Génération de cellules T régulatrices induites de l'homme primaires cellules T naïves et mémoire

L'objectif général de cette procédure est de générer des lymphocytes T régulateurs humains à partir de lymphocytes T primaires. Dans un premier temps, les cellules mononucléées du sang périphérique sont isolées à partir d'échantillons sanguins humains. Les lymphocytes T positifs pour le CD4 sont ensuite purifiés à partir du mélange de PBMC et mis en culture.

Après six jours, les cellules sont triées en sous-populations de cellules T naïves, mémoire, effectrices et régulatrices induites à l’aide d’un cytomètre en flux, puis des tests de suppression sont réalisés. L’utilisation de ces cellules démontre que cette méthode génère des cellules T régulatrices humaines dotées d’une activité suppressive. Les principaux avantages de cette technique par rapport à celles utilisant des cellules de la bouche sont que notre méthode humaine présente une pertinence physiologique et clinique accrue et permet la comparaison des tregs avec d’autres populations cellulaires au sein d’un même donneur.

Élimination de la variabilité intrasujets. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine des cellules régulatrices, telles que quelles sont les étapes régulatrices qui modulent la transition entre les lymphocytes T conventionnels et les cellules régulatrices, ou quels sont les événements de signalisation et transcriptionnels spécifiques aux cellules régulatrices ? Les implications de cette technique s'étendent aux thérapies des maladies auto-immunes, des affections inflammatoires et du cancer, en raison du rôle crucial que jouent les regs dans l'homéostasie immunitaire.

En général, les personnes novices dans cette technique éprouvent des difficultés en raison de la variété des méthodes utilisées et de la fenêtre étroite, dans certaines étapes, pour des conditions optimales de culture cellulaire. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le développement régulier, elle peut également servir à surveiller la plasticité de la différenciation de la lignée des lymphocytes T ou à analyser la capacité des microenvironnements des lymphocytes T à induire ou à prévenir celui-ci. Développement régulier. La procédure sera démontrée par Andrea McCool et les étudiants diplômés Marie Catherine Ranier Gavin Ellis, et Catalina Vale Ortega.

Commencez cette procédure en isolant les cellules mononucléées du sang périphérique humain à partir de 40 à 60 litres de culot buffy. Pour diluer le culot buffy, transférez-le dans une bouteille en verre stérilisable de 500 millilitres contenant 150 millilitres de PBS stérile. Ajoutez ensuite davantage de PBS stérile pour porter le volume final à 250 millilitres. Ensuite, remplissez 10 tubes coniques de 50 millilitres, chacun avec 20 millilitres de solution lympho prep.

Ensuite, recouvrir délicatement la solution de Lympho prep avec 25 millilitres du buffy coat dilué, en prenant soin de ne pas perturber la solution de Lympho prep. Faire centrifuger les tubes pendant 30 minutes à température ambiante à 500 ×g. Veiller à désactiver le frein de la centrifugeuse afin de ne pas perturber la fraction de lymphocytes.

Après la centrifugation, le CS PBM se trouvera à l'interface entre les couches du milieu lympho prep et du plasma ; collectez-les à ce niveau. Aspirez le milieu plasmatique jusqu'à ce qu'il en reste environ un millilitre recouvrant la couche de buffy coat contenant les PBMC. Utilisez une pipette de 10 millilitres pour transférer les PBMC dans un nouveau tube de 50 millilitres.

Après avoir lavé les cellules deux fois avec du PBS, les resuspendre dans 50 millilitres de RPMI froid et les compter à l’aide d’un hémocytomètre. Le rendement typique est de huit fois 10 à la puissance huit à un fois 10 à la puissance neuf PBMC après détermination de la concentration. Resuspendre les PBMC à une concentration finale de cinq fois 10 à la puissance sept par millilitre dans du PBS contenant 2 % de FBS et un millimolaire d’EDTA, puis transférer les cellules dans un tube rond en polypropylène neuf de 14 millilitres.

Ensuite, le kit EAs sera utilisé pour sélectionner négativement les cellules d'intérêt. Les mélanges d'enrichissement en lymphocytes T fournis avec le kit contiennent un complexe d'anticorps tétramérique, qui possède un anticorps anti-dextrine d'un côté et un anticorps dirigé contre les antigènes membranaires des cellules indésirables de l'autre côté. Lorsque le mélange est ajouté aux cellules, le complexe d'anticorps tétramérique relie les cellules indésirables.

Des particules magnétiques recouvertes de dextrane sont ensuite ajoutées, se liant au complexe d'anticorps tétramérique, reliant ainsi la cellule indésirable à la particule magnétique. Un aimant est alors appliqué pour séparer les cellules indésirables des cellules d'intérêt, qui sont ensuite récupérées afin d'isoler les lymphocytes T CD4 positifs. Prélevez par pipette une fois 10 à la puissance 8 à 4,25 fois 10 à la puissance 8 de pbmc dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez ensuite 50 microlitres de cocktail d'enrichissement en lymphocytes T CD4 positifs humains composé d'anticorps pour chaque millilitre de pbmc.

Mélanger et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Agiter les particules magnétiques afin de les répartir uniformément dans la solution. Ajouter 100 microlitres de particules magnétiques par millilitre de PBMC.

Mélanger en pipetant doucement deux à trois fois, puis incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Ajouter du PBS contenant du FBS et de l'EDTA pour amener le volume à 10 millilitres par tube, en mélangeant doucement par pipetage deux à trois fois. Ensuite, placer le tube débouché dans l'aimant cept pendant cinq minutes, le tube restant dans l'aimant.

Verser le liquide dans un nouveau tube de 50 millilitres afin d'isoler les cellules d'intérêt pour une meilleure récupération. Répéter cette procédure en ajoutant du P-B-S-F-B-S-E-D-T-A supplémentaire au tube, en mélangeant et en replaçant l'échantillon dans l'aimant. Une fois les cellules isolées, les compter, puis les centrifuger à 500 ×g pendant cinq minutes à température ambiante.

Resuspendre le culot cellulaire dans le milieu de polarisation afin d'obtenir une concentration de deux fois 10 à la puissance six cellules par millilitre. Ensuite, passer au culture selon la description de la section suivante de la vidéo pour induire les lymphocytes T régulateurs. Préchauffer les plaques de culture tissulaire prérecouvertes d'anticorps anti-CD3, en format 6 puits, à 37 degrés Celsius.

Une fois les plaques tiédes, aspirer le PBS des puits. Ensuite, ajouter quatre millilitres de la suspension cellulaire enrichie en CD4 positif à chacun. Remplir les puits vides restants avec du PBS afin de réduire l'évaporation du milieu, puis incuber pendant trois jours après l'incubation.

Centrifuger la plaque pendant cinq minutes à 500 × g. Ensuite, sans perturber les cellules au fond de la plaque, retirer la moitié du milieu et le remplacer par du milieu frais. Incuber encore deux à trois jours supplémentaires. Les cellules peuvent désormais être triées par tri cellulaire activé par fluorescence comme décrit dans la section suivante, ou utilisées comme cellules cibles pour un test de suppression tel que décrit ultérieurement. Après deux à trois jours écoulés, préparer les cellules et les contrôles de compensation appropriés pour le tri cellulaire activé par fluorescence. Pour trier et séparer les cellules T régulatrices induites, naïves et mémoires, marquer les cellules à trier avec anti-CD25 PE, anti-CD45RA PE-Cy5 et anti-CD127 APC, comme indiqué dans le document accompagnant.

Ajoutez également des anticorps aux contrôles de compensation appropriés pour l'analyse par cytométrie en flux. Après la coloration, resuspendez les cellules à une concentration de 1 × 10⁷ cellules par millilitre de tampon de lavage, puis ajoutez 1,5 µL d'ADNse II par millilitre de cellules et filtrez les cellules à travers un tamis en nylon de 40 µm. Transférez les cellules dans des tubes en polypropylène de 5 mL à fond rond, avec au maximum 3,5 mL par tube.

Résuspendre les cellules de contrôle de compensation dans 300 microlitres de tampon de lavage. Régler la compensation sur le cytomètre en flux afin de minimiser la détection croisée par les filtres PE, A PC et PE sci-fi. Définir les fenêtres de tri pour isoler les cellules T régulatrices, les cellules T naïves et les cellules T mémoire dans des tubes ronds en polystyrène de cinq millilitres contenant un millilitre de sérum de veau nouveau-né, afin d'évaluer si les cellules T régulatrices générées lors du tri sont capables d'inhiber la prolifération des cellules T.

Un test d'inhibition est réalisé ici. Les cellules enrichies CD4 positives non triées serviront de cellules cibles. Elles ne doivent pas contenir de lymphocytes T régulateurs induits CD25 positifs.

Commencez par marquer les cellules cibles avec du CFSE à l'aide d'un kit de traçage cellulaire selon les instructions du fabricant, en utilisant un microlitre de solution mère à cinq molaire par millilitre de cellules au lieu de deux microlitres. Ensuite, former un culot d'un nombre de billes inspectrices de suppression Treg égal au nombre total de cellules par centrifugation rapide dans un tube de microcentrifugeuse. Lavez les billes une fois avec du RPMI et reformez le culot après la centrifugation.

Aspirez le RPMI et resuspendez-les à la concentration appropriée dans huit microlitres de milieu d'essai de suppression par puits, dans une plaque de culture tissulaire de 96 puits à fond rond. Ajoutez huit microlitres de cellules cibles marquées au CFSE. Ajoutez les billes et les cellules triées polarisées pour obtenir un volume final en milieu frais d'essai de suppression.

Milieu de 200 microlitres. Toutes les conditions sont ensemencées par triplicat. Pour préparer les témoins, ajouter 100 microlitres de cellules marquées au CFSE, huit microlitres de billes de contrôle et une fois 10 à la puissance 5 de cellules fraîches non marquées dans 92 microlitres de test de suppression.

100 µL de milieu par puits aux deux premiers puits témoins. Ensuite, ajouter 100 µL de cellules marquées au CFSE et une fois 10 puissance 5 de cellules fraîches non marquées dans 92 µL de milieu de dosage suppresseur. 100 µL de milieu par puits aux deux seconds puits témoins.

Couvrez la plaque avec du papier d’aluminium et placez-la dans l’incubateur pendant cinq jours à l’abri de la lumière. Récupérez les cellules de chaque puits à l’aide d’une pipette et transférez-les dans un tube en polystyrène rond de cinq millilitres. Centrifugez les cellules à 500 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Aspirez le milieu et resuspendez-les dans 300 microlitres de tampon de lavage froid. Pour suivre l'évolution de la différenciation des cellules T régulatrices induites, des cellules T primaires humaines CD4 positif CD25 négatif purifiées ont été cultivées en aliquots de milieu iTreg ; des prélèvements ont été effectués aux jours 0, 1, 3 et 5, puis analysés par cytométrie en flux afin d’évaluer l’expression des marqueurs CD45RA, FoxP3, CTLA-4 et CD25. Comme le montrent ces diagrammes en points en couleurs pseudocolorées, au cours d’un suivi sur cinq jours, les cellules prolifèrent et se différencient in vitro en réponse au réticulation du CD3 en présence de TGF-bêta et d’IL-2, conduisant finalement à un phénotype CD45RA négatif, FoxP3 élevé, CTLA-4 élevé et CD25 élevé. Ceci indique le développement de Treg induits à partir de précurseurs conventionnels de cellules T. Pour évaluer la capacité relative des Treg générés à supprimer la prolifération des cellules T.

Les cellules marquées au CFSE ont été cultivées avec des billes d'inspection de la suppression par les Treg en présence de cellules T mémoires naïves triées et de cellules Treg de type I, comme on peut le voir sur cet histogramme. Les cellules CD 25 haut, CD 45 RA négatif, CD 127 négatif. Les lymphocytes T régulateurs induits faibles sont le seul sous-ensemble provenant d'une culture de cinq jours ayant acquis une capacité suppressive régulatoire.

Ceci indique que les cellules générées dans ce système sont des lymphocytes T régulateurs suppresseurs, tant sur le plan phénotypique que fonctionnel, et non des lymphocytes T conventionnels activés, qui peuvent exprimer transitoirement FOX P trois et CD 25, mais qui ne présentent pas d'activité immunosuppressive. La présence de lymphocytes T régulateurs induits abolit complètement la prolifération des lymphocytes T positifs pour CD quatre. Les chiffres indiquent le pourcentage de cellules marquées par CFSC ayant subi une division, permettant de confirmer que cela s'applique également aux sous-ensembles de cellules T purifiés.

Des lymphocytes T primaires naïfs et mémoires humains ont été marqués au CFSE et cultivés dans ce milieu. Après cinq jours de culture en milieu pour Treg, les cellules ont été phénotypées et les taux de division cellulaire ont été estimés comme indiqué. Ici, les Treg ont été induits à partir d'un pool de lymphocytes T naïfs et d'un pool de lymphocytes T mémoires après une culture de cinq jours.

Dans le milieu de culture IT standard, coloration par CFSE. La coloration des cellules initiales montre que les lymphocytes T naïfs ou mémoires se différencient en lymphocytes T régulateurs uniquement après plusieurs cycles de division cellulaire. Les profils comparatifs de coloration par CFSE identifient les lymphocytes T régulateurs induits comme les cellules les plus prolifératives au cours de la culture de cinq jours. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la méthode permettant d'obtenir des lymphocytes T régulateurs induits à partir d'une population de lymphocytes T naïfs, mémoires ou totaux provenant d'un seul donneur, lors de la mise en œuvre de cette procédure.

Il est important de maintenir une technique stérile tout au long de la procédure et d'éviter l'exposition du CFSE à la lumière après sa mise en œuvre. D'autres méthodes, telles que des tests fonctionnels, peuvent être réalisées afin de répondre à d'autres questions, comme les différences de taux de division cellulaire, la synthèse de cytokines spécifiques et l'utilisation des canaux ioniques entre les lymphocytes T régulateurs et conventionnels. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'immunologie pour explorer les maladies auto-immunes et d'autres pathologies liées aux Treg chez les patients humains.

N'oubliez pas que le travail avec le sang humain est extrêmement dangereux et que des précautions telles qu'un test adéquat en banque de sang et une élimination appropriée doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.