Modèle murin de l'asthme induit par les allergènes

L’objectif global de l’expérience suivante est de produire un modèle murn de l’asthme. Dans un second temps, les souris sont sensibilisées à la voline par injection intrapéritonéale. Les souris sont stimulées par la voline, soit par voie intratrachéale, soit par nébulisation.

Cela induit une réaction allergique des voies respiratoires similaire à une exacerbation de l’asthme humain et peut être mesuré par provocation à la méthylcholine. De plus, l’infiltration cellulaire dans les voies respiratoires et les taux sériques d’IgE peuvent être quantifiés pour évaluer la gravité de ces caractéristiques typiques de l’asthme. En fin de compte, les souris développent des manifestations semblables à celles de l’asthme, dont la gravité peut être affectée par d’autres manipulations expérimentales.

Ce modèle animal peut aider à répondre à des questions importantes dans le domaine de l’asthme, telles que les effets du traitement avec des médicaments expérimentaux spécifiques ou de la modulation de voies de signalisation spécifiques. Aujourd’hui, ce seront les étudiants diplômés d’Irvin et de Somia dans mon laboratoire. Préparez la solution de sensibilisation en émulsionnant un milligramme par millilitre de voline dans du PBS stérile contenant 10 milligrammes par millilitre d’hydroxyde d’aluminium pour des souris sensibilisées en injectant 200 microlitres de l’inoculum de sensibilisation, ou une solution de contrôle dépourvue de voline intrapéritonéale pour ce protocole.

Sensibilisez les souris comme décrit aux jours zéro et sept. Effectuez ensuite le défi sur d’autres jours, en commençant le jour 14 au 22 pour le défi intra trachéal. Placez la souris anesthésiée sur une surface inclinée.

Accrochez un fil sous les incisives avant de la souris et maintenez la tête en arrière. Ensuite, nivelez la patte pour redresser la trachée et collez les pattes arrière sur le plan de travail. Pour sécuriser la position, trempez le cou et la poitrine de la souris avec de l’éthanol à 70 % et tamponnez avec de la chlorhexidine pour désinfecter le site chirurgical à l’aide d’une pince, pincez la peau de la gorge et tirez-la doucement vers l’avant avec des ciseaux chirurgicaux stériles.

Faites une petite incision verticale. Chargez une seringue d’un millilitre avec 50 microlitres de 0,1 % Volin dans du PBS. Ajustez-le d’une aiguille de calibre 27 et insérez-le d’une main dans une pipette répétitive.

Utilisez des pinces stériles pour exposer la trachée avec l’autre main. Tenez la pipette parallèlement à la trachée. Insérez soigneusement l’aiguille et injectez la solution.

Fermez doucement la plaie et scellez-la avec une suture. Prendre soin de maintenir la stérilité. Placez la souris sur un coussin chauffant et laissez-la récupérer pour le défi par nébulisation.

Utilisez la méthode décrite précédemment pour sensibiliser les souris aux jours zéro et 14. Ensuite, défiez les souris quotidiennement entre le 21e et le 25e jour. Pour relever le défi, placez les souris dans la chambre principale d’un système de pléthysmographie du corps entier et laissez-les s’acclimater pendant au moins 10 minutes.

Ensuite, placez un millilitre de 0,1 % d’albumine dans du PBS stérile dans la coupelle du nébuliseur et nébulisez pendant 30 minutes. Pour effectuer des mesures non invasives de l’hyperréactivité des voies respiratoires, acclimatez les souris à la chambre comme indiqué précédemment. Enregistrez ensuite les lectures de base pendant trois minutes.

Ensuite, placez un millilitre de PBS dans la coupelle du nébuliseur, nébulisez pendant deux minutes et surveillez les variables respiratoires pendant six minutes supplémentaires pendant la phase de séchage après la nébulisation. Cet exemple illustre l’augmentation de la réactivité des voies respiratoires développée par des souris traitées à l’ovalbumine pour effectuer des mesures invasives de l’hyperréactivité des voies respiratoires. Placez la souris anesthésiée sur son dos, désinfectez le cou avec de l’éthanol et de la chlorhexidine, et exposez la trachée comme décrit plus haut dans cette vidéo.

Une fois que la trachée est visible, utilisez des ciseaux fins et stériles pour faire une petite incision. En prenant soin de ne pas sectionner la trachée et en insérant doucement le tube trachéal. Attachez une suture autour de la trachée pour éviter une fuite d’air.

Placez la souris sur son dos et connectez le tube trachéal au ventilateur. Démarrez la ventilation mécanique pour une souris de 20 grammes. Réglez la fréquence respiratoire à 150 coups par minute et le volume courant à 200 microlitres pour les mesures respiratoires de base du cordon.

Ensuite, répétez le test après l’administration de PBS ou des doses croissantes de méthylcholine à travers un nébuliseur à ultrasons. À l’aide de la mesure invasive, la résistance des voies respiratoires et l’élastine pulmonaire peuvent être mesurées comme prévu. Les souris traitées à Volin ont développé une résistance accrue et de l’élastine à la suite du défi.

Après l’euthanasie, exposez la cavité abdominale de la souris, puis utilisez des ciseaux pour percer soigneusement le diaphragme tout en le faisant. Veillez à ne pas percer les poumons ou le cœur. Coupez la cage thoracique.

Ensuite, ponctionnez le cœur à l’aide d’une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 27, et collectez lentement le sang, conservez le sang pour la séparation sérique et l’analyse des anticorps IgE spécifiques des ovules. Ensuite, exposez la trachée et utilisez des ciseaux incurvés pour dégager un chemin en dessous. Passez la pointe d’une pince incurvée sous la trachée, puis attachez un morceau de fil de suture en un demi-nœud lâche autour de la trachée à une position basse dans la gorge.

Une fois le fil en place, faites une petite incision dans la trachée au-dessus du nœud et insérez délicatement une canule dans le trou. Ensuite, appuyez doucement vers l’avant jusqu’à ce qu’il atteigne l’entrée des poumons. Serrez et complétez le nœud.

Connectez ensuite une seringue d’un millilitre contenant du PBS à la canule et injectez doucement le liquide dans les poumons. Observation des poumons gonfler. Veillez à ne pas trop remplir et à ne pas rompre les poumons.

Retirez le liquide de lavage, en tournant doucement ou en appuyant doucement sur la canule un peu plus profondément si vous rencontrez une résistance. Une fois le liquide recueilli, détachez la seringue, transférez le liquide dans un tube sur de la glace. Répétez la procédure deux fois avec du PBS frais.

Après cette procédure, les cellules des voies respiratoires peuvent être isolées par centrifugation comme indiqué ici. Les voies respiratoires des souris sensibilisées et stimulées par la voline contiennent beaucoup plus de cellules totales que celles des souris témoins. À l’aide de différentes colorations rapides, les éosinophiles, les neutrophiles, les macrophages alvéolaires et les lymphocytes peuvent être distingués et comptés.

De plus, on peut voir les souris traitées développer des niveaux plus élevés d’anticorps IgE spécifiques de la voline dans le sérum et le liquide de lavage broncho-alvéolaire après son développement. Ce modèle animal a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’asthme pour explorer les mécanismes sous-jacents à cette maladie importante dans un modèle marin pratique.