Name: La dissection de souris adultes et utricule adénovirus-support cellulaire des infections (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Découvrez la dissection de l'utricule de souris adulte et l'infection des cellules de soutien par adénovirus. Cette méthode permet d'étudier la biologie des cellules ciliées et la régénération auditive in vitro.

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Ce travail a été soutenu par la Division de la recherche intra-muros à l&#39;Institut national sur la surdité et les troubles de communication. Un soutien supplémentaire a été fourni par NIDCD 5R01 DC007613.

1. Dissection utricule et de la Culture <ol><li> Euthanasier un adulte (âge de 4 semaines ou plus) de la souris en utilisant un protocole approuvé et décapiter. </li><li> Snip le conduit auditif externe sur les deux côtés de la tête et tirer la peau vers l&#39;avant en direction du nez. Bissecter la tête d&#39;arrière en avant et retirez le cerveau des deux côtés de révéler le labyrinthe osseux. </li><li> Coupez le crâne loin de la cochlée osseuse et à transférer le labyrinthe osseux (y compris la bulle) pour une hotte de culture de tissus équipé d&#39;un microscope à dissection (Remarque: le travail adénovirus doit être effectuée dans un cabinet de classe II de la sécurité biologique). </li><li> Dans la hotte, le transfert de chaque cochlée à une boîte de culture de tissu de 35 mm contenant milieux stériles dissection (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (figure 1A). </li><li> Si la bulle auditive est encore intact (il est possible d&#39;enlever la bulle lors de la dissection brute en insérant votre vignette entre la bulle et le sommet dela cochlée), utilisez deux pinces (un n ° 3 et un n ° 5) à briser la bulle (figure 1B). </li><li> Identifier les points de repère de la préparation osseuse cochlée: osselets faîtières, de base, et de forme ovale et ronde, les fenêtres de la racine nerveuse, les canaux semi-circulaires VIIIe (figure 1 C, D). </li><li> Placez l&#39;oreille interne dans le plat avec le côté interne vers le haut, de telle sorte que l&#39;ovale et ronde et le sommet sont des fenêtres sur le fond du plat et la racine du nerf VIIIème vers le haut. Maintenez la préparation à l&#39;aide un # 3 pince dans la région des canaux semi-circulaires (figure 1D). </li><li> Avec un scalpel équipé d&#39;une lame n ° 11, couper le sommet de la cochlée juste apicale de la racine nerveuse (figure 1D). </li><li> Activer la préparation de sorte que la partie découpée est tournée vers le haut. Utilisez le canal semi-circulaire antérieure comme une poignée pour stabiliser la préparation (figure 1E). </li><li> En utilisant une pince n ° 5, retirez la cochlée aux modiolus basà la base. Au point où la région crochet de la cochlée tourne vers le bas, utilisez une sonde fine (la moitié d&#39;un cassées # 55 forceps) de lever la dernière tablette osseuse de la lame spirale osseuse (figure 1F), révélant le saccule. Juste en dessous du saccule est la platine de l&#39;étrier, qui est une étape importante. Le utricule est immédiatement adjacente à la platine de l&#39;étrier (figure 1G), et il est entouré par de l&#39;os. Utilisez la sonde pour ébrécher l&#39;os loin suffisant pour révéler au sujet de 1/3 de l&#39;utricule. Retirez soigneusement l&#39;utricule en utilisant une pince N ° 55 (Figure 1H). Cette procédure se traduira généralement en retrait de l&#39;épithélium pigmenté de toit que l&#39;utricule est tiré de la préparation osseuse. Toutefois, si l&#39;utricule est enlevée avec de l&#39;épithélium toit intact, le toit peut être enlevé en utilisant une pince N ° 55. </li><li> Utricules de l&#39;infection à adénovirus (ou des expériences d&#39;imagerie vivantes) doivent avoir le otoconia enlevé lors de la dissection (avant l&#39;infection).Dans ce cas, utiliser une seringue luer-lock qui est rempli avec les médias de dissection et munie d&#39;une aiguille de petit calibre (généralement 26-28 gauge). Maintenez l&#39;utricule au bord en utilisant une pince N ° 55 (Figure 1I). Apportez la pointe de l&#39;aiguille à proximité de l&#39;utricule avec le biseau de l&#39;aiguille pointant vers le bas. Utiliser un jet de disséquer les médias pour souffler la otoconia (Figure 1J). Alternativement, otoconia peut être éliminé par les brossant à l&#39;aide d&#39;un outil de cil (Ted Pella, Inc # 113). Utricules qui ne vont pas se soumettre à une infection adénovirale sont normalement cultivées flottant librement dans des plaques 24 puits de culture de tissus intacts à l&#39;otoconia (voir ci-dessous pour le post-fix retrait otoconia, qui est plus facile). </li><li> Une fois tous les utricules sont disséqués, changer les médias de dissection à la culture stérile des médias: DMEM F12 (Gibco # 11320) supplémenté avec 5% de FBS et 50 U / ml de pénicilline G (Sigma). </li><li> Utricules sont cultivées à 37 ° C et 5% de CO 2. Si les cultures doivent être maintaminé pendant plus de 48 heures, la moitié des milieux de culture doivent être changés tous les jours. Les cultures peuvent être maintenues pendant une semaine ou plus. </li></ol> 2. Infection par un adénovirus de cellules de soutien Important: Travailler avec l&#39;adénovirus exige de niveau de biosécurité 2 (BSL2) les procédures et de certification. Vérifiez auprès de votre Agent de biosécurité institutionnelle d&#39;orientation et de formation sur les procédures BSL2. <ol><li> Disséquer utricules comme ci-dessus dans les médias de dissection (pas de sérum). Retirer otoconia comme ci-dessus. </li><li> Lorsque vous êtes prêt à infecter, transférer 1 utricule (cellules ciliées le haut) dans chaque puits d&#39;une mini-bac Nunc (Fisher # 12-565-68) contenant 15 uL DMEM sans sérum F12 (ce qui est important, car le sérum peut inactiver le virus) . Ce transfert est plus facile avec un microcurette 1,5 mm (# 10082-15 à partir des outils des sciences Beaux). </li><li> Notre Ad-GFP est de sérotype 5 avec les gènes viraux E1 et E3 supprimées et le promoteur du CMV humain de conduire l&#39;transgène (GFP). Ce virus a été obtenue à partir Vecteur BioLabs (Philadelphie, PA <a href="http://www.vectorbiolabs.com/">vectorbiolabs.com</a> ). Virus images sont fournies à des titres de 1,0 à 4,0 × 10 10 PFU / ml. Ajouter 0,5 à 2 pi de stock de virus à chaque puits contenant un utricule (Figure 1L). Le montant réel utilisé varie en fonction du titre du virus et le bouillon. Nous avons l&#39;habitude d&#39;infecter chaque utricule avec de 1,0 à 4,0 × 10 7 UFP. </li><li> Culture des utricules contenant le virus dans les médias à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant 2 heures. Après 2 heures, transférer les utricules revenir à la plaque de 24 puits de culture de tissu contenant des milieux de culture avec du sérum. Culture des utricules nuit à 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Utricules peut être utilisé le lendemain pour des expériences d&#39;imagerie en direct, ou ils peuvent être fixés pour l&#39;immunochimie des cellules ciliées (voir ci-dessous). Virale augmente l&#39;expression du transgène dans le temps, si l&#39;expression du transgène est faible à 24 heures post-infection, il peutbénéfique pour les cellules en culture pendant 24 heures supplémentaires dans le sérum contenant les médias. Si vous voyez la toxicité cellulaire des cheveux, de réduire la quantité de virus utilisée. </li></ol> 3. Fixation utricule, enlèvement otoconia, et d&#39;immunochimie <ol><li> À la fin de la période de culture, fixer utricules dans du paraformaldéhyde 4% pour soit 3 heures à température ambiante (sur une plate-forme à bascule) ou une nuit à 4 ° C. Utricules de lavage (3 fois, 15 min chacune) dans 0,1 M (1X) pH Sorensen tampon phosphate 7,4. Ces étapes sont réalisées dans une plaque de 24 puits de culture de tissu. </li><li> Retrait otoconia: Remarque: otoconia doivent être retirés avant l&#39;infection adénovirus (voir l&#39;étape 1.11 ci-dessus). Cependant, utricules qui ne sont pas à être infecté peut être mis en culture et fixé à la otoconies intacte. Dans ce cas, utilisez les étapes décrites ici pour supprimer le otoconia après fixation. Inspectez utricules pour toute l&#39;épithélium pigmenté de toit restante. Retirez soigneusement tout épithélium toit restante en utilisant deux N ° 55 forceps. Pour retirer le otoconia, remplacer un tampon phosphate de Sorensen avec 750-1000 ul Cal-Ex détartrant (Fisher # CS510-1D). Laissez Cal-Ex sur utricules pendant 1 minute et 40 secondes (ne pas dépasser 2 minutes). Remplacer Cal-Ex avec un tampon phosphate 0,1 M Sorensen et de lavage (5 fois, 5 minutes chacun). </li><li> Incuber utricules dans le borohydrure de sodium (Sigma # 452882, 1% dans de l&#39;eau déminéralisée) pendant 10 minutes. Laver utricules dans un tampon phosphate 0,1 M Sorensen (5 fois, 5 minutes chacun). </li><li> Utricules Placer dans la Blocking Solution (PBS + 2% de sérum albumine bovine + 0,8% sérum de chèvre normal + 0,4% de Triton X-100) pendant 3 heures à température ambiante sur une plate-forme à bascule. </li><li> Ajouter des anticorps primaires et incuber une nuit à 4 ° C. Anti-myosine 7a (soit Proteus Biosciences # 25-6790 ou # MYO7A 138-1 du développement de la Banque études hybridome) au 1:100 dans le blocage de toutes les étiquettes solution cellules ciliées. Pour marquer séparément les cellules ciliées et non-striolar striolar, nous avons utilisé un Protoco double-étiquettel avec un anticorps monoclonal anti-calmoduline (Sigma # C 3545; 1:150) et polyclonaux anti-calbindin (Chemicon # AB1778, Temecula, Californie, Etats-Unis; 1:200). Anticorps secondaire (généralement Alexa Fluor anticorps secondaires conjugués de Invitrogen, Carlsbad, CA, Etats-Unis) sont dilués à 1:500 dans une solution de blocage et incubées pendant 4 heures dans l&#39;obscurité, à température ambiante sur une plate-forme à bascule. </li><li> Utricules montage sur lames de verre en utilisant Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, États-Unis). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Utricules cultivés en utilisant cette méthode conserver la totalité des compléments de cellules ciliées et les deux cellules de soutien (Figure 2). Les cellules ciliées dans les cultures en bonne santé montrent rondes profils nucléaires entourées par de minces régions cytoplasmiques qui sont myosine 7a-positif (figure 2, panneau supérieur). Cellules de soutien (étiqueté anti-Sox2) sont plus petits et plus dense que les cellules ciliées (Figure 2, panneau inférieur). Adenovirus infecte 25-50% des cellules de soutien dans l&#39;utricule, et aucun des cellules ciliées sont infectées (figure 2, Ad-GFP panneaux). Il convient de noter que le titre de travail optimal de chaque adénovirus doit être déterminé de manière empirique, depuis la mort de cellules ciliées est possible si le titre viral est trop élevé. En outre, les régions de dommages mécaniques (causé lors de la dissection) aura de grandes quantités de virus. Ces régions de dommages mécaniques sont faciles à distinguer par une ligne continue de cellules avec des niveaux très élevés d&#39;expression de la GFP et les cellules ciliées manquantes. Ceci est en contraste à l&#39;expression de la GFP dans les cellules de soutien dispersée d&#39;une culture en bon état ​​(Figure 2). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Utricule dissection. A: C La bulle est brisée par deux pinces robustes:. Auditif bulle (AB) B. Bony cochlée (RW = fenêtre ronde, S =. artère stapédienne, C = cochlée, ST = étrier) D: Une lame de scalpel (SB) est utilisé pour couper l&#39;apex de la cochlée apicale du nerf crânien VIII (8 N e) ASC = canal semi-circulaire antérieure E..: la préparation est maintenu fermement à l&#39;aide d&#39;une pince # 3 avec une fourche inséré dans le canal antérieure semi-circulaire (ASC) et l&#39;autre sur l&#39;os extérieur (flèches). Le labyrinthe membraneux est retiré avec une pince F:. Avec le labyrinthe membraneux enlevé, le tour basal de la lame spirale osseuse est visible près de la région du crochet. Une sonde fine est insérée sous ce plateau osseux pour soulever le plateau et retirez-le (la flèche) G:. Après élimination du saccule, utricule (U) est visible immédiatement adjacente à la platine de l&#39;étrier (SF) H:. Utricule (U ) est éliminée en utilisant une pince # 55 (flèche) SF = étrier platine I:.. utricule avec otoconia (O), partiellement éliminé und sensoriels épithélium (SE) au-dessous visibles J:. otoconia (O) sont retirés de la utricule l&#39;aide d&#39;un flux de média rendu par une seringue munie d&#39;une aiguille de calibre 26. L&#39;ombre de l&#39;aiguille (S) est visible au bas de l&#39;image K:. Utricule avec otoconies enlevé et épithélium sensoriel (SE) visibles L:. Infection adénoviral: chaque utricule (U) est placé dans un puits individuel d&#39;un mini- -bac. Cellules de soutien sont infectées par l&#39;adénovirus par pipetage virus dans le puits (P = pointe de la pipette). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Adénovirus infection de cellules de soutien. Utricules ont été infectées par l&#39;adénovirus expression motrice de la protéine fluorescente verte (GFP-annonce). Affichés sont des images confocales de la couche de cellules ciliées, et la couche de cellules de support dans la même zone d&#39;un utricule. Les cellules ciliées sont marquées avec un anticorps contre la myosine 7a(Magenta). Cellules de soutien sont marquées avec un anticorps contre Sox2 (rouge). Le schéma suivant montre la structure de l&#39;épithélium sensoriel utricule et les emplacements des cellules ciliées (HC) et les cellules de soutien (SC). Emplacements des confocal (optique) sections indiquées dans la partie supérieure (U) et inférieure (L) des panneaux sont indiqués par des lignes en pointillés dans le schéma. Panneaux supérieurs: En images confocales prises au niveau des noyaux des cellules des cheveux, Ad-GFP signal apparaît dans les espaces entre les cellules ciliées et ne se chevauchent pas avec le 7a cellules ciliées myosine marqueur. Des panneaux inférieurs: Dans les sections confocales au niveau des noyaux cellulaires de support, Ad-GFP signal de colocalisée avec le marqueur de cellules de support Sox-2. L&#39;infection Ad-GFP dans l&#39;expression de la GFP dans des cellules de soutien seulement, et pas les cellules ciliées sont infectés. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Infection adénovirale n&#39;entraîne pas la mort des cellules ciliées ou des cellules de soutien. Utricles ont été infectées avec Ad-GFP à 4 × 10 8 UFP / ml. Utricules ont été marqués avec des anticorps contre la myosine 7a (marqueur des cellules de cheveux) et Sox2 (soutien marqueur de cellule). Des cellules ciliées et numération des cellules de soutien étaient égaux pour utricules de contrôle et Ad-GFP utricules infectés.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Cellules ciliées sensorielles sont sensibles à la mort causée par une variété de stress, notamment le vieillissement, traumatisme sonore, et l&#39;exposition à des médicaments ototoxiques, y compris les antibiotiques aminoglycosides et le cisplatine agent antinéoplasique. Dans les résultats mammifères cheveux de la mort cellulaire dans la perte d&#39;audition permanente et / ou perturbation de l&#39;équilibre. Dans les systèmes de modèle in vitro sont des outils essentiels pour les études visant à déte...

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Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Réactif</strong</td&gt;<td<strong&gt; Société</strong</td&gt;<td<strongLe numéro de catalogue&gt;</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdMedium&gt; 199</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 12350</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM/F12</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11320</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Beaux-pince (# 55)</td&gt;<td&gt; Outils belle science</td&gt;<td&gt; 11255-20</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Beaux-pince (# 5)</td&gt;<td&gt; Outils belle science</td&gt;<td&gt; 11252-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pince (# 3)</td&gt;<td&gt; Outils belle science</td&gt;<td&gt; 11231-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; La pénicilline G</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3032</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Le sérum fœtal bovin</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 10082-139</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nunc mini-bac</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 12-565-68</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Adénovirus-GFP</td&gt;<td&gt; Vecteur Biolabs</td&gt;<td&gt; 1060 *</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cal-Ex détartrant</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; CS510-1D</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdBorohydrure de sodium&gt;</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 452882</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-myosine 7a (polyclonal)</td&gt;<td&gt; Proteus Biosciences</td&gt;<td&gt; 25-6790</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-myosine 7a (monoclonal)</td&gt;<td&gt; Études de développement de la Banque d&#39;hybridome</td&gt;<td&gt; MYO7A 138-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-calmoduline</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; C 3545</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-calbindin</td&gt;<td&gt; Chemicon</td&gt;<td&gt; AB1778</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fluoromount G</td&gt;<td&gt; Southern Biotechnology Associates</td&gt;<td&gt; 0100-01</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tableau 1</strong&gt;. Réactifs et les outils utilisés dans la culture utricule et infection par un adénovirus.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; * Remarque: Ad-GFP est normalement fournie par Biolabs Vecteur à un titre de stock de 1x10<sup&gt; 10</sup&gt; PFU / ml. Nous avons demandé une amplification personnalisée afin de fournir le stock de virus à un titre de 1,2 × 10<sup&gt; 11</sup&gt; PFU / ml.</p&gt;

la dissection de souris adultes et utricule adénovirus-support cellulaire des infections

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

La perte d&#39;audition et de troubles de l&#39;équilibre sont souvent causés par la mort des cellules ciliées mécano, qui sont les cellules réceptrices de l&#39;oreille interne. Comme il n&#39;y a pas de ligne de la cellule qui représente de façon satisfaisante les cellules ciliées de mammifères, de la recherche sur les cellules ciliées se fonde sur les cultures d&#39;organes primaires. Le mieux caractérisé dans le système modèle in vitro de cellules matures des poils des mammifères utilise des cultures d&#39;organes de utricules de souris adultes (Figure 1) 1-6. L&#39;utricule est un organe vestibulaire, et les cellules ciliées de l&#39;utricule sont semblables dans les deux à la structure et la fonction des cellules ciliées de l&#39;organe auditif, l&#39;organe de Corti. La préparation utricule souris adultes représente un épithélium sensoriel maturité pour les études des signaux moléculaires qui régulent la survie, l&#39;homéostasie, et la mort de ces cellules. Mammifères cellules ciliées cochléaires sont définitivement différenciés et ne sont pas régénérés quand ils sont perdus. En non-mamvertébrés maliens, auditif ou vestibulaire de la mort des cellules ciliées est suivie d&#39;une régénération robuste qui rétablit les fonctions auditives et l&#39;équilibre 7, 8. La régénération des cellules de cheveux est médiée par la glie-comme les cellules de soutien, qui sont en contact les surfaces basolatérale des cellules ciliées de l&#39;épithélium sensoriel 9, 10. Cellules de soutien sont aussi des médiateurs importants de la survie des cellules ciliées et de la mort 11. Nous avons récemment développé une technique pour l&#39;infection des cellules de soutien dans les utricules cultivées en utilisant des adénovirus. Utilisation adénovirus de type 5 (dE1/E3) pour fournir un transgène contenant la GFP sous le contrôle du promoteur CMV, nous constatons que l&#39;adénovirus spécifiquement et efficacement infecte les cellules de soutien. Soutenir l&#39;efficacité infection de la cellule est d&#39;environ 25-50%, et les cellules ciliées ne sont pas infectés (Figure 2). Surtout, nous constatons que l&#39;infection adénovirale de cellules de soutien n&#39;entraîne pas de toxicité pour les cellules ciliées ou des cellules de soutien, comme nombre de cellules dans Ad-GFP infutricules ecté sont équivalentes à celles en situation de non-infectés utricules (Figure 3). Ainsi l&#39;expression des gènes adénovirus dans des cellules de soutien de utricules culture fournit un outil puissant pour étudier les rôles des cellules de soutien en tant que médiateurs de la survie des cellules des cheveux, la mort et la régénération.

Cellules ciliées mécanosensorielle sont les cellules réceptrices de l&#39;oreille interne. Le mieux caractérisé<em&gt; In vitro</emSystème modèle&gt; de cellules matures des poils des mammifères utilise des cultures d&#39;organes de utricules de souris adultes. Nous présentons la dissection de l&#39;utricule souris adulte, et nous démontrons adénovirus infection de cellules de soutien dans les utricules culture.

La dissection de souris adultes et utricule adénovirus-support cellulaire des infections

La perte auditive et les troubles de l'équilibre sont souvent causés par la mort des cellules ciliées mécanosensorielles, qui sont les cellules réceptrices de l'oreille interne. Puisqu'il y a...

Cette présentation illustre les procédures de culture d'organes entiers de l'utricule provenant de souris adultes. L'utilisation d'adénovirus pour infecter les cellules de soutien de l'utricule en culture sera également illustrée. Cette étape est réalisée en commençant par disséquer soigneusement l'utricule de l'oreille interne.La deuxième étape consiste à retirer l'épithélium du toit. Ensuite, les otoconies sont retirées, laissant l'épithélium sensoriel intact. La dernière étape consiste à infecter les cellules de soutien de l'utricule à l'aide d'un adénovirus.Ces techniques peuvent être utilisées dans une grande variété d'expériences conçues pour examiner les cellules ciliées et les cellules de soutien matures chez les mammifères. In vitro. Les cellules réceptrices sensorielles de l'oreille interne sont appelées cellules ciliées, et ces cellules sont responsables de la conversion de l'énergie sonore ou des mouvements de la tête en signaux neuronaux transmis au cerveau.La perte auditive est souvent causée par la mort de ces cellules sensorielles ciliées. Afin d'étudier les mécanismes sous-jacents à la mort des cellules sensorielles ciliées, il est très utile de disposer d'un système de modèle in vitro. La méthode que nous allons démontrer utilise des cultures d'organes entiers de l'utricule provenant de souris adultes.Le utricule est un organe vestibulaire situé dans l'oreille interne, et les cellules ciliées de l'utricule sont similaires aux cellules ciliées de l'organe de l'audition, appelé organe de Corti. La préparation de l'utricule constitue le système modèle le mieux caractérisé pour l'étude des cellules ciliées et des cellules de soutien provenant de mammifères adultes. De plus, nous démontrerons une méthode que notre laboratoire a récemment mise au point pour utiliser un adénovirus afin d'infecter les cellules de soutien de l'utricule.La technique de l'adénovirus permet d'examiner les rôles des cellules de soutien comme médiateurs de la survie, de la mort et de la régénération des cellules ciliées. Nous utilisons ces techniques dans notre laboratoire pour répondre à deux grandes questions. Premièrement, quels sont les signaux cellulaires et moléculaires qui déterminent si une cellule ciliée soumise à un stress meurt ou survit finalement ?Deuxièmement, comment pouvons-nous utiliser ces informations pour développer des thérapies, des traitements cliniques permettant de prévenir ou d'inverser la surdité ? Lindsey Maye, biologiste dans mon laboratoire, démontrera ces techniques. La démonstration visuelle de la dissection de l’utricule est importante car le tissu est petit et fragile, et particulièrement sensible aux dommages mécaniques, notamment lors des étapes de retrait des otoconies et de l’épithélium du toit.Après avoir euthanasié et décapité une souris adulte conformément à un protocole approuvé par l'institution pour les soins et l'utilisation des animaux, sectionner le crâne de caudal à rostral et retirer le cerveau des deux hémisphères afin de révéler le labyrinthe osseux. Ensuite, découper le crâne autour de la cochlée osseuse et transférer le labyrinthe osseux dans une boîte de culture tissulaire de 35 millimètres contenant du milieu stérile, 1 99. Si le bulbe auditif est encore intact, utiliser deux pinces solides pour briser le bulbe.Prenez un moment pour identifier les repères anatomiques de la préparation osseuse, notamment l'apex, la base, les acles, les fenêtres ovale et ronde, la racine du nerf huitième et les canaux semi-circulaires, tels qu’ils apparaissent sur ces images reproduites dans le protocole écrit. Orientez la préparation dans la boîte de façon que les osselets se retrouvent au fond et que la racine du nerf huitième soit dirigée vers le haut. À l’aide de pinces, maintenez la préparation au niveau des canaux semi-circulaires et, avec un scalpel muni d’une lame n°11, sectionnez l’apex de la cochlée juste au-dessus de la racine nerveuse. Utilisez le canal semi-circulaire antérieur comme poignée pour stabiliser la préparation, puis faites-la pivoter de manière à ce que la partie coupée soit orientée vers le haut.À l’aide de la pince numéro cinq, retirez maintenant le limaçon à partir du modiolus jusqu’à la base. Ensuite, utilisez une fine sonde fabriquée à partir de la moitié d’une pince numéro 55 pour soulever le dernier rebord osseux de la lame spirale osseuse. Pour mettre à jour la S située sous la S, qui est la platine du stapes.Cette image montre la platine du stapes, étiquetée « sf », qui constitue un repère important pour identifier la position de l’utricule, étiqueté « U », situé immédiatement adjacent à la platine du stapes. Utilisez la sonde fine pour ôter suffisamment d’os afin de découvrir environ un tiers de l’utricule. Ensuite, à l’aide de la pince n°55, retirez soigneusement l’utricule en le pinçant soit très près du bord, soit à la racine du nerf.Si l'épithélium pigmenté du toit est encore attaché à l'utricule, retirez-le à l'aide de fines pinces. Si les cils kinociliaires doivent être utilisés pour une infection par adénovirus, la suppression des otoconies est nécessaire pour réaliser cette opération. Remplissez une seringue avec le milieu de dissection et équipez-la d'une aiguille de calibre 26 ou 28.Tenir l’utricule par le bord avec une pince numéro 55 et diriger les otoconies à l’aide d’un flux de milieu. Alternativement, les otoconies peuvent être retirées à l’aide d’un outil en cils. Une fois que tous les utricules ont été disséqués, changer le milieu de dissection pour du milieu de culture stérile et placer la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.Toutes les procédures impliquant des adénovirus sont effectuées conformément aux précautions de niveau de biosécurité deux. Lorsque vous êtes prêt à infecter, utilisez une curette microchirurgicale pour transférer un ensemble de cellules ciliées du utricule dans un puits d’un plateau sans mini-conteneur contenant 15 microlitres de D-M-E-M-F 12 sans sérum. Ajoutez de un à quatre fois 10 à la puissance sept unités formant des plaques d’adénovirus dans le puits contenant la culture du utricule.Les u-trickles et le milieu contenant le virus sont incubés à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone dans une enceinte humidifiée pendant deux heures. Après deux heures, transférez les u-trickles dans une plaque de culture tissulaire de 24 puits contenant un milieu de culture avec sérum. Une fois transférés, les u-trickles sont à nouveau cultivés toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.Les cupules peuvent être utilisées le lendemain pour des expériences d'imagerie en direct, ou elles peuvent être fixées pour de l'immunohistochimie. Les cupules sont fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % sur une plateforme agitée pendant trois heures à température ambiante ou toute une nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, laver la cupule trois fois pendant 15 minutes chacune dans du tampon phosphate de Sorensen 0,1 molaire.Si les otolithes n'ont pas été retirés pour l'infection par adénovirus, retirez-les à ce stade en immergeant l'utricule dans du calx decalcify pendant une à deux minutes, puis rincez avec du sorbitol phosphate tamponné 0,1 molaire et immergez l'utricule dans la solution de blocage pendant trois heures à température ambiante. Après l'étape de blocage, diluez l'anticorps primaire dans la solution de blocage. Ajoutez-le à la plaque contenant les utricules et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius.Le lendemain, lavez les utricules et les cupules ainsi que le tampon phosphate. Ajoutez ensuite l'anticorps secondaire dilué dans la solution de blocage et incubez pendant quatre heures à température ambiante, à l'abri de la lumière, sur une plateforme agitée. Enfin, montez l'utricule sur des lamelles en verre à l'aide de Flora Mount G. Ces images confocales montrent la couche des cellules ciliées et la couche des cellules de soutien dans une même région d'un utricule infecté par un adénovirus induisant l'expression de la protéine fluorescente verte.Les cellules ciliées sont marquées avec un anticorps dirigé contre la myosine sept A, qui apparaît en magenta. Les cellules de soutien sont marquées avec un anticorps dirigé contre socks, deux, qui apparaît en rouge ici. On peut observer que le GFP du virus adénoviral se localise dans les cellules de soutien et non dans les cellules ciliées.Ce graphique démontre que l'infection adénovirale par l'adénovirus GFP à quatre fois 10 puissance huit unités formant des plaques par millilitre n'entraîne pas la mort des cellules ciliées ou des cellules de soutien. Une fois la dissection maîtrisée, les uricules provenant d'un même animal peuvent être mis en culture en 10 à 15 minutes.Cependant, il est important, lors du développement de cette procédure, de prendre son temps et de manipuler soigneusement le tissu après avoir suivi cette méthode. D'autres techniques comme l'imagerie confocale en direct, l'immunohistochimie, la R-T-P-C-R et le Western blot peuvent être réalisées afin d'aborder des questions relatives à la mort, à la survie et à la régénération des cellules de soutien et des cellules ciliées. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de disséquer l'utricule et d'infester les cellules de soutien à l'aide d'un adénovirus.Il est important de rappeler que le travail avec des virus peut présenter des risques pour la sécurité biologique. Des précautions de niveau deux doivent toujours être prises lors de l'exécution de ces procédures.

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La dissection de souris adultes et utricule adénovirus-support cellulaire des infections

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