Isolement des oligomères de PrP solubles et insolubles dans le cerveau humain normal

Le but de cette procédure est d’isoler la protéine pion soluble et insoluble ou PRP tous les ligaments du cerveau humain normal. Ceci est accompli en homogénéisant d’abord le tissu cérébral humain et en isolant les fractions. Ensuite, la sédimentation à vitesse dans le saccharose, les gradients d’échelons sont effectués.

Ensuite, une chromatographie d’exclusion stérique est effectuée. Enfin, le PRP est capturé avec la protéine du gène cinq ou G cinq P.En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent l’isolement du PRP ou des ligaments solubles et insolubles du cerveau humain normal par ultracentrifugation dans le saccharose, les gradients de pas, la taille, la chromatographie d’exclusion et la capture du PRP avec G cinq P.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la recherche sur les pré-maladies, y compris crée d’autres maladies du chacal, l’encéphalopathie BO ponton et les maladies débilitantes cliniques. De plus, ils peuvent fournir un aperçu de l’isolement des protéines aga solubles et insolubles, non seulement pour les maladies ioniques, mais aussi pour d’autres maladies telles que la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson.

En général, les personnes qui ne connaissent pas ces méthodes auront du mal car toutes les étapes expérimentales sont importantes, ce qui nécessite des soins supplémentaires. La démonstration vidéo de ce message est essentielle car le SEC Fi est la grandeur de la profondeur et la capture PRP avec G cinq P, ces étapes sont difficiles à nommer et peuvent être justes sans une opération plus précise. Pour préparer un homogénat de cerveau, commencez par ajouter 100 microlitres de tampon de lyse à 100 milligrammes de tissu cérébral congelé à l’aide d’un pilon motorisé, homogénéisez le tissu sur de la glace, congelez-le sur de la glace sèche pendant cinq minutes et homogénéisez-le à nouveau.

Faites un homogénat total du cerveau de 20 % ou 10 % en ajoutant respectivement 300 ou 800 microlitres de tampon de lyse. À l’aide d’une centrifugeuse de paillasse, faites tourner l’homogénat à 1000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Collectez le SNA dans une centrifugeuse à rotor S SW 55 la fraction S une fraction à 35 000 tr/min pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Transférez le supinate dans un tube propre Resus. Suspendre la pastille insoluble dans le détergent dans un tampon de lyse pour préparer les échantillons pour le transfert Western. Incuber les fractions S deux et P deux avec 50 microgrammes par millilitre de protéinase K pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Terminez la digestion en ajoutant cinq tampons PMSF et SDS d’échantillon. Faites bouillir les échantillons pendant 10 minutes et appelez-les à température ambiante pendant cinq minutes Pour effectuer une sédimentation à grande vitesse, commencez par incuber 450 microlitres de la fraction 20 %S avec un volume égal de 2 % d’eau Sarco X sur de la glace pendant 30 minutes dans des tubes à centrifuger de cinq millilitres. Ajoutez 0,5 millilitre de 60, 30, 25, 20, 15 et 10 % de charge de saccharose 0,4 millilitre de l’incubateur S one sur le dessus de 10 à 60 % de saccharose.

Les gradients de gradins centrifugent dans un rotor SW 55 à 48 000 tr/min pendant une heure à quatre degrés Celsius à partir du haut du tube. Collectez 12 fractions égales de 283 microlitres chacune. Utilisez 20 microlitres de chaque fraction et un volume égal de tampon d’échantillon SDS.

Pour préparer des échantillons de gel de page SDS. Faites bouillir les échantillons pendant 10 minutes, puis appelez-les pendant quatre minutes. Centrifuger les échantillons à 1000 G pendant une minute.

Ensuite, vortexez-les avant de les charger sur une exclusion de taille de gel préfabriqué. La chromatographie est utilisée pour déterminer l’état oligomérique des molécules de PRP. Commencez par charger des volumes d’échantillons de 200 microlitres de sept marqueurs de masse moléculaire individuels sur une colonne d’une colonne sur 30 de billes SUEx 200 HR.

Utilisez le volume elucian de dextran bleu comme volume de vide. Calculez les volumes éluciens de crête de VE à partir du chromatogramme et des rétentions fractionnelles. Calculez KAV le coefficient de partition à l’aide de l’équation KAV est égal à V moins V zéro sur VT moins V zéro.

Pour générer une courbe d’étalonnage. Tracer le KAV des étalons de protéines par rapport au poids moléculaire logarithmique des étalons. Ensuite, appliquez 200 microlitres de S un dans la colonne à un débit de 0,25 millilitre par minute.

Laver la colonne avec un tampon de lyse 1 % cile et à l’aide d’un collecteur de fractions élué 0,25 millilitre de fractions. Incuber 125 microlitres de chaque fraction avec 500 microlitres de méthanol pré-refroidi à moins 20 degrés Celsius pendant deux heures. Centrifuger les échantillons à 13 000 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

Reese, pliez la pastille dans 20 microlitres de tampon d’échantillon SDS et faites bouillir pendant 10 minutes. Appelez à température ambiante et résolvez sur des gels de poly acrylamide à 15 %. Utilisez la courbe standard pour extrapoler les poids moléculaires des différentes espèces de PRP récupérées afin de conjuguer la molécule G cinq P aux billes magnétiques.

Incuber 100 microgrammes de G five P avec 350 microlitres de billes magnétiques activées par le toci dans un millilitre de PBS à 37 degrés Celsius pendant 20 heures. À l’aide d’un aimant externe, attirez les billes G cinq P sur la paroi latérale des tubes eppendorf et retirez la solution. Lavez les billes trois fois avec un millilitre de PBS 0,1 % BSA pour bloquer les fixations non spécifiques.

Incuber les billes conjuguées G five P dans un millilitre de 0,2 molo tris, HCL pH 7,4 contenant 0,1 % BSA pendant cinq heures à 37 degrés Celsius. Lavez ensuite les perles trois fois. Retirez le dernier lavage et ajoutez un millilitre de PBS pour isoler le PRP incubez 100 microlitres de S un ou P deux avec 60 microlitres de billes conjuguées G cinq B dans un millilitre de tampon de liaison sous rotation constante pendant trois heures à température ambiante.

Placez le tube sur l’aimant. Retirez la solution et lavez les billes trois fois avec un tampon de lavage. Retirez le lavage final et ajoutez le tampon d’échantillon SDS.

Faites chauffer les perles à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Chargez les échantillons sur des gels préfabriqués à 15 % et faites-les fonctionner à 150 volts pendant environ 80 à 80 minutes. Transférez les protéines dans du PVDF à 70 volts pendant deux heures après avoir bloqué les membranes dans le lait à 5 % dans le TBST.

Incuber pendant deux heures à température ambiante avec les anticorps PRP. Trois F, quatre, un E, quatre, anti N ou anti C après incubation avec des anticorps secondaires conjugués HRP incuberont la membrane et la solution de chimiluminescence selon les instructions du fabricant et exposent le film comme on le voit ici par rapport à des échantillons sporadiques de la valve CRUT, de la maladie de Jaakko ou de la MCJ. Une petite quantité de PRP cellulaire insoluble a été détectée dans la fraction P deux des cerveaux normaux.

Cependant, la majeure partie a été récupérée dans la fraction S deux. Les analyses d’espèces tronquées sur toute la longueur et à l’extrémité à l’aide d’une sédimentation par gradient de saccharose ont révélé que si la majeure partie du PRPC des cerveaux non atteints de la MCJ a été récupérée dans les fractions supérieures, une ou trois petites quantités de PRP ont également été détectées dans les fractions inférieures neuf 11 qui contiennent normalement de gros agrégats. Une variété d’espèces pathogènes de PRP ou PRP SC, allant des monomères.

Des ligaments plus petits et des agrégats plus gros ont été isolés par filtration sur gel dans le cerveau avec la maladie de yakup de la valve CRUT. Étonnamment, une petite quantité d’agrégats plus grands avec un sillage moléculaire supérieur à 2000 kilodaltons a également été détectée dans des fractions insolubles de cerveaux normaux. De plus, les dimères et les tétramères de PRPC ont été détectés non seulement dans les fractions insolubles, mais aussi dans les fractions insolubles.

Après un traitement PK et P NGA. Le PRP capturé par G five P a été détecté avec l’anticorps un E quatre contre le PRP 97 1 0 5 3. Des fragments de carottes résistants à la PK appelés astérisque PRP 20, ASTÉRISQUE PRP 19 et ASTÉRISQUE PRP 7 ont été détectés en migration à 20 Dawson tueurs, 19 kilodaltons et sept kilodaltons respectivement.

Cependant, aucun PRP n’a été détecté lorsque l’anticorps E quatre a été pré-incubé avec un peptide synthétique dont la séquence est identique à l’épitope E quatre, ce qui indique que les bandes détectées par un E quatre sont des fragments de PRP. L’anticorps anti-C a détecté deux fragments différents de PRP migrant à environ 18 kilodaltons et environ 12 à 13 kilodaltons. En plus de la méthode PRP ETE 20 Once.

Cette technique peut être réalisée en quatre jours si elle est correctement exécutée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler le polygame PRP soluble et insoluble dans le cerveau humain inférieur après son développement. Cette technique a ouvert la voie à la recherche sur le sort des informations de confirmation de PIP dans le cerveau.