Identification et caractérisation des glycosylation des protéines spécifiques en utilisant des endo-et exoglycosidases

L'objectif général de l'expérience suivante est d'illustrer l'utilisation de la glycosidase pour la déglycosylation enzymatique et l'analyse des glycosylations N et O liées sur une glycoprotéine modèle. Cela est réalisé en traitant une glycoprotéine avec la PGA F ou avec le mélange de déglycosylation des protéines. En outre, le mélange de déglycosylation des protéines a été complété par un mélange d'exoglycosidases supplémentaires, qui parfois permettent d'éliminer des sucres résistants.

Nous illustrons cette méthode en utilisant un glycoprotéine modèle, la gonadotrophine chorionique humaine recombinante bêta, ou HCG bêta, suivie d'une électrophorèse SDS-PAGE, puis d'une coloration au bleu de Kumasi et d'une méthode de coloration spécifique des sucres. Le Pro Q Emerald 300 est utilisé afin d'analyser la glycosylation D. Des résultats sur l'échantillon d'HCG bêta sont obtenus, qui montrent que l'HCG bêta est hétérogènement glycosylée et contient plusieurs glycoformes, en fonction des différences de migration protéique avec et sans traitement déglycosylant, ainsi que de la diminution du signal en coloration ProQ au fur et à mesure que les glycanes sont supprimés successivement.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'analyse par spectrométrie de masse, est qu'elle est simple, utilise du matériel de laboratoire courant et convient bien aux biologistes glycosylés débutants. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la glycoscience, comme savoir si ma protéine est glycosylée. Pour commencer la déglycosylation enzymatique, décongelez les tampons fournis dans le kit de déglycosylation des protéines.

Mélangez soigneusement les tubes et maintenez-les à température ambiante. Placez les flacons contenant l'enzyme sur de la glace, dissolvez le contenu du flacon de bêta-HCG dans 600 microlitres d'eau distillée et maintenez sur glace. Après avoir préparé un millilitre de tampon 1 XG sept en diluant le stock 10 x dans de l'eau distillée, utilisez 25 microlitres pour diluer 0,5 microlitre de f de PGA.

Préparez le mélange d'exo glycosate en combinant deux microlitres de chacune des quatre exo glyco maladies. Ensuite, ajoutez HCG bêta et du tampon de dénaturation 10 x pour glycoprotéines dans sept tubes PCR numérotés comme indiqué dans le protocole écrit, fermez les tubes et mélangez doucement. Dénaturez les protéines dans le thermocycleur en incubant 10 minutes à 94 degrés Celsius, suivies d'une pause à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré les tubes du thermocycleur, centrifugez-les pour éliminer toute condensation visible. Ajoutez ensuite aux tubes de réaction les réactifs restants conformément au protocole écrit. Fermez les tubes PCR à l’aide de nouveaux bouchons.

Ensuite, mélanger les tubes en les tapotant doucement quatre fois après avoir centrifugé les contenus, puis placer les tubes dans le thermocycleur et incuber à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Procéder ensuite au refroidissement des échantillons à quatre degrés Celsius. Pour préparer la électrophorèse SDS-PAGE, préparer un tampon de charge SDS réducteur frais à 3 x.

Avec le DTT, ajouter 12,5 µL du tampon de charge SDS réducteur 3 x préparé à chaque échantillon, fermer les tubes avec de nouveaux bouchons et les tapoter doucement pour mélanger. Incuber les tubes dans un thermocycleur à 94 °C pendant cinq minutes, puis refroidir à 4 °C. Après l'incubation, charger 30 µL de chaque échantillon et 10 µL du marqueur protéique sur un gel tri-glycine 10 à 20 %. Conserver le reste de chaque échantillon.

Électrophorésez le gel à 130 volts jusqu'à ce que le front D soit près du bas du gel. Une fois l'électrophorèse terminée, retirez le gel du moule et placez-le dans une petite boîte en plastique contenant suffisamment de colorant bleu kumasi pour recouvrir entièrement le gel. Faites colorer le gel pendant une heure avec agitation douce après avoir coloré le gel.

Laver trois fois pendant 30 minutes. Dans 50 millilitres de solution de détachage, enregistrer les images à l’aide d’un transilluminateur à lumière blanche ou d’un scanner. Alternativement, le gel peut être séché entre des feuilles de cellophane.

Dans un cadre, faire migrer le reste de chaque échantillon et un marqueur protéique sur un gel Tri glycine 10 à 20 % pendant la course du gel. Dissoudre le réactif ProQ Emerald dans du DMF et préparer les solutions de fixation, de lavage et d'oxydation du colorant selon le mode d'emploi fourni avec le kit. Une fois l'électrophorèse terminée, retirer le gel du moule et le placer dans une boîte en plastique.

Fixez le gel en ajoutant 100 millilitres de la solution de fixation préparée. Laissez le gel toute la nuit à température ambiante avec une agitation douce le jour suivant. Lavez le gel avec 100 millilitres de la solution de lavage préparée pendant 10 à 20 minutes à température ambiante avec une agitation douce, puis répétez le lavage une deuxième fois avec une solution de lavage fraîche.

Ensuite, oxyder les glucides en incubant le gel avec agitation douce pendant 30 minutes dans 25 millilitres de la solution oxydante préparée, suivre l'incubation par deux lavages supplémentaires pendant que le gel est en cours de lavage. Préparer une solution fraîche de colorant ProQ Emerald 300 en ajoutant 500 microlitres de la solution réactive ProQ Emerald 300 à 25 millilitres du tampon de coloration fourni dans le kit. Colorer le gel en l'incubant dans le colorant préparé à l'abri de la lumière avec agitation douce pendant 90 à 120 minutes après la coloration du gel.

Répétez les deux étapes de lavage comme décrit précédemment. Ensuite, enregistrez les images à l’aide d’un transilluminateur UV à 300 nanomètres. Comme étape finale, comparez les images du gel coloré au kumasi avec celles du gel coloré à l’émeraude ProQ.

Les changements de migration des protéines après la déglycosylation enzymatique sont visibles lorsqu'on compare l'échantillon témoin au traitement F de PGA. Pour éliminer les glycanes N, et le traitement par le mélange de déglycosylation pour éliminer les glycanes N et O, aucune réduction supplémentaire de taille n'est observée après digestion avec un glycosidase supplémentaire. Outre un changement de masse, les bandes deviennent plus nettes à mesure que les glycanes sont retirés.

Une bande située sous le marqueur de 17 kilodaltons représente probablement le polypeptide bêta de l'HCG entièrement déglycosylé. Les pistes cinq à sept montrent les bandes correspondant aux formes glycosylées. D'autres bandes pourraient provenir d'une déglycosylation incomplète ou de plusieurs protéines non identifiées présentes dans l'échantillon du bêta-HCG.

Le réactif vert émeraude oxyde et colore tous les glycanes présents dans une molécule protéique. Par conséquent, l'intensité du signal diminue lorsque la bêta-HCG est déglycosylée de manière enzymatique. Le signal résiduel dans les pistes trois et quatre indique la présence de motifs de glycanes résistants aux enzymes utilisées.

Le glycosate supplémentaire est utilisé dans la piste quatre. Retirez quelques résidus de sucre supplémentaires. La migration des protéines est identique, mais une légère réduction de l'intensité de la coloration peut être observée.

Les sucres résistants n'étaient pas présents dans toutes les espèces protéiques. Certaines bandes n'ont pas été détectées par l'émeraude Green, indiquant qu'elles avaient été largement déglycosylées. Des données supplémentaires appuient la conclusion selon laquelle la bêta-HCG est hétérogène en ce qui concerne la glycosylation. La bande inférieure de la piste deux est faible sur l'image émeraude Green.

Bien que la bande supérieure du sillon deux soit intense, indiquant que de nombreux groupes GLYCAN sont encore présents, ces données confirment la conclusion selon laquelle l'HCG bêta recombinante exprimée dans des cellules de souris contient plusieurs formes glycosylées en raison de l'hétérogénéité intrinsèque de la glycosylation. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la spectrométrie de masse peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que : quel est le taux d'occupation ? Quelle est l'ampleur de la glycosylation, ou quelle est la structure fine des glycannes ?

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser la glycosylase pour la déglycosylation enzymatique et l'analyse des glycanes liés par liaison NNO sur les glycoprotéines. Le choix de la détection peut s'avérer difficile, car les régions de coloration des protéines ne sont utiles que si la déglycosylation entraîne un décalage significatif de la masse moléculaire pour d'autres protéines.

Nous avons observé des migrations anormales après la déglycosylation et avons constaté que toute modification de la migration constitue une preuve que la protéine a été déglycosylée.