Identification et caractérisation des glycosylation des protéines spécifiques en utilisant des endo-et exoglycosidases

L’objectif général de l’expérience suivante est d’illustrer l’utilisation du glycosate pour la déglycosylation enzymatique et l’analyse de la glycosylation liée à n et O sur une glycoprotéine modèle. Ceci est réalisé en traitant une glycoprotéine avec le F de PGA ou avec le mélange de déglycosylation des protéines. De plus, le mélange de déglycosylation des protéines a été complété par un mélange d’exo glyco ass supplémentaire, qui aide parfois à éliminer les sucres autrement résistants.

Nous illustrons cette méthode à l’aide d’un modèle de glycoprotéine recombinante de gonadotrophine chorionique humaine bêta, ou HCG bêta page SDS suivante, suivi d’une coloration au bleu de Kumasi et d’une méthode de coloration spécifique au sucre. Les Pro Q Emerald 300 sont utilisés afin d’analyser le D glycosylé. Les résultats d’un échantillon bêta de HCG sont obtenus, qui montrent que le bêta HCG est glycosylé de manière hétérogène et contient plusieurs formes de glyco basées sur les différences de migration des protéines avec et sans traitement au glycosate et la diminution du signal sur la coloration ProQ lorsque les glycanes sont successivement éliminés.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l’analyse par spectrométrie de masse, est qu’elle est simple, qu’elle utilise un équipement de laboratoire commun et qu’elle est bonne pour le glycobiologiste débutant. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la glycologie, comme la glycosylation de ma protéine. Pour commencer la déglycosylation enzymatique, décongelez les tampons fournis à partir du kit de déglycosylation des protéines.

Mélangez soigneusement les tubes et maintenez-les à température ambiante. Placez les flacons contenant l’enzyme sur de la glace, dissolvez le contenu du flacon bêta HCG dans 600 microlitres d’eau distillée et conservez-le sur de la glace. Après avoir préparé un millilitre d’un tampon XG sept en diluant les 10 x stock dans de l’eau distillée, utilisez 25 microlitres pour diluer 0,5 microlitre de f de PGA.

Préparez le mélange d’exoglycosat en combinant deux microlitres, chacune des quatre maladies d’exoglyco. Ensuite, ajoutez HCG bêta et 10 x tampon de dénaturation des glycoprotéines dans sept tubes PCR numérotés comme indiqué dans le protocole écrit, bouchez les tubes et mélangez doucement pour dénaturer les protéines dans le thermocycleur en les incubant pendant 10 minutes à 94 degrés Celsius, suivis d’une suspension de quatre degrés Celsius. Après avoir retiré les tubes du thermocycleur, centrifugez-vous pour éliminer toute condensation visible dans chaque tube de réaction, Ajouter les réactifs restants selon le protocole écrit. Fermez les tubes PCR à l’aide de nouveaux capuchons.

Ensuite, mélangez les tubes en tapotant doucement quatre fois après avoir fait tourner le contenu, placez les tubes dans le thermocycleur et incubez à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Ensuite, refroidissez les échantillons à quatre degrés Celsius. Pour configurer la page SDS, préparez un tampon de chargement SDS frais trois fois réducteur.

Avec le DTT, ajoutez 12,5 microlitres de tampon de chargement FDS réducteur préparé À chaque échantillon, fermez les tubes avec de nouveaux bouchons et tapotez doucement les tubes pour mélanger. Incuber les tubes dans un thermocycleur à 94 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis refroidir à quatre degrés Celsius Après la charge d’incubation, 30 microlitres de chaque échantillon et 10 microlitres du marqueur protéique sur un gel de triglycine à 20 %. Sauvegarde du reste de chaque échantillon.

Electros le gel à 130 volts jusqu’à ce que la face D soit près du bas du gel. Lorsque le gel a fini de couler, retirez le gel du plâtre et placez-le dans une petite boîte en plastique avec suffisamment de colorant bleu kumasi pour couvrir la tache de gel. Le gel pendant une heure avec une agitation douce Une fois le gel coloré.

Lavez trois fois pendant 30 minutes. Dans 50 millilitres de solution de détention, enregistrez les images à l’aide d’un transluminateur de lumière blanche ou d’un scanner. Alternativement, le gel peut être séché entre des feuilles de cellophane.

Dans un cadre, analysez le reste de chaque échantillon et un marqueur protéique sur un gel de triglycine à 10 à 20 % pendant que le gel fonctionne. Dissoudre le réactif d’émeraude ProQ avec du DMF et préparer les solutions de fixation, de lavage et d’oxydation pour la tache en suivant le manuel du produit fourni avec le kit. Lorsque l’électrophorèse est terminée, retirez le gel du plâtre et placez-le dans une boîte en plastique.

Fixez le gel en ajoutant 100 millilitres de la solution fixe préparée. Laissez le gel reposer toute la nuit à température ambiante avec une légère agitation le lendemain. Lavez le gel avec 100 millilitres de la solution de lavage préparée pendant 10 à 20 minutes à température ambiante en agitant doucement, en répétant le lavage une deuxième fois avec la solution de lavage fraîche.

Ensuite, oxydez les glucides en incubant le gel avec une agitation douce pendant 30 minutes dans 25 millilitres de la solution oxydante préparée, suivez l’incubation avec deux lavages supplémentaires pendant que le gel est lavé. Préparez une nouvelle coloration ProQ emerald 300 en ajoutant 500 microlitres de la solution réactive ProQ Emerald 300 à 25 millilitres de tampon de coloration fourni dans le kit. Teignez le gel en l’incubant dans la teinture préparée dans des conditions sombres avec une agitation douce pendant 90 à 120 minutes après la coloration du gel.

Répétez les deux étapes de lavage comme décrit précédemment. Enregistrez ensuite les images avec un illuminateur UV trans à 300 nanomètres. Comme dernière étape, comparez les images du gel coloré kumasi avec le gel colorant émeraude ProQ.

Les changements dans la migration des protéines après la déglycosylation enzymatique peuvent être observés lorsque l’échantillon témoin est comparé au traitement F de la PGA. Pour éliminer les n glycanes et pour le traitement par mélange de déglycosylation pour éliminer les n et O glycanes, aucune réduction supplémentaire de la taille n’est observée après la digestion avec du glycosat supplémentaire. Outre un changement de masse, les bandes deviennent plus nettes à mesure que les glycanes sont éliminés.

Une bande passant sous le marqueur de 17 kilodaltons représente probablement le polypeptide bêta HCG entièrement déglycosylé. Les allées cinq à sept montrent les bandes correspondant au Glyco. D’autres bandes pourraient provenir d’une déglycosylation incomplète ou de plusieurs protéines non identifiées présentes dans l’échantillon bêta de l’HCG.

Le réactif vert émeraude oxyde et colore tous les glycanes présents dans une molécule de protéine. Par conséquent, l’intensité du signal diminue à mesure que l’HCG bêta est glycosylée enzymatiquement. Le signal résiduel dans les voies trois et quatre indique la présence de motifs glycanes, qui résistent aux enzymes utilisées.

Le glycosate supplémentaire est utilisé dans le couloir quatre. Retirez quelques résidus de sucre supplémentaires. La migration des protéines est la même, mais une légère réduction de l’intensité de la coloration peut être observée.

Les fractions sucrières résistantes n’étaient pas présentes chez toutes les espèces de protéines. Certaines bandes n’ont pas été détectées par le vert émeraude, ce qui indique qu’elles étaient fortement déglycosylées. La bande inférieure de la deuxième voie est faible sur l’image vert émeraude.

Bien que la bande supérieure de la deuxième voie soit brillante, ce qui indique que de nombreux groupes GLYCAN sont encore présents, ces données soutiennent la conclusion que l’HCG bêta recombinante exprimée dans les cellules de souris contient plusieurs formes de glyco en raison de l’hétérogénéité inhérente à la glycosylation. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la spectrométrie de masse peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que, quel est le taux d’occupation ? Quelle est l’étendue de la glycosylation, ou quelle est la structure fine des glycanes ?

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser le glycosylate pour la déglycosylation enzymatique et l’analyse des glycanes liés aux ONN. Sur les glycoprotéines. Le choix de la détection peut être difficile car les régions de coloration des protéines ne sont utiles que si la déglycosylation entraîne un changement significatif de la masse moléculaire pour d’autres protéines.

Nous avons observé des migrations anormales après la déglycosylation et avons constaté que tout changement dans la migration est la preuve que la protéine a été déglycosylée.