Analyse de l'interaction avec la chromatine Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) pour la cartographie des interactions Chromatine et transcription Comprendre le règlement

L'analyse des interactions COMIN par séquençage de poudre et d'étiquettes est une méthode d'analyse à l'échelle du génome des interactions COMIN à longue distance. En bref, nous appelons ceci le Magic Share Pad. Cette méthode implique de nombreuses étapes de biologie moléculaire et peut être compliquée.

Par conséquent, dans cette vidéo suivante, nous vous montrerons certaines des étapes clés impliquées dans la construction, l'immunoprécipitation et la construction de la bibliothèque pour l'analyse chair PET. L'immunoprécipitation de la chromatine, connue sous le nom de chip, est la première étape critique dans la construction d'une bibliothèque chair pet. Ici, les échantillons de chromatine provenant de cultures cellulaires sont réticulés, soniqués et immunoprécipités.

Des aliquotes séparées d'ADN de puce sont ensuite ligaturées à des demi-adaptateurs barcodés et une ligature de proximité est réalisée. Les fragments d'ADN (« PETS ») sont libérés par digestion restrictivée, purifiés sur des billes magnétiques revêtues, puis ligaturés à des adaptateurs destinés au séquençage de nouvelle génération. Les PETS en chime sont identifiés grâce à la composition du linker AB et aux séquences flanquant les marqueurs.

Les séquences centrales du linker sont lues et cartographiées sur le génome. Dans cette vidéo, nous présenterons le protocole chip standard utilisé couramment dans notre laboratoire sur une lignée cellulaire de cancer du sein, MCF seven. D'après nos données, un enrichissement chip plus élevé avec des anticorps spécifiques donne de meilleurs résultats en chair pet. Par conséquent, nous recommandons fortement l'optimisation du protocole chip et la validation de l'enrichissement par QPCR.

Avant de passer à la construction de la bibliothèque pet de chair, cultiver environ sept cellules jusqu'à une confluence d'environ 75 % dans une boîte de culture tissulaire de 500 centimètres carrés, contenant approximativement 20 millions de cellules avant réticulation. Jeter le milieu de croissance et laver les cellules deux fois. Avec du PBS tiède, fixer les cellules à l'aide de 1,5 millimolaire de EGS fraîchement préparé pendant 45 minutes sur un agitateur rotatif à température ambiante, puis ajouter du formaldéhyde à 37 % pour obtenir une concentration finale de 1 % et incuber pendant 20 minutes.

L'efficacité de la réticulation est cruciale et varie selon les lignées cellulaires et la protéine d'intérêt. La concentration, le temps d'incubation et la température de réticulation doivent être optimisés. Éteindre les réticulateurs avec une concentration finale de 200 millimolaire de glycine pendant 10 minutes.

Jetez les réactifs de réticulation inactivés et lavez deux fois avec du PBS froid. Récupérez les cellules en raclant le culot cellulaire à l’aide d’une centrifugeuse de banc réfrigérée. Le culot est désormais prêt pour la lyse cellulaire. Sinon, congélez le culot à moins 80 degrés Celsius. Si le culot cellulaire est congelé, décongelez-le sur de la glace avant de procéder à la lyse cellulaire, puis resuspendez le culot dans un tampon de lyse contenant 0,1 % de SDS.

Faites tourner le tube à quatre degrés Celsius sur une platine rotative avec une centrifugeuse réfrigérée, jetez le surnageant et répétez la lyse cellulaire. Une fois la lyse nucléaire effectuée pour libérer la chromatine réticulée avant la fragmentation de la chromatine. L'absence de membrane nucléaire permet de soniquer la chromatine réticulée dans des conditions plus douces.

Palette nucléaire Reus dans du tampon de lyse contenant 1 % de SDS. Transférez la suspension dans un tube pour centrifugeuse haute vitesse. Faites tourner le tube à quatre degrés Celsius.

Éliminer les débris nucléaires par centrifugation. La palette chromatinienne doit avoir cet aspect. Utiliser une pipette P1000 pour fragmenter la palette et la laver deux fois avec du tampon de lyse SDS 0,1 %.

Faites tourner le tube à quatre degrés Celsius avec une centrifugeuse réfrigérée. Le culot nucléaire est maintenant prêt pour la sonication. Sinon, congélez le culot à moins 80 degrés Celsius.

Transférez le palais dans un tube transparent. Ajoutez du tampon de lyse SDS 0,1 % au palais et éliminez toutes les bulles. Conservez les échantillons au froid pendant toute la sonication afin d'éviter la surchauffe. Différentes conditions telles que le volume de tampon, la profondeur de la sonde, l'intensité de la sonication, le nombre de cycles et le degré de réticulation peuvent influencer l'efficacité de la sonication.

Décross-linker par inversion et aliquoter la chromatine à l'aide de protéinase K, puis réaliser un gel AROS. Pour vérifier l'efficacité de la fragmentation, une optimisation est recommandée afin d'obtenir une gamme de taille d'ADN souhaitée comprise entre 200 et 600 paires de bases. Éliminer les débris cellulaires par centrifugation.

La chromatine est désormais prête à être pré-épurée avec des billes magnétiques. En alternative, elle peut être arrêtée à moins 80 degrés Celsius jusqu'à ce qu'une quantité suffisante de chromatine soit collectée. Pour commencer une analyse, laver les billes trois fois avec le tampon de lavage des billes ; cette étape et les lavages ultérieurs impliquant des billes magnétiques protéiques comprennent les étapes suivantes.

Ajouter la chromatine soniquée aux billes préalablement lavées et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius dans un tube séparé. Recouvrir les billes préalablement lavées d'anticorps et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Laver deux fois les billes recouvertes d'anticorps avec le tampon de lavage des billes.

La forte complexité du substrat pour la ligature par proximité entraîne inévitablement un bruit non spécifique important, augmentant ainsi le coût du séquençage. Outre la réduction du niveau de complexité et du bruit de fond, nous avons utilisé un anticorps monoclonal dirigé contre la polymérase ARN II de souris pour identifier les interactions chromosomiques impliquées dans la régulation de la transcription.

Ceci permet l'étude des promoteurs actifs et de leurs régions régulatrices correspondantes, facilitant la compréhension de la transcription efficace et potentiellement coopérative. Éliminer le tampon de lavage des billes revêtues d'anticorps, combiner la chromatine pré-épurée avec les billes revêtues d'anticorps et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après l'incubation nocturne, les billes sont soumises à une série de lavages afin d'éliminer la chromatine non liée, puis re-suspendre les billes dans un aliquot de tampon TE. Prélever une petite quantité pour un contrôle quantitatif et d'enrichissement. L'analyse des interactions de la chromatine par séquençage pad et tag est une technique développée pour l'analyse à grande échelle *de novo* des structures de chromatine d'ordre supérieur en interaction.

Des fragments d'ADN enrichis par immunoprécipitation de chromatine sont capturés par ligature par proximité. La stratégie « pad et tag » est appliquée à la construction de bibliothèques CHI PET, qui sont séquencées à l'aide de technologies de séquençage à haut débit de nouvelle génération. Dans cette vidéo, nous présenterons les aspects expérimentaux critiques de la construction de bibliothèques CHI PET.

La première moitié de la construction de la bibliothèque implique la manipulation de billes de protéine A ou G, auxquelles les fragments d'ADN sont liés, afin d'éliminer les enzymes et les sels tampons. Après chaque réaction enzymatique, utilisez une centrifugation douce et une action de tapotement pour chaque étape de lavage. Aspirez le surnageant plusieurs fois afin de maximiser la récupération des billes lorsqu'elles sont placées sur un aimant.

Concentrateur pour toutes les étapes d'incubation contenant des billes dans le mélange réactionnel. Préparez le mélange maître à l'avance et ajoutez l'enzyme en dernier, après avoir resuspendu homogènement les billes. Veillez à ce que les billes soient bien mélangées pendant toute la durée de l'incubation. Les oligonucléotides demi-brins sont conçus avec un code-barres interne composé de quatre nucléotides et un site de reconnaissance pour l'enzyme de restriction de type II MME1.

Après la ligation des demi-lieurs aux fragments d'ADN fixés dans les complexes chromatiniques C, les fragments d'ADN en interaction seront reliés par une séquence de lieur complète. Ces demi-lieurs génèrent des séquences avec des lieurs hétérodimères ab provenant de produits de ligation non spécifiques, ou des séquences avec des lieurs homodimères, AA ou BB, provenant de produits de ligation spécifiques. L'utilisation de deux demi-lieurs portant des codes-barres nucléotidiques différents permet donc de distinguer différentes expériences ou réplicats, ainsi que de surveiller les taux de ligation chimérique non spécifique entre différents complexes de puce.

Il est important de préparer la réaction sur de la glace et de décongeler délicatement les demi-lieurs sur de la glace. Mélanger soigneusement les demi-lieurs avec de l'eau, puis avec un tampon de ligase contenant du PEG. S'assurer que le mélange maître est bien homogénéisé avant la resuspension.

Suspendre l'ADN du puces et ajouter la ligase T4 uniquement après que les demi-adaptateurs et les fragments d'ADN du puces soient bien mélangés afin d'éviter la concaténation des demi-adaptateurs. Sceller le tube avec du parafilm. Incuber toute la nuit à 16 degrés Celsius sous agitation. Les complexes de chromatine intacts sont ensuite élus des billes par l'ajout de SDS dans le tampon EB afin d'éluer l'ADN, puis abaisser la concentration de SDS par ajout de Triton X-100 pour neutraliser l'effet du SDS. La circularisation des complexes de chromatine est facilitée par la ligation de deux demi-adaptateurs, créant ainsi une séquence d'adaptateur complète au niveau de la jonction d'interaction. Liger les complexes de chromatine élus dans des conditions extrêmement diluées afin de minimiser les ligations entre différents complexes ADN-protéine, en ajoutant la ligase T4 uniquement après que les complexes de chromatine élus aient été correctement dilués dans le mélange réactionnel. Après la réversion des liaisons croisées, éliminer les protéines associées à l'ADN et purifier les fragments d'ADN circularisés par extraction au phénol-chloroforme, en utilisant le système de gel de verrouillage de phase KaiGen pour une séparation facile.

Après l'extraction au phénol, utilisez le glyco bleu A, un transporteur d'ADN, pour augmenter la masse et la visibilité du palais. Les oligonucléotides demi-brins contiennent des sites de reconnaissance MM E un en séquences flanquantes. L'enzyme de restriction de type deux S MM E un coupe 18 et 20 paires de bases en aval de ses sites de liaison cibles, générant de courtes étiquettes du fragment de chromatine, produisant des constructions d'étiquettes appelées PET (étiquette-PALIERS-étiquette), abrégées en pets.

En outre, chaque demi-liaison est modifiée par du biotine afin de permettre la purification des constructions pet à l’aide de billes magnétiques revêtues de streptavidine. Effectuez une digestion MME1 pour libérer les constructions de liaison portant une étiquette. Purifiez les pets par liaison sélective à des billes Aden greffées, puis liguez les constructions pet avec des adaptateurs destinés au séquençage à haut débit.

Utilisez une ADN polymérase de fusion pour amplifier la bibliothèque de fusion CHI PET. L'ADN polymérase est utilisée pour générer des gabarits avec une grande précision et efficacité. Préparez la réaction de PCR à froid et ajoutez l'ADN polymérase de fusion en dernier.

Étant donné que l'enzyme présente une activité exonucléase trois primes vers cinq primes pouvant dégrader les amorces en l'absence de dNTPs, si la bibliothèque CHiRP est correctement construite, une bande intense et bien définie d'environ 223 paires de bases devrait être observée. Évitez les bandes non spécifiques lors de l'excision de la bande de 223 paires de bases à partir du gel et purifiez la bande excisée en utilisant le protocole de broyage du gel.

Effectuez un contrôle de qualité à l’aide d’un bioanalyseur Agilent 2 100 avec un kit DNA 1000 avant le séquençage à haut débit. Nous venons de démontrer la procédure CHI PET pour la détection sans biais des interactions chromatiniennes à l’échelle du génome. La qualité des données CHI PET dépend de l’efficacité de l’anticorps utilisé pour la technique ChIP et de la profondeur de séquençage.

Ici, nous utilisons de 18 à 20 millions de lectures pour la cartographie des interactions. Ce protocole spécifique a permis de caractériser avec succès les réseaux d'interactions de la chromatine liés au récepteur des œstrogènes et à l'ARN polymérase dans le génome humain. Nous prévoyons que ce dosage deviendra un outil puissant pour les études futures sur l'architecture tridimensionnelle de la biologie de la transcription dans le contexte du génome entier.

Nous espérons que cette vidéo vous sera utile. Merci d'avoir regardé.I.