Name: Identification et caractérisation des glycosylation des protéines spécifiques en utilisant des endo-et exoglycosidases (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Découvrez la déglycosylation enzymatique des glycoprotéines par glycosidases pour analyser les glycosylations N- et O-liées sur HCG bêta. Cette méthode simple utilise SDS-PAGE et colorations spécifiques.

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<html> 1. Déglycosylation enzymatique <ol><li> Utiliser des tubes de PCR afin de minimiser la perte d&#39;eau due à l&#39;évaporation. Repérer un ensemble de tubes 1 à 7. </li><li> Décongelez le tampon 10X G7, le tampon 10X glycoprotéine dénaturation, et les 10% NP-40 et tapotez doucement les tubes pour mélanger le contenu. Conserver à température ambiante. </li><li> Placer les flacons contenant des enzymes sur la glace. Essayez de minimiser le dégel / gel cycles. </li><li> Dissoudre le contenu du flacon hCGβ (150 ug) dans 600 pi de dH 2 O et de garder sur la glace. </li><li> Préparer 1 ml de tampon 1X G7 en diluant le stock 10X en DH 2 O. </li><li> Diluer 0,5 pl de la PNGase F dans 25 pi de tampon 1X G7 et de garder sur la glace. </li><li> Préparer le mélange exoglycosidase (mix EG) en combinant 2 pl chacune des α-N-acétylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, β1-3 galactosidase, et α1-3, 6 galactosidase. </li><li> Mettre en place des tubes de PCR comme indiqué: </li></ol>ak »&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> Tube / échantillon # </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> hCGβ (0.25mg/ml) </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Glycoprotéine 10X tampon dénaturant </td><td> 1 microlitre </td><td> 1 microlitre </td><td> 1 microlitre </td><td> 1 microlitre </td><td> 1 microlitre </td><td> 1 microlitre </td><td> 1 microlitre </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td></tr></tbody></table><ol start="9"><li> Boucher les tubes, mélanger délicatement et placer dans lethermocycleur, fermer le couvercle et dénaturer les protéines par incubation de 10 minutes à 94 ° C, suivie d&#39;un 4 ° C détiennent (en utilisant des tubes PCR dans un thermocycleur empêche grandement l&#39;évaporation dans les échantillons de petit volume). </li><li> Retirer les tubes du thermocycleur et centrifugeuse pour éliminer toute condensation visible. </li><li> Ajouter les réactifs suivants comme indiqué: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Exemple # </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 10% de NP-40 </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> Tampon 10X G7 </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5 &amp; mu; L </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> PNGase F 01h50 dil. </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Mélanger déglycosylation </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> Mélangez EG </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 10 ul </td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> Vol total de la réaction. </td><td> 25 L μ </td><td> 25 L μ </td><td> 25 L μ </td><td> 25 L μ &lt;/ Td&gt; <td> 25 L μ </td><td> 25 L μ </td><td> 25 L μ </td></tr></tbody></table><ol start="12"><li> Fermer les tubes PCR utilisant des amorces de nouvelles (jeter celles qui sont utilisées car elles ne s&#39;adaptent pas correctement après un cycle d&#39;incubation). </li><li> Mélanger les tubes en tapotant délicatement 4 fois, puis tourner le contenu vers le bas. </li><li> Placer les tubes dans le thermocycleur et incuber à 37 ° C pendant 4 heures puis laisser refroidir les échantillons à 4 ° C. </li></ol> 2. SDS-PAGE des échantillons déglycosylé <ol><li> Préparer 130 ul de tampon frais 3X réduction de la charge de SDS en ajoutant 4 pi de TNT 1.25M. </li><li> Ajouter 12,5 ul de la mémoire tampon 3X préparés de chargement réduisant SDS à chaque échantillon. </li><li> Fermer les tubes avec des bouchons de nouvelles et tapotez doucement les tubes pour mélanger. </li><li> Incuber les tubes dans un thermocycleur à 94 ° C pendant 5 minutes puis refroidir à 4 ° C. </li><li> Charge 30 ul de chaque échantillon et 10 pi de la protéine de marqueur sur un 10-20% Tris-Glycine gel. Enregistrer le reste de l&#39;échantillon pour la partie 3.1. Charge 10 pi de marqueur protéique ColorPlus précolorés. </li><li> Electrophorèse gel à 130 volts à température ambiante jusqu&#39;à ce que le front se trouve près du bas du gel. </li><li> Lorsque le gel a fini, enlever le gel de la fonte et le placer dans une petite boîte en plastique avec assez de Coomassie bleuissement pour couvrir le gel. </li><li> Stain le gel pendant 1 heure sous agitation douce. </li><li> Lavez les trois moments de gel pendant 30 minutes dans 50 ml de solution Décolorer. </li><li> Enregistrez les images en utilisant un transilluminateur lumière blanche ou un scanner. Sinon, le gel peut être séché entre des feuilles de cellophane dans un cadre. </li></ol> 3. Pro-Q Emerald 300 pour la détection des protéines glycosylées de gels SDS-PAGE <ol><li> En parallèle avec le gel de 2,1), charge le reste des échantillons sur un 10-20% Tris-Glycine gel. Charge 10 &amp; mu; L de protéines marqueurs ColorPlus précolorés. </li><li> Alors que le gel est en marche dissoudre le réactif Pro-Q émeraude avec du DMF et de préparer le correctif stock, Laver et oxydantes des solutions pour l&#39;Emeraude de Pro-Q 300 tache suivant le manuel du produit fournie avec le kit. </li><li> Lorsque l&#39;électrophorèse est terminée, enlever le gel de fonte et le placer dans une boîte en plastique. </li><li> Fixer le gel en ajoutant 100 ml de la solution Fix et c&#39;est une nuit à température ambiante sous agitation douce. </li><li> Laver le gel avec 100 ml de la solution de lavage de 10 à 20 minutes à température ambiante sous agitation Gentile. Répéter le lavage avec la solution de lavage frais. </li><li> Oxyder les hydrates de carbone en incubant le gel avec une agitation douce pendant 30 minutes dans 25 ml de solution oxydante. </li><li> Laver le gel comme décrit dans l&#39;étape 3.5. </li><li> Alors que le gel est de préparer le lavage douce Pro-Q Emerald 300 tache en ajoutant 500 pl de la solution Pro-Q Emeraude réactif dissous 300 à l&#39;étape 3.2 à 25 ml decoloration tampon fourni dans le kit. </li><li> Stain le gel en ajoutant 25 ml de la tache préparé à l&#39;étape 3.8 et l&#39;incubation dans l&#39;obscurité sous agitation douce pendant 90 à 120 minutes. </li><li> Répétez les deux étapes de lavage décrite à l&#39;étape 3.5. </li><li> Enregistrer les images avec un transilluminateur d&#39;UV à 300nm. Utilisez le marqueur de 80 kDa, qui est étiqueté avec Pro-Q vert émeraude, le chevauchement de l&#39;image à une image UV lumière blanche du gel montrant l&#39;échelle précolorés. </li><li> Comparez les images du gel Coomassie teinté à l&#39;étape 2.10 avec le gel d&#39;Emeraude Pro-Q teinté de l&#39;étape 3.11. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Les changements dans la migration des protéines enzymatiques après déglycosylation sont présentés dans la figure 2. Comparer l&#39;échantillon de contrôle (panneau A, ligne 1) avec le traitement PNGase F (élimination des N-glycanes, piste 2), et Mix déglycosylation (PNGase F; ainsi endo-et exoglycosidases pour enlever O-glycanes, piste 3). Aucune autre réductionla taille est observée après digestion par des glycosidases supplémentaires (piste 4). Outre un changement de masse, les bandes deviennent plus nettes que les glycanes sont supprimés. Une bande fonctionnant sous le marqueur de 17 kDa (astérisque) représente l&#39;parfaitement déglycosylé hCGβ polypeptide (MW: 16 kDa). D&#39;autres bandes pourraient découler de déglycosylation incomplètes ou multiples à partir des protéines non identifiés présents dans l&#39;échantillon hCGβ (voir ligne 1). Lanes 5 à 7 (contrôles) montrent les bandes correspondant aux glycosidases. La coloration par le vert émeraude glycoprotéine est montré dans le panneau B. Ce réactif s&#39;oxyde et les taches de tous les glycanes présents dans une molécule de protéine. Par conséquent, l&#39;intensité du signal diminue à mesure que hCGβ est enzymatiquement déglycosylé (voies 1 à 4 voies). Le signal résiduel dans les couloirs 3 et 4 indiquent la présence de motifs glycane, qui sont résistants aux enzymes utilisées. Les glycosidases supplémentaires utilisées dans la piste 4 enlever un peu de résidus de sucre supplémentaire: la migration des protéines est le même, maisune légère réduction de l&#39;intensité de la coloration peut être vu. Fractions de sucre résistant n&#39;étaient pas présents dans toutes les espèces de protéines: certaines bandes n&#39;ont pas été détectés par Emerald Green (absente dans l&#39;image UV, entre parenthèses), indiquant qu&#39;ils ont été largement déglycosylé. Des données additionnelles de soutien à la conclusion que hCGβ est hétérogène glycosylée. La bande inférieure sur la voie 2 (flèche) est faible sur l&#39;image vert émeraude, tandis que la bande supérieure sur la piste 2 est lumineux, ce qui indique que de nombreux groupes de glycanes sont toujours présents. Ces données appuient la conclusion que hCGβ recombinant exprimé dans des cellules de souris contient glycoformes multiples 9. Ces glycoformes différentes sont dues à l&#39;hétérogénéité inhérente de la glycosylation des polypeptides où certains ne reçoivent pas un glycane dans chaque site de consensus et / ou certains glycanes sont étendues tandis que d&#39;autres, même sur la même protéine ne sont pas. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig1.jpg" /> Figure 1.Modèles de glycosylation typiques pour sécrétée ou glycoprotéines de surface cellulaire. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig2.jpg" /> Figure 2. Gels SDS-PAGE montrant déglycosylation enzymatique de hCGβ. Le panneau A montre une coloration bleue Coomassie tout panneau B montre les résultats de Pro-Q Emerald 300 pour la visualisation des protéines glycosylées. Numéro de l&#39;échantillon: 1, le contrôle hCGβ; 2, PNGase F digestion; 3, la digestion Mix déglycosylation; 4, ainsi que la digestion Mix déglycosylation exoglycosidases, des échantillons de 5 à 7 sont les contrôles réactifs (O-Glyc, O-glycosidase; GNA, β-N acétylglucosaminidase; Fucosidase Gal / FUC, β1-3 galactosidase, α1-3, 6 galactosidase, et α1-2; Galna, α-N-Acetylglalactosaminidase; Neu, la neuraminidase; PNGase; PNGase F)

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</ol>

Les auteurs sont employés par New England Biolabs, qui produit beaucoup de réactifs utilisés dans cet article.

La méthode décrite ici en utilisant déglycosylation enzymatique et SDS-PAGE peut fournir des informations précieuses sur l&#39;état de glycosylation d&#39;une protéine d&#39;intérêt, tandis que glycane réactifs spécifiques de faciliter l&#39;interprétation des données. Ce protocole est destiné à des études initiales de la glycosylation des protéines et il est particulièrement adapté pour la sécrétion et de glycoprotéines membranaires des cellules de mammifères: les enzymes choisies dans ce cas sera spécifiquement supprimer tous les N-glycanes, et ou N-glycanes plus et les sucres les plus courants l&#39;extension et formant le noyau de O-glycanes. Glycosidases ont l&#39;avantage supplémentaire d&#39;être doux, comparé aux méthodes déglycosylation chimique, en préservant l&#39;intégrité de sucres et de protéines épine dorsale. Pour élucider le taux d&#39;occupation (dont les acides aminés sont glycosylés), l&#39;étendue de la glycosylation, ou pour déterminer la structure fine des glycanes, des techniques plus sophistiquées telles que mspectrométrie de cul, la chromatographie liquide ou RMN sont nécessaires. En raison de sa simplicité, plusieurs étapes de ce protocole peut être ajustée, substitué, et / ou combinés pour s&#39;adapter aux divers besoins expérimentaux. Toutefois, afin d&#39;obtenir des résultats qui peuvent être clairement interprétée, il est important de comprendre ses forces et ses limites. Tout d&#39;abord, la spécificité et la pureté de l&#39;glycosidases sont cruciales: que les enzymes bien caractérisées testé pour être libre de protéases et d&#39;autres activités de contamination doivent être utilisés. Malheureusement, il n&#39;existe pas de définition standard de l&#39;enzyme unité pour les glycosidases, l&#39;utilisateur doit déterminer la substitution appropriée conformément aux spécifications du fabricant. Deuxièmement, un choix judicieux de détection est nécessaire: une réactifs) Coloration des protéines ne sont utiles que si les résultats déglycosylation à un changement important dans la masse moléculaire. Un tel résultat clair comme montré ici n&#39;est pas toujours obtenue. Dans d&#39;autres cas, nous avons vu mi anormalegration après déglycosylation (loin d&#39;être le poids moléculaire prédit, ou la migration encore plus lent). Ce phénomène n&#39;est pas bien comprise, mais on peut dire que tout changement dans la migration est la preuve que la protéine a été déglycosylé. B) la détection de sucre avec des anticorps présente des défis uniques en limitant leur applicabilité. Il a été très difficile de générer générale anti-glycane anticorps, ils sont généralement soulevées contre une cible complexe glycane, ce qui restreint leur utilisation. Par ailleurs, plusieurs anticorps monoclonaux anti-glycane anticorps affichage indésirable réactivité croisée 10. C) Les lectines (protéines ayant une affinité de sucre intrinsèque) sont bien adaptés pour la détection de sucre, plus ils donnent un aperçu sur la structure du glycane. Cependant, pas tous d&#39;entre eux ont une spécificité étroite, et beaucoup ne sont que partiellement caractérisé (ce qui signifie qu&#39;ils pourraient avoir des affinités inconnues). Comme une coloration lectine conséquence positive fournit une indication, pas une preuve, de la présence d&#39;une IGême sucre. d) des kits d&#39;étiquetage de produits chimiques (basée sur l&#39;oxydation au periodate de sucres) sont la méthode de choix pour colorer toutes les glycoprotéines, et donc bien adapté pour suivre déglycosylation. Lors du traitement d&#39;un échantillon inconnu, il est une bonne pratique d&#39;inclure des contrôles glycoprotéine. Fétuine est un N aisément disponibles - et O-glycoprotéine; gonadotrophine chorionique (les deux sous-unités) est également un bon choix. Albumine sérique bovine (BSA) peut être utilisé comme contrôle négatif. Toutefois, il convient de noter que certaines protéines non glycosylées réagissent peu avec le Emerald Pro-Q 300, en particulier lorsqu&#39;il est utilisé à des concentrations élevées. Non-glycosylée standards de poids moléculaire, tels que le marqueur protéique précolorés utilisé dans ce protocole, ont l&#39;avantage d&#39;afficher des bandes nettes. Ce n&#39;est que par hasard est une de ces protéines (80 kDa) réactive à Pro-Q Emerald 300. Par conséquent, l&#39;utilisateur pourrait vouloir lancer une échelle standard glycoprotéine lieu, comme Candy-canne de Invitrogen. Enfin, simple en gel de détection de glycoprotéines nucleocytosolic (qui sont modifiées avec un seul O-GlcNAc) est possible avec l&#39;utilisation d&#39;un anticorps monoclonal, le long de β-N-acétylglucosaminidase pour 11 contrôle de spécificité. La description de cette technique est au-delà des portée de cet article, mais il devrait être mentionné comme glycosidases sont des outils utiles pour l&#39;étude de nombreuses autres glycoprotéines et glycoconjugués présents dans les cellules. Un traitement complet de toutes les formes connues de la glycosylation peuvent être trouvés dans la deuxième édition de la «Essentials of Glycobiologie», disponible gratuitement en ligne à l&#39;étagère de NCBI (ID Bookshelf: NBK1908; PMID: 20301239) 12.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Homme gonadotrophine chorionique β </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6572 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes PCR </td><td> VWR </td><td> 20170-004 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Thermocycleur </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4359659 </td><td></td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> New England Biolabs </td><td> P0704 </td><td> Livré avec des tampons </td></tr><tr><td> Mélanger déglycosylation protéines </td><td> New England Biolabs </td><td> P6039 </td><td> Livré avec des tampons </td></tr><tr><td> α-N-Acetylglalactosaminidase </td><td> New England Biolabs </td><td> P0734 </td><td> Livré avec le tampon </td></tr><tr><td> α1-2 Fucosidase </td><td> New England Biolabs </td><td> P0724 </td><td> Livré avec le tampon </td></tr><tr><td> α1-3, 6 Galactosidase </td><td> New England Biolabs </td><td> P0731 </td><td> Livré avec le tampon </td></tr><tr><td> β1-3 Galactosidase </td><td> New England Biolabs </td><td> P0726 </td><td> Livré avec le tampon </td></tr><tr><td> Tampon 10X G7 (500 mM phosphate de sodium) </td><td> New England Biolabs </td><td> --- </td><td> Livré avec PNGaseF ou degl Mix </td></tr><tr><td> Tampon 10X glycoprotéine dénaturation (5% de SDS, 400 mM DTT) </td><td> New England Biolabs </td><td> --- </td><td> Livré avec PNGaseF ou degl Mix </td></tr><tr><td> 10% de NP-40 </td><td> New England Biolabs </td><td> --- </td><td> Livré avec PNGaseF ou degl Mix </td></tr><tr><td> 3X tampon de charge SDS (187,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 6% de SDS, glycérol 30%, 0,03% Bromophenol bleu) </td><td> New England Biolabs </td><td> B7703 </td><td> Livré avec 1,25 M de DTT </td></tr><tr><td> ColorPlus précolorés marqueur protéique </td><td> New England Biolabs </td><td> P7709 </td><td></td></tr><tr><td> 10-20% Tris-Glycine Multigel </td><td> Cosmo Bio Co. </td><td> DCB-414893 </td><td></td></tr><tr><td> Unité d&#39;électrophorèse cassette </td><td> Cosmo Bio Co. </td><td> DCB-303111 </td><td></td></tr><tr><td> EPS électrophorèse Alimentation 301 </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr><tr><td> Pro-Q Kit Emeraude glycoprotéine 300 Stain </td><td> Invitrogen </td><td> P-21857 </td><td></td></tr><tr><td> Brilliant Blue R </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B0149 </td><td></td></tr><tr><td> AlphaImager système HP </td><td> Cellule Biosciences </td><td> 92-13823-00 </td><td></td></tr></tbody></table>

identification et caractérisation des glycosylation des protéines spécifiques en utilisant des endo-et exoglycosidases

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, l&#39;addition de sucres liés de façon covalente, est une importante modification post-traductionnelle des protéines qui peuvent affecter de manière significative les processus tels que l&#39;adhésion cellulaire, le trafic moléculaire, dégagement, et 1-4 transduction du signal. Chez les eucaryotes, les modifications de la glycosylation les plus courantes dans la voie de sécrétion sont des ajouts au niveau des résidus asparagine consensus (N-liés); ou à résidus serine ou thréonine (O-lié) (figure 1). Initiation de la N-glycanes de synthèse est très conservée chez les eucaryotes, tandis que les produits finaux peuvent varier considérablement entre les différentes espèces, les tissus ou les protéines. Certains glycanes sont pas modifiées («high mannose N-glycanes») ou sont traitées ultérieurement dans le Golgi (&quot;complexe N-glycanes»). Une plus grande diversité se trouve pour O-glycanes, qui commencent par une commune N-acétylgalactosamine (GalNAc) de résidus dans les cellules animales, mais diffèrent dans les organismes inférieurs 1. ent &quot;&gt; L&#39;analyse détaillée de la glycosylation des protéines est un domaine en soi et nécessite d&#39;importantes ressources et l&#39;expertise pour exécuter correctement. Cependant une variété d&#39;enzymes disponibles que les sucres supprimer (glycosidases) rend possible d&#39;avoir une idée générale de l&#39;état de glycosylation des . protéine dans un laboratoire standard ici, nous illustrons l&#39;utilisation de glycosidases pour l&#39;analyse d&#39;une glycoprotéine modèle:. gonadotrophine chorionique humaine recombinante bêta (hCGβ), qui porte deux N-glycanes et quatre O-glycanes 5 La technique ne nécessite que simples l&#39;instrumentation et des consommables typique, et il peut être facilement adapté à l&#39;analyse des échantillons glycoprotéine multiples. Plusieurs enzymes peuvent être utilisées en parallèle pour étudier une glycoprotéine. PNGase F est capable d&#39;éliminer presque tous les types de N-glycanes 6,7. Pour O-glycanes, il n&#39;ya pas d&#39;enzymes disponibles qui peuvent cliver un oligosaccharide intact depuis èmesquelette protéique e. Au lieu de cela, O-glycanes sont garnis par des exoglycosidases à une courte carotte, qui est alors facilement enlevé par O-glycosidase. Le Grand Mix déglycosylation protéine contient PNGase F, O-glycosidase, la neuraminidase (sialidase), β1-4 galactosidase et β-N-acétylglucosaminidase. Il est utilisé pour retirer simultanément N-glycanes et certains glycanes O-8. Enfin, le Mix déglycosylation a été complétée avec un mélange de exoglycosidases autres (α-N-acétylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, α1-3, 6 galactosidase, et β1-3 galactosidase), qui aident à éliminer les monosaccharides contraire résistants qui pourraient être présents dans certains O-glycanes. SDS-PAGE/Coomasie bleu est utilisé pour visualiser les différences en matière de migration des protéines avant et après traitement glycosidase. En outre, un sucre spécifique méthode de coloration, Proq Emeraude-300, montre que le signal diminue glycanes sont successively enlevé. Ce protocole est conçu pour l&#39;analyse de petites quantités de glycoprotéines (0,5 à 2 ug), bien que déglycosylation enzymatique peut être étendu pour accueillir de grandes quantités de protéines que nécessaire.

Utiliser glycosidases spécifiques pour éliminer les sucres de glycoprotéines suivi par SDS-PAGE est une méthode utile pour détecter des modifications glycane sur des échantillons de protéines et est un bon choix pour des études glycobiologie initiale. Les changements suivants déglycosylation peuvent être détectés comme des changements dans la mobilité de gel ou par coloration avec glycane réactifs sensibles.

Identification et caractérisation des glycosylation des protéines spécifiques en utilisant des endo-et exoglycosidases

La glycosylation, consistant en l'ajout de sucres liés par des liaisons covalentes, est une modification post-traductionnelle majeure des protéines qui peut influencer considérablement les processus...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'illustrer l'utilisation de la glycosidase pour la déglycosylation enzymatique et l'analyse des glycosylations N et O liées sur une glycoprotéine modèle. Cela est réalisé en traitant une glycoprotéine avec la PGA F ou avec le mélange de déglycosylation des protéines. En outre, le mélange de déglycosylation des protéines a été complété par un mélange supplémentaire d'exoglycosidases, qui parfois permettent d'éliminer des sucres résistants.Nous illustrons cette méthode à l'aide d'un glycoprotéine modèle, la gonadotrophine chorionique humaine recombinante bêta, ou HCG bêta, suivie d'une électrophorèse SDS-PAGE, puis d'une coloration au Kumasi blue et d'une méthode de coloration spécifique aux sucres. Le Pro Q Emerald 300 est utilisé afin d'analyser la glycosylation D. Des résultats sur l'échantillon d'HCG bêta sont obtenus, qui montrent que l'HCG bêta est hétérogène en termes de glycosylation et contient plusieurs glycoformes, en fonction des différences de migration protéique avec et sans traitement déglycosylant, ainsi que de la diminution du signal en coloration ProQ au fur et à mesure que les glycanes sont éliminés successivement.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'analyse par spectrométrie de masse, est qu'elle est simple, utilise du matériel de laboratoire courant et convient bien au glyco-biologiste débutant. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine de la glycoscience, telles que : mon protéine est-elle glycosylée ? Pour commencer la déglycosylation enzymatique, décongelez les tampons fournis dans le kit de déglycosylation des protéines.Mélangez soigneusement les tubes et maintenez-les à température ambiante. Placez les flacons contenant l'enzyme sur de la glace, dissolvez le contenu du flacon de bêta-HCG dans 600 microlitres d'eau distillée et maintenez sur glace. Après avoir préparé un millilitre de tampon 1 XG sept en diluant le stock 10 x dans de l'eau distillée, utilisez 25 microlitres pour diluer 0,5 microlitre de f de PGA.Préparez le mélange d'exo-glycosides en combinant deux microlitres de chacun des quatre exo-glycosides. Ensuite, ajoutez l'HCG bêta et le tampon de dénaturation 10 x pour glycoprotéines dans sept tubes PCR numérotés comme indiqué dans le protocole écrit, fermez les tubes et mélangez délicatement. Dénaturez les protéines dans le thermocycleur en incubant 10 minutes à 94 degrés Celsius, suivies d'une pause à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré les tubes du thermocycleur, centrifugez-les pour éliminer toute condensation visible. Ajoutez ensuite à chaque tube à réaction les réactifs restants conformément au protocole écrit. Fermez les tubes PCR à l’aide de nouveaux bouchons.Ensuite, mélanger les tubes en tapotant doucement quatre fois après avoir centrifugé les contenus, puis placer les tubes dans le thermocycleur et incuber à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Procéder ensuite au refroidissement des échantillons à quatre degrés Celsius. Pour préparer la électrophorèse SDS-PAGE, préparer un tampon de charge SDS réducteur frais à 3 x.Avec le DTT, ajoutez 12,5 microlitres du tampon de charge SDS réducteur trois fois préparé à chaque échantillon, fermez les tubes avec de nouveaux bouchons et tapez doucement sur les tubes pour mélanger. Incubez les tubes dans un thermocycleur à 94 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis refroidissez à quatre degrés Celsius. Après l'incubation, chargez 30 microlitres de chaque échantillon et 10 microlitres du marqueur protéique sur un gel tri-glycine 10 à 20 %. Conservez le reste de chaque échantillon.Électrophorésez le gel à 130 volts jusqu'à ce que le front D soit près du bas du gel. Une fois l'électrophorèse terminée, retirez le gel du moule et placez-le dans une petite boîte en plastique contenant suffisamment de colorant bleu kumasi pour recouvrir entièrement le gel. Laissez le gel colorer pendant une heure sous agitation douce après la coloration du gel.Laver trois fois pendant 30 minutes. Dans 50 millilitres de solution de détachage, enregistrer les images à l’aide d’un transilluminateur à lumière blanche ou d’un scanner. Alternativement, le gel peut être séché entre des feuilles de cellophane.Dans un cadre, faire migrer le reste de chaque échantillon et un marqueur protéique sur un gel Tri glycine 10 à 20 % pendant la course du gel. Dissoudre le réactif ProQ Emerald dans le DMF et préparer les solutions de fixation, de lavage et d'oxydation du colorant selon le mode d'emploi fourni avec le kit. Une fois l'électrophorèse terminée, retirer le gel du moule et le placer dans une boîte en plastique.Fixez le gel en ajoutant 100 millilitres de la solution de fixation préparée. Laissez le gel toute la nuit à température ambiante avec une agitation douce le jour suivant. Lavez le gel avec 100 millilitres de la solution de lavage préparée pendant 10 à 20 minutes à température ambiante avec une agitation douce, puis répétez le lavage une deuxième fois avec une solution de lavage fraîche.Ensuite, oxyder les glucides en incubant le gel avec agitation douce pendant 30 minutes dans 25 millilitres de la solution oxydante préparée, suivre l'incubation par deux lavages supplémentaires pendant que le gel est en cours de lavage. Préparer une solution fraîche de colorant ProQ Emerald 300 en ajoutant 500 microlitres de la solution réactive ProQ Emerald 300 à 25 millilitres du tampon de coloration fourni dans le kit. Colorer le gel en l'incubant dans le colorant préparé à l'abri de la lumière avec agitation douce pendant 90 à 120 minutes après la coloration du gel.Répétez les deux étapes de lavage comme décrit précédemment. Ensuite, enregistrez les images à l’aide d’un transilluminateur UV à 300 nanomètres. Comme étape finale, comparez les images du gel coloré au kumasi avec celles du gel coloré à l’éméralde ProQ.Les changements de migration des protéines après la déglycosylation enzymatique sont visibles lorsqu'on compare l'échantillon témoin au traitement F de PGA. Pour éliminer les glycanes N, et le traitement par le mélange de déglycosylation pour éliminer les glycanes N et O, aucune réduction supplémentaire de taille n'est observée après digestion avec un glycosidase supplémentaire. Outre un changement de masse, les bandes deviennent plus nettes à mesure que les glycanes sont retirés.Une bande située sous le marqueur de 17 kilodaltons représente probablement le polypeptide bêta de l'HCG entièrement déglycosylé. Les pistes cinq à sept montrent les bandes correspondant à la forme glycosylée. D'autres bandes pourraient provenir d'une déglycosylation incomplète ou de plusieurs protéines non identifiées présentes dans l'échantillon du bêta-HCG.Le réactif vert émeraude oxyde et colore tous les glycanes présents dans une molécule protéique. Par conséquent, l'intensité du signal diminue lorsque la bêta-HCG est déglycosylée de manière enzymatique. Le signal résiduel dans les bandes trois et quatre indique la présence de motifs de glycanes résistants aux enzymes utilisées.Le glycosate supplémentaire est utilisé dans la piste quatre. Retirez quelques résidus de sucre supplémentaires. La migration des protéines est identique, mais une légère réduction de l'intensité de la coloration peut être observée.Les motifs glucidiques résistants n'étaient pas présents dans toutes les espèces protéiques. Certaines bandes n'ont pas été détectées par l'Emerald Green, indiquant qu'elles avaient été largement déglycosylées. Des données supplémentaires appuient la conclusion que la bêta-HCG est hétérogène en termes de glycosylation. La bande inférieure de la piste deux est faible sur l'image au vert Emerald.Bien que la bande supérieure du sillon deux soit intense, indiquant que de nombreux groupes GLYCAN sont encore présents, ces données confirment la conclusion selon laquelle l'HCβ recombinante exprimée dans des cellules de souris contient plusieurs formes glycosylées en raison de l'hétérogénéité intrinsèque de la glycosylation. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la spectrométrie de masse peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que : quel est le taux d'occupation ? Quelle est l'étendue de la glycosylation, ou quelle est la structure fine des glycannes ?Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser la glycosylation pour la déglycosylation enzymatique et l'analyse des glycanes liés par liaison NNO sur les glycoprotéines. Le choix de la détection peut s'avérer difficile, car les régions de coloration des protéines ne sont utiles que si la déglycosylation entraîne un décalage significatif de la masse moléculaire pour d'autres protéines.Nous avons observé des migrations anormales après la déglycosylation et avons constaté que tout changement de migration constitue une preuve que la protéine a été déglycosylée.

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