Isolement des oligomères de PrP solubles et insolubles dans le cerveau humain normal

L'objectif de cette procédure est d'isoler la protéine pion soluble et insoluble ou PRP de tous les ligaments du cerveau humain normal. Cela est réalisé en homogénéisant d'abord le tissu cérébral humain et en isolant les fractions. Ensuite, une sédimentation en gradient de vitesse dans du saccharose par gradients étagés est effectuée.

Ensuite, une chromatographie par exclusion stérique est réalisée. Enfin, le PRP est capturé à l'aide de la protéine du gène cinq ou G cinq P. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent l'isolement du PRP ou des ligaments solubles et insolubles à partir du cerveau humain normal par ultracentrifugation sur gradients discontinus de saccharose, chromatographie par exclusion stérique et capture du PRP par G cinq P. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la recherche sur les maladies à prions, notamment la maladie de Creutzfeldt-Jakob, l'encéphalopathie spongiforme bovine et les syndromes débilitants cliniques. De plus, elles peuvent fournir des informations sur l'isolement des protéines prioniques solubles et insolubles, non seulement pour les maladies à prions, mais aussi pour d'autres maladies telles que la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson.

En général, les personnes novices dans ces méthodes éprouveront des difficultés car toutes les étapes expérimentales sont importantes et requièrent une attention particulière. La démonstration vidéo de cette procédure est essentielle, car la filtration par exclusion stérique (SEC Fi) est très sensible à la profondeur, et la capture du PRP avec le G cinq P constitue une étape délicate à décrire, qui pourrait s'avérer délicate sans une manipulation plus précise. Pour préparer un homogénat cérébral, commencez par ajouter 100 microlitres de tampon de lyse à 100 milligrammes de tissu cérébral congelé à l’aide d’un broyoir motorisé, homogénéisez le tissu sur de la glace, congélez-le sur de la glace sèche pendant cinq minutes, puis homogénéisez-le à nouveau.

Préparez un homogénat total de cerveau à 20 % ou à 10 % en ajoutant respectivement 300 ou 800 microlitres de tampon de lyse. À l’aide d’une centrifugeuse de banc, centrifugez l’homogénat à 1000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Récupérez le SNA dans un rotor S SW 55 et centrifugez la fraction S1 à 35 000 tr/min pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Transférez le surnageant dans un tube propre pour la resuspension. Suspendez le culot insoluble dans le détergent dans le tampon de lyse afin de préparer les échantillons pour le western blot. Incubez les fractions S2 et P2 avec 50 microgrammes par millilitre de protéinase K pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Arrêter la digestion en ajoutant du PMSF à cinq millimolaire et du tampon d'échantillonnage SDS. Faire bouillir les échantillons pendant 10 minutes, puis les laisser refroidir à température ambiante pendant cinq minutes. Pour effectuer la sédimentation en vitesse, commencer par incuber 450 microlitres de la fraction S 20 % avec un volume égal d'eau 2 % Sarco X sur de la glace pendant 30 minutes dans des tubes de centrifugation de cinq millilitres. Ajouter 0,5 millilitre de chacune des solutions de saccharose à 60, 30, 25, 20, 15 et 10 % ; charger 0,4 millilitre de l'incubat S sur le dessus du gradient de saccharose de 10 à 60 %.

Effectuer une centrifugation en gradient par paliers dans un rotor SW 55 à 48 000 tr/min pendant une heure à quatre degrés Celsius à partir du haut du tube. Recueillir 12 fractions égales de 283 microlitres chacune. Utiliser 20 microlitres de chaque fraction et un volume égal de tampon d'échantillonnage SDS.

Pour préparer les échantillons de gel SDS-PAGE. Faire bouillir les échantillons pendant 10 minutes, puis les incuber pendant quatre minutes. Centrifuger les échantillons à 1000 ×g pendant une minute.

Ensuite, vortexez-les avant de les charger sur un gel préfabriqué à exclusion de taille. La chromatographie est utilisée pour déterminer l'état oligomérique des molécules de PRP. Commencez par charger des volumes d'échantillon de 200 microlitres de sept marqueurs de masse moléculaire individuels sur une colonne de 1 sur 30 de billes SUEx 200 HR.

Utilisez le volume d'élution du dextran bleu comme volume mort. Calculez les volumes d'élution au sommet des pics de VE à partir du chromatogramme et des rétentions fractionnelles. Calculez le coefficient de partition KAV en utilisant l'équation KAV = (V - V₀) / (VT - V₀).

Pour générer une courbe d'étalonnage, tracez le KAV des étalons protéiques en fonction du logarithme du poids moléculaire des étalons. Ensuite, appliquez 200 microlitres de S un à la colonne à un débit de 0,25 millilitre par minute.

Lavez la colonne avec 1 % du tampon de lyse et, à l’aide d’un collecteur de fractions, éluerez des fractions de 0,25 millilitre. Incubez 125 microlitres de chaque fraction avec 500 microlitres de méthanol prérefroidi à moins 20 degrés Celsius pendant deux heures. Centrifugez les échantillons à 13 000 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

Reese, redissoudre le culot dans 20 microlitres de tampon d'échantillonnage SDS et faire bouillir pendant 10 minutes. Ramener à température ambiante et séparer sur des gels de polyacrylamide à 15 %. Utiliser la courbe standard pour extrapoler les masses moléculaires des différentes espèces de PRP récupérées afin de conjuguer la molécule G cinq P aux billes magnétiques.

Incuber 100 microgrammes de G cinq P avec 350 microlitres de billes magnétiques activées par la toci dans un millilitre de PBS à 37 degrés Celsius pendant 20 heures. Utiliser un aimant externe pour attirer les billes de G cinq P contre la paroi latérale des tubes Eppendorf et éliminer la solution. Laver les billes trois fois avec un millilitre de PBS contenant 0,1 % de BSA afin de bloquer les liaisons non spécifiques.

Incuber les billes conjuguées à la G cinq P dans un millilitre de tris 0,2 mol, HCl pH 7,4 contenant 0,1 % de BSA pendant cinq heures à 37 degrés Celsius. Laver ensuite les billes trois fois. Éliminer le dernier lavage et ajouter un millilitre de PBS pour isoler le PRP ; incuber 100 microlitres de S un ou P deux avec 60 microlitres de billes conjuguées à la G cinq B dans un millilitre de tampon de liaison sous rotation constante pendant trois heures à température ambiante.

Placez le tube sur l'aimant. Éliminez la solution et lavez les billes trois fois avec le tampon de lavage. Éliminez le dernier lavage et ajoutez du tampon d'échantillonnage SDS.

Chauffer les billes à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Déposer les échantillons sur des gels préformés à 15 % et faire migrer à 150 volts pendant environ 80 minutes. Transférer les protéines sur du PVDF à 70 volts pendant deux heures après avoir bloqué les membranes dans du lait à 5 % dans du TBST.

Incubez-les pendant deux heures à température ambiante avec les anticorps PRP. Trois F quatre un E quatre anti N ou anti C après incubation avec les anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort, incubez la membrane avec la solution de chimiluminescence selon les instructions du fabricant et exposez le film comme indiqué ici par rapport aux échantillons sporadiques de valvule CRUT de la maladie de Jaakko ou de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (CJD). Une petite quantité de PRP cellulaire insoluble a été détectée dans la fraction P deux provenant de cerveaux normaux.

Cependant, la majeure partie a été récupérée dans la fraction S2. Le PRP insoluble représente environ cinq à 25 % du PRP total, incluant des espèces pleine longueur et tronquées aux extrémités. Des analyses réalisées par sédimentation sur gradient discontinu de saccharose ont révélé que, bien que la majorité du PRPC provenant de cerveaux non atteints de MCJ soit récupérée dans les fractions supérieures, de petites quantités de PRP ont également été détectées dans les fractions inférieures (9 à 11), qui contiennent normalement de grands agrégats. Diverses espèces pathogènes de PRP ou de PRPSc, allant des monomères.

De petits ligaments et de plus grands agrégats ont été isolés par filtration sur gel dans le cerveau avec la maladie de la valve CRUT yakup. De façon surprenante, une faible quantité de grands agrégats ayant une masse moléculaire supérieure à 2000 kilodaltons a également été détectée dans les fractions insolubles des cerveaux normaux. En outre, des dimères et des tétramères de PRPC ont été détectés non seulement dans les fractions insolubles, mais aussi dans les fractions insolubles.

Après traitement par PK et P NGAs. Le PRP capturé par G cinq P a été détecté à l'aide de l'anticorps un E quatre dirigé contre PRP 97 1 0 5 3. Des fragments centraux résistants à la PK, appelés PRP astérisque 20, PRP astérisque 19 et PRP astérisque sept, ont été détectés en migration à 20 kilodaltons, 19 kilodaltons et 7 kilodaltons respectivement.

Cependant, aucun PRP n'a été détecté lorsque l'anticorps one E four a été pré-incubé avec un peptide synthétique ayant une séquence identique à celle de l'épitope one E four, indiquant que les bandes détectées par l'anticorps one E four sont des fragments de PRP. L'anticorps anti C a détecté deux fragments différents de PRP migratoires d'environ 18 kilodaltons et d'environ 12 à 13 kilodaltons. En complément de PRP, méthode ETE 20 Once.

Cette technique peut être réalisée en quatre jours si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler les fractions solubles et insolubles de la PRP polygame dans le cerveau humain inférieur après son développement. Cette technique a ouvert la voie à des recherches sur le destin des informations de confirmation PIP dans le cerveau.