules individuelles qui ne font pas sphères sont également observées. (Échelle = 50 pm). <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig4.jpg" /> Figure 4. L&#39;injection de cellules souches conduit à des résultats du coussinet adipeux de souris dans la formation de sous-muqueux glande structures semblables. Structures représentativessont présentés dans le coussinet adipeux et certains sont présentés production de mucine (bleu clair) avec le bleu Alcian acide périodique Schiff tache.

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Cette technique conduit à isoler des cellules basales et des voies respiratoires est importante pour améliorer notre compréhension de la réparation des voies respiratoires et de la régénération et de maladies des voies respiratoires. Les techniques décrites ici sont quelques critiques. La première est la période de digestion enzymatique optimisé. Le second est la création d&#39;une suspension cellulaire unique à travers passage en série avec des aiguilles de jauge progressivement plus élevés pour éviter cisaillement cel...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Milieu complet 10: DMEM-F-12, 50/50, 1X) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090 CV- </td></tr><tr><td> Hepes (15 mM) </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr><tr><td> Le bicarbonate de sodium (3,6 mm ou 0,03%) </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-glutamine (4 mM) </td><td> Mediatech </td><td> 25-005 Cl- </td></tr><tr><td> Pénicilline (100 U / ml) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-CI </td></tr><tr><td> Streptomycine (100 ug / m) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-CI </td></tr><tr><td> L&#39;amphotéricine B (0,25 pg / ml) </td><td> Lonza </td><td> 17-836R </td></tr><tr><td> EnSulin (10 pg / ml) </td><td> Sigma </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Transferrine (5 ug / ml) </td><td> Sigma </td><td> T1147 </td></tr><tr><td> La toxine du choléra (0,1 pg / ml) </td><td> Sigma </td><td> C8052 </td></tr><tr><td> Le facteur de croissance épidermique (25 ng / ml) </td><td> BD </td><td> 354001 </td></tr><tr><td> Extrait pituitaire bovin (30 pg / ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 13028-014 </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal (5%) </td><td> Pêcheur </td><td> SH3008803HI </td></tr><tr><td> L&#39;acide rétinoïque (0,05 uM) </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> Facteur de croissance réduit Matrigel </td><td> BD </td><td> 354230 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Remplissez composantes médias. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td&gt; <td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> Roche </td><td> 10165921001 </td><td> Utilisé à 0,15%: -O / n à 4 ° C pour isoler la digestion nombre total de cellules trachéales (pour la culture ALI) -4 Digestion h 4 ° C pour isoler SMG </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> BD Biosciences </td><td> 354235 </td><td> Utilisé à 16 unités: 30 min à température ambiante </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td><td> Utilisé à raison de 0,5 mg / ml: 20-30 min à température ambiante </td></tr></tbody></table> Les enzymes du tableau 2. Utilisée pour la digestion enzymatique de la trachée.

isolement de cellules basales et les cellules sous-muqueux du canal de la glande de la souris trachée

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Les grandes voies aériennes sont directement en contact avec l&#39;environnement et donc vulnérables aux blessures des toxines et des agents infectieux qui nous souffle dans 1. Les grandes voies aériennes exigent donc un mécanisme de réparation efficace pour protéger nos corps. Ce processus de réparation se produit à partir de cellules souches dans les voies respiratoires et d&#39;isoler ces cellules souches à partir des voies respiratoires est importante pour comprendre les mécanismes de réparation et de régénération. Il est également important pour la compréhension de réparation anormale qui peut conduire à des maladies des voies respiratoires 2. Le but de cette méthode est d&#39;isoler une population de cellules souches roman de la souris conduits des glandes sous-muqueuses trachéales et de placer ces cellules in vitro et dans des modèles in vivo pour identifier les mécanismes de réparation et de régénération des glandes sous-muqueuses 3. Cette production présente des méthodes qui peuvent être utilisées pour isoler et doser les cellules souches conduit et de la base de la grande voies respiratoires 3. Cela nous permettrapour étudier les maladies des voies respiratoires, comme la fibrose kystique, l&#39;asthme et la bronchopneumopathie chronique obstructive. À l&#39;heure actuelle, il n&#39;existe pas de méthodes d&#39;isolement des cellules des glandes sous-muqueuses conduit et il n&#39;y a pas de modèles in vivo pour étudier la régénération des glandes sous-muqueuses.

Ici, nous démontrons notre protocole pour l&#39;isolement de cellules basales et sous-muqueuse du canal de la glande trachées de souris. Nous démontrons également la méthode de l&#39;injection de cellules souches dans le coussinet adipeux de souris dorsale de créer un<em&gt; In vivo</em&gt; Modèle de régénération glande sous-muqueuse.

Isolement de cellules basales et les cellules sous-muqueux du canal de la glande de la souris Trachée

Les voies respiratoires supérieures sont en contact direct avec l'environnement et sont donc susceptibles d'être endommagées par les toxines et les agents infectieux que nous respirons 1. ...

L'objectif de cette méthode est d'isoler des cellules souches à partir des conduits des glandes sous-muqueuses de la trachée de souris afin d'étudier la réparation et la régénération. Premièrement, la trachée est disséquée à partir d'une souris euthanasiée. La trachée est nettoyée, coupée et digérée.Ensuite, l'épithélium est décollé mécaniquement et soumis à une digestion supplémentaire afin d'obtenir une suspension monocellulaire. Les cellules sont alors marquées par immunomarquage, triées et finalement préparées pour être utilisées dans des tests in vivo et in vitro. En définitive, cette méthode peut aider à identifier les voies clés régulant les voies respiratoires, les cellules souches épithéliales, l'auto-renouvellement et la différenciation.Ces techniques sont importantes car elles nous fournissent des modèles d'airway in vitro et ex vivo, ainsi que de réparation et de régénération épithéliale. Cela nous permet d'étudier la réparation normale des voies respiratoires ainsi que les maladies des voies respiratoires, telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique, la fibrose kystique et l'asthme. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous n'avons pas réussi à trouver des marqueurs spécifiques à la surface permettant d'isoler les cellules basales des cellules souches ductales, et nous avons donc décidé d'écarter l'épithélium de surface avec les cellules basales pour laisser derrière les cellules ductales. Démonstration des procédures de dissection trachéale.Le prélèvement des cellules épithéliales des voies respiratoires, la création d'une suspension monocellulaire et le tri cellulaire seront réalisés par Heega. Un chercheur postdoctoral de mon laboratoire démontre les procédures de traitement des cellules triées dans des modèles in vitro et ex vivo ; il s'agit de Yes, notre gestionnaire de laboratoire. Commencez cette procédure en incisant la paroi abdominale d'une souris euthanasiée.Déplacez les intestins sur le côté afin d'exposer l'aorte abdominale, puis effectuez la dissection. Ouvrez la cage thoracique en coupant le diaphragme et la paroi thoracique inférieure des deux côtés pour exposer le cœur et les poumons. Poursuivez la coupe vers le haut du cou, retirez la graisse et les glandes salivaires afin d'exposer la trachée à l’aide de ciseaux fins.Retirer le thymus et détacher le poumon du tissu conjonctif situé en dessous et derrière celui-ci. Insérer ensuite la pince entre la trachée et l'œsophage pour les séparer. Couper la trachée à sa partie la plus haute, au-dessus de son raccordement avec le larynx.Ensuite, maintenez la trachée avec la pince et disséquez-la de son point d'insertion. Poursuivez vers le bas pour l'extraire avec le cœur et le bloc pulmonaire ; sectionnez le cœur et les poumons près du hile afin d'inclure la majeure partie des bronches principales droite et gauche. Placez la trachée dans une petite boîte de Pétri contenant du milieu de collecte placée sur de la glace, sous le microscope stéréoscopique.Utilisez une pince très fine de numéro cinq, un tube veineux et des ciseaux pour retirer tout tissu attaché à la trachée. Cela inclut les ganglions lymphatiques, la graisse du nerf laryngé récurrent, la glande thyroïde et les vaisseaux pulmonaires résiduels. La partie supérieure de la trachée nécessite une attention particulière afin de retirer les gros morceaux de cartilage laryngé sans compromettre le plus gros groupe de glandes sous-muqueuses logé entre le cartilage CRICO et le premier anneau cartilagineux trachéal C un.Ensuite, sectionnez la trachée en une partie supérieure et une partie inférieure entre C4 et C5, puis effectuez une coupe. Ouvrez les deux parties par la lumière de la trachée. Transférez la partie inférieure de la trachée dans des tubes microcentrifugeurs de un millilitre et la partie supérieure de la trachée dans un tube conique de 15 millilitres pour la digestion enzymatique et la préparation de suspensions cellulaires uniques.Dans la partie suivante de la procédure, les portions inférieure et supérieure de la trachée sont traitées pour générer des suspensions uniques de cellules. Bien qu'elles doivent être traitées simultanément ici, les deux méthodes seront démontrées de manière séquentielle. Pour traiter la partie inférieure de la trachée, ajoutez-la à un millilitre d'espace 16 unités dis dans un tube microcentrifuge, incubez à température ambiante pendant 30 minutes.Ensuite, transférez la trachée dans un nouveau tube contenant 0,5 milligramme par millilitre d'ADN1 dans du DMM pendant 20 minutes supplémentaires à température ambiante après la digestion. À l’aide de pinces fines, transférez le tissu dans une boîte de Pétri stérile contenant un milieu de collecte frais. Puis, au microscope stéréoscopique, décollez l’épithélium de surface en tirant doucement sur les feuillets épithéliaux afin de les séparer de la membrane basale sous-jacente. Ensuite, utilisez une pipette pour transférer le milieu contenant l’épithélium décollé dans un tube conique de 50 millilitres et centrifugez à 1000 ×g à quatre degrés Celsius.Après la centrifugation, retirez le SNAT et ajoutez de la trypsine-EDTA à 0,1 % ; incubez le tube dans un incubateur agité à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. À l’issue de l’incubation, utilisez une pipette munie d’une pointe de 1000 microlitres pour aspirer et expulser plusieurs fois afin de rompre les agrégats cellulaires et garantir la formation d’une suspension monocellulaire. Placez la partie supérieure de la trachée dans un tube conique contenant un millilitre de pronase à 0,15 %, puis incubez à quatre degrés Celsius pendant quatre heures. Transférez la partie inférieure de la trachée dans un tube micro-centrifuge de un millilitre contenant un millilitre de milieu renfermant 16 unités de discase.Après l'incubation, vortexer doucement le tube, puis placer la trachée dans un milieu de collecte frais. Au microscope stéréo, vérifier le détachement complet de l'épithélium de surface. Utiliser de fines ciseaux pour hacher la trachée et ouvrir les compartiments des glandes sous-muqueuses.Incuber pendant encore une heure dans de la pronase à 0,15 % à température ambiante avec agitation lente. Centrifuger le tissu trachéal après avoir retiré la pronase. Ajouter de la trypsine-EDTA à 0,1 % et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avec agitation.Ensuite, filtrez les gros morceaux à l’aide d’un tamis de 70 microns. Puis rincez le tamis avec du milieu. Faites passer les agrégats cellulaires digérés et tous les morceaux résiduels de glandes à travers des aiguilles de 20, 23 et 26 gauge à l’aide d’une seringue de 10 millilitres.Répétez l’emballage plusieurs fois avec chaque taille d’aiguille avant de passer à la suivante. À présent, la majorité des cellules devraient se trouver en suspension monocellulaire. Filtrez la suspension à travers un tamis de 40 microns, puis rincez le tamis avec du milieu et centrifugez les cellules.Ensuite, reconstituez les cellules dans le volume approprié de milieu, comptez les cellules et procédez immédiatement au marquage par anticorps et au tri. Prélevez un nombre suffisant de cellules pour préparer les tubes de compensation non marqués et simplement marqués. Marquez ensuite le reste des cellules avec les anticorps primaires dirigés contre trop tube et I TGA six pendant 15 minutes à température ambiante. Après l'incubation, lavez avec du milieu PBS ou milieu de collecte, puis retirez très soigneusement le surnageant.Disperser le culot cellulaire avec l'anticorps secondaire approprié. Incuber à l'abri de la lumière à température ambiante pendant 10 minutes. Puis laver et éliminer le surnageant, puis disperser le culot.Les cellules peuvent désormais être triées par tri cellulaire activé par fluorescence. Une fois les cellules triées, elles peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes de réparation et de régénération afin de générer des cultures formant des sphéroïdes in vitro. Mélangez 100 microlitres de matri gel avec des facteurs de croissance réduits à 100 microlitres de milieu complet contenant jusqu'à 50 000 cellules triées.Introduisez ce mélange dans la chambre supérieure d'une plaque transwell 24 puits. Dans la chambre inférieure, ajoutez 400 microlitres de milieu complet et incubez à 37 degrés Celsius. Renouvelez le milieu de la chambre inférieure tous les deux jours et ajoutez 100 microlitres supplémentaires de matrigel chaque semaine, ou plus tôt si celui-ci devient trop mince.Les sphères se forment généralement après sept jours et peuvent être cultivées pendant plusieurs semaines ou repiquées de façon sérielle. Pour le modèle in vivo, resuspendre le culot de cellules triées dans du milieu complet mélangé au matri gel en proportion égale, à une concentration de 5 000 à 10 000 cellules par 50 microlitres. Après avoir anesthésié la souris C57BL/6 réceptrice, stériliser et raser son dos, puis la région supérieure du dos.Effectuez une incision cutanée longitudinale médiane. Utilisez le côté contondant de la lame des ciseaux pour élargir les poches entre la peau et la paroi thoracique postérieure des deux côtés. Poussez la patte de la souris vers le haut et vers l'arrière afin de déplacer et d'identifier le bord médial de l'omoplate.Ensuite, à l’aide d’une seringue à insuline de 300 microlitres, injecter 50 microlitres de la suspension cellulaire dans le bourrelet adipeux situé juste médialement à l’omoplate et latéralement par rapport aux vertèbres. Un bouton d’injection doit se former ; répéter l’injection de l’autre côté, puis clipser ou suturer l’incision cutanée après trois semaines. Ouvrir la peau de la souris euthanasiée comme précédemment et disséquer l’ensemble du bourrelet adipeux des deux côtés avec une marge de sécurité.Pour éviter de manquer toute structure tissulaire ayant pu se former et s'étendre autour, fixez le bourrelet adipeux disséqué dans du PFA et incluez-le dans du paraffine afin d'éviter de contourner ou d'omettre des structures lors de la coupe du bloc. Ajustez de 40 microns une fois, puis effectuez une coupe de quatre microns.Placez-le sur une lame de verre, puis examinez-le au microscope pour déterminer si des structures épithéliales sont présentes. S’il n’y a rien à voir, effectuez une nouvelle coupe et répétez cette étape. Le décapage de la trachée de souris tel que décrit dans cette vidéo entraînera une trachée dénudée, visible en microscopie optique comme illustré ici avec des trachées dénudées.Après 30 minutes de digestion par la dispase, les tissus digérés sont montrés à gauche et les trachées dénudées. Après quatre heures de digestion par la pronase, les résultats sont montrés à droite. Après le retrait de l'épithélium, les glandes sous-muqueuses sont libérées des tissus et ressemblent à des grappes de raisin.La suppression des cellules épithéliales de surface est indiquée par des flèches noires. La suppression des cellules des glandes sous-muqueuses et des canaux est indiquée par des flèches vertes. La cytométrie en flux des suspensions uniques de cellules doit montrer des graphiques de diffusion avant et de diffusion latérale tels qu'illustrés ici.Bonne séparation des cellules ductales par rapport au reste. Si les cellules trachéales doivent être détectées avec l'anticorps Trop deux en cytométrie en flux pour le tri cellulaire activé par fluorescence, après environ une semaine en culture, des sphéroïdes devraient être visibles dans le matri gel et de type luminal lorsqu’ils proviennent de cellules basales, et de type din à l’aspect lorsqu’ils proviennent de cellules ductales. L'efficacité de ce processus est de l'ordre de 1 à 2 %, et des cellules isolées seront encore présentes dans le matrigel, probablement des cellules des canaux des glandes sous-muqueuses qui ne possèdent pas la capacité d'auto-renouvellement.Les sphères basales sont plus grandes et présentent un aspect luminal. L'injection de cellules souches ductales dans la couche grasse de la souris entraîne la formation de structures semblables à des glandes sous-muqueuses, de forme sphérique et possédant une lumière centrale. Ces structures sont visibles dans les coupes, même sans coloration à l'hématoxyline et à l'éosine.De nombreuses sections transversales doivent être réalisées à travers le bourrelet adipeux afin d'obtenir une section contenant ces structures épithéliales. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler une population de cellules souches à partir des cellules ductales de la glande subiacoïde, et une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 10 heures. Suite à cette procédure, les conditions de culture peuvent être modifiées afin de répondre à plusieurs questions différentes relatives à la formation de sphéroïdes et à la stimulation de facteurs de croissance régénératifs.

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