Name: À long terme des essais de toxicité létale avec le Crustacé Artemia franciscana /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Découvrez un protocole standardisé pour évaluer la toxicité létale à long terme sur Artemia franciscana. Cette méthode de 14 jours permet de déterminer les concentrations mortelles des polluants marins.

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Produit par Loredana Manfra de l&#39;Institut pour la protection de l&#39;environnement et de la recherche (ISPRA-ministère de la surveillance de la qualité de l&#39;environnement) et Federica Savorelli de l&#39;Agence régionale pour la protection de l&#39;environnement (Emilie-Romagne, Italie). Membres de référence pour le Groupe de travail sur les sous-le crustacé Artemia au sein du Groupe des méthodes biologiques - Saltwater / eau saumâtre et des sédiments de la Commission sur la qualité de l&#39;eau UNICHIM (l&#39;institut de normalisation technique d&#39;exploitation dans le secteur de la chimie). Vidéographie et montage par Marco Pisapia de l&#39;ISPRA (Web de l&#39;Unité). Coordination de la production par Anna Maria Cicéron et Erika Magaletti de l&#39;ISPRA (ministère de la surveillance de la qualité de l&#39;environnement). Nous tenons à remercier l&#39;Agence régionale pour la protection de l&#39;environnement de l&#39;Emilie-Romagne, Ferrare Direction, le Groupe des méthodes biologiques - Saltwater / saumâtreEau et des sédiments de la Commission sur la qualité de l&#39;eau UNICHIM et Luciana Migliore, l&#39;Université Tor Vergata (Rome) pour leur coopération; Rossella Boscolo et Massimo Gabellini de l&#39;ISPRA (Département de la prévention et l&#39;atténuation des impacts) pour leur soutien financier; Fabio Matassa et la London École de langues à Rome pour leur soutien linguistique.

1. La méthode standard Notre test consiste à exposer les larves d&#39;Artemia à un intervalle de concentrations de la substance ou un échantillon d&#39;essai pour la détermination des niveaux de concentration ou de dilution qui causent la mort de 50% des organismes (CL 50) exposés pendant 14 jours et répondant aux conditions définies par cette méthode. Si nécessaire et possible, celui-ci peut également être déterminée: a) le niveau de concentration qui provoque la mort de 20% des organismes exposés (LC 20); b) le niveau le plus élevé de concentration qui n&#39;a pas analysé de déterminer un taux de mortalité plus élevé que celui de le contrôle négatif (CSEO), le niveau plus faible concentration testée qui détermine, après 14 jours, soit un taux de mortalité plus élevé que celui du contrôle négatif (CMEO). 2. Testing Materials 2.1 oeufs d&#39;Artemia Pour effectuer des tests, Artemia franciscana </emLarves&gt; de moins de 48 heures anciennes (nauplii) sont tenus, au stade II ou III, obtenue à partir des œufs nouvellement écloses 5. Oeufs certifiés ou des kystes utilisés pour soutenir les essais sont disponibles dans le commerce, par exemple, de la Division de la recherche d&#39;Assurance Qualité, US Environmental Protection Agency, Cincinnati OH 45268, États-Unis ou du laboratoire de recherche biologique dans la pollution aquatique, Université de Gand, en Belgique. 2,2 dilution de l&#39;eau D&#39;eau salée synthétique peut être utilisé comme eau de dilution, préparée en dissolvant reconnus réactifs de qualité analytique ou une formulation disponible dans le commerce dans l&#39;eau distillée ou désionisée. Mélanges de sel pour la création de l&#39;eau salée idéale sont disponibles dans le commerce, par exemple, les mélanges Instant Ocean. Il est recommandé une eau de dilution à une salinité égale à 35 (± 2) ainsi que PSU une concentration en oxygène dissous supérieure à 80% de la valeur de saturation et une température de 25 (± 2) etdeg; C Après l&#39;aération pendant 48 heures et de filtration dans des filtres de porosité d&#39;au moins 0,45 m, la dilution peut être conservé pendant un maximum de 30 jours dans l&#39;obscurité à une température de 0-4 ° C. 2.3 Culture des algues Il est recommandé que les organismes d&#39;essai sont l&#39;alimentation sur la Dunaliella tertiolecta microalgues, qui se développent de façon exponentielle et atteignent des densités de 1.3x10 6 - 2.0x10 6 cellules / ml. Les essais sur les échantillons de l&#39;environnement exige des cultures avec des densités supérieures à 2,0.10 6 cellules / ml 6. Il est suggéré que Dunaliella tertiolecta pousse dans un milieu de culture contenant l&#39;eau de mer (30 (± 2) et 20 PSU (± 1) ° C) avec l&#39;ajout de nutriments essentiels, des minéraux et des vitamines. Quelques indications sur la composition des algues médias et la préparation sont rapportés dans l&#39;annexe. La densité cellulaire initiale est suggéré à environ 10 5 cellules / ml. La culture d&#39;algues est maintenu dans unthermostat d&#39;ambiance à 20 (± 1) ° C, éclairé par des lampes fluorescentes 3000 (± 300) lx, avec un ratio photopériode de 16 heures de lumière à 8 heures d&#39;obscurité. Autres espèces de phytoplancton pourrait également être utilisé pour l&#39;alimentation, mais il serait nécessaire de faire des études comparatives avec ces espèces de phytoplancton pour trouver les «équivalent» à Dunaliella espèces tertiolecta, parce que les conditions expérimentales (par exemple des densités cellulaires initiales, l&#39;éclairage de lumière, température, composition de la milieux de culture et temps d&#39;exposition) varie selon les espèces de phytoplancton. Outre la tolérance de la micro-algues à différents polluants doit être pris en compte car les effets des polluants sur la croissance et le développement de l&#39;impact du phytoplancton aussi à l&#39;Artemia. 2,4 substance de référence La substance de référence dans ce test est le dodécylsulfate de sodium. 2.5 Verrerie de laboratoire <ol><li> Conteneurs d&#39;essais, y compris 100 ml béchers en verre de borosilicate (18 pour effectuer des tests et 18 pour le transfert de solutions). </li><li> Un flacon (flacon de 500 ml par exemple) pour préparer la solution standard. </li><li> Six flacons (par exemple 200 flacons ml) de préparer les solutions de test. </li><li> Verre ou polystyrène 5 cm de diamètre des boîtes de Pétri avec amovible couvre à être utilisé pour activer les kystes et transférer Artemia de l&#39;antenne d&#39;éclosion pour les récipients d&#39;essai. </li><li> Pipettes Pasteur en verre (avec des pointes arrondies par la flamme) pour transférer les nauplii. </li><li> Verre canules ou Pasteur 3 ml pipettes en plastique jetables (à couper) pour transférer Artemia. </li><li> Micropipettes et pipettes graduées pour préparer les solutions de test. </li><li> Six éprouvettes graduées (par exemple 50 ml cylindres) pour le transfert de solutions de test à partir des flacons à til tester les conteneurs. </li></ol> 3. Activation kyste 3,1. Boîtes de Pétri contenant des kystes + de verser de l&#39;eau Pour générer les organismes d&#39;essai, 20 mg de kystes sont placés dans une boîte de Pétri contenant 12 ml d&#39;eau de dilution de 48 heures avant le test. 3,2. L&#39;incubation à la lumière et dans l&#39;obscurité La boîte de Pétri est maintenue à 25 (± 2) ° C et à une 4000 (± 1000) lux (lumens par mètre carré) intensité de la lumière pendant une heure. 3,3. Remplacement de la moyenne à l&#39;aide du microscope Après 24 heures, les larves sont transférées dans l&#39;éclosion d&#39;un nouveau plat de Pétri remplie d&#39;eau artificielle. Le transfert est effectué à l&#39;aide du microscope, c&#39;est à dire en utilisant une source de lumière de telle sorte que l&#39;éclosion, les larves migrent vers phototropique le faisceau de lumière. Une pipette Pasteur en verre est utilisé pour effectuer le transfert, veiller à ce que seules les larves naissant are transférées et non les kystes ou les larves encore dans les membranes. 3,4. L&#39;incubation dans l&#39;obscurité Le plat contenant les larves est placé dans une chambre noire thermostatique pour 24 heures à 25 (± 2) ° C. 4. Préparation des solutions d&#39;essai 4,1. Pesant la substance + de transférer dans le ballon Il est recommandé que la solution standard pour la substance de test est préparée en dissolvant 0,5 g de la substance dans un flacon de 500 ml. Le ballon est rempli avec de l&#39;eau déminéralisée ou distillée et la solution est agitée jusqu&#39;à ce que la substance de test est complètement dissous. Des solutions doivent être préparés au moment de l&#39;utilisation, sauf si on ne sait pas si la substance est stable en solution. Dans ce cas, la solution standard peut être préparée jusqu&#39;à deux jours avant les tests. 4,2. Préparation du contrôle négatif, ajoutant de l&#39;eau de dilution et les algues wie la pipette de 10 ml Le contrôle négatif est préparée dans un flacon (par exemple le volume de 200 ml) en ajoutant une aliquote de la suspension d&#39;algues à l&#39;eau de dilution de telle sorte qu&#39;une densité de 10 5 cellules / ml est obtenue. 4,3. Préparation des solutions de test: ajouter de l&#39;eau de dilution, les algues et solution standard Il est suggéré que des solutions de test sont préparés dans cinq flacons 200 ml en ajoutant la solution standard pour l&#39;eau de dilution dans les quantités spécifiées de telle sorte que les concentrations souhaitées pour les tests est obtenu. Pour nourrir les organismes, des parties aliquotes d&#39;une suspension Dunaliella microalgues tertiolecta peuvent être utilisés et ajoutés à atteindre une densité de 10 5 cellules / mL lorsque des solutions de test sont préparés. L&#39;ordre de plus il est recommandé: l&#39;eau de dilution, la suspension d&#39;algues et de solution standard. Après la préparation de solutions de test, ils doivent être utilisés dans le test dès que possible. 4,4. Transfert des solutions à partir du ballon à des conteneurs de test, puis aux boîtes de Pétri Des quantités égales (50 ml) des solutions de test sont introduits dans les récipients d&#39;essai utilisant le cylindre gradué. Trois répliques pour chaque concentration sont faites. Pour chaque série de tests, un conteneur de contrôle est préparé avec une quantité d&#39;eau de dilution égal au volume des solutions de test. Des volumes égaux (environ 12 ml) des solutions de test sont introduits dans les boîtes de Pétri. Pour chaque série de tests, un plat de contrôle de Petri est utilisée. 5. Préparation pour les essais 5.1. Nauplii au stade II-III Quarante-huit heures après l&#39;activation du kyste, les nauplii atteindre le stade II-III des larves et sont ensuite utilisables pour les tests. 5,2. Transfert Nauplii dans les boîtes de Pétri à l&#39;aide du microscope La boîte de Petri utilisé pour un kyste<html> activation est retiré de la chambre thermostatique. Une petite quantité de larves sont transférées dans les boîtes de Pétri contenant le contrôle et les solutions de test. Cette tâche doit être effectuée avec le microscope en utilisant une pipette de diamètre suffisamment large afin que les organismes ne soient pas endommagés. Dans cette phase de l&#39;essai, le transfert peut être effectué avec une pipette Pasteur en verre (avec bout arrondi par une flamme) et une source de lumière positionnée latéralement qui encourage l&#39;Artemia à l&#39;agrégation. 5,3. Transfert Nauplii des boîtes de Pétri dans les récipients d&#39;essai avec le microscope Dix larves sont transférées à partir des plats de test solutions de Pétri aux récipients d&#39;essai. De plus, cette opération doit être effectuée en utilisant la pipette Pasteur et le microscope. Il est recommandé que le volume n&#39;excède pas 1 ml est transféré lors du passage des larves de ne pas affecter le volume global du système d&#39;essai. e_step &quot;&gt; 5.4. Les conteneurs pleins recouverts de parafilm Les béchers essais sont couverts avec du parafilm (en laissant un espace pour le passage de l&#39;air), et maintenu à une température de 25 (± 2) ° C pendant toute la durée de l&#39;essai et à un éclairement de 900 (± 100) lx avec une photopériode ratio de 14 heures de lumière à 10 heures d&#39;obscurité. 6. Remplacement du Supplément de moyen et de l&#39;Alimentation 6,1. Le taux de survie de contrôle Deux jours après le test a commencé, et puis après quelques jours 5, 7, 9 et 12, l&#39;Artemia est observée au microscope afin de vérifier le taux de survie et de remplacer le support et le complément alimentaire. Nombre d&#39;organismes vivants est compté dans chaque récipient d&#39;essai. Après observation au microscope et une légère stimulation mécanique (par exemple de toucher les larves avec une pipette Pasteur en verre) les organismes qui ne présentent pas un mouvement pendant environ 10 secondes devrait être considérée comme morte. 6,2. Préparation d&#39;une solution de test montrant l&#39;échantillonnage d&#39;algues avec une pipette de 10 ml et d&#39;échantillonnage de la substance à tester avec une micropipette. Transfert des solutions du ballon aux récipients d&#39;essai Alors que les essais, les solutions d&#39;essai doivent être remplacés périodiquement, et préparé dans la même journée car ils doivent être utilisés. Les solutions d&#39;essai sont fabriqués à partir de la solution standard préalablement préparé. 6.3. Transfert Artemia, en utilisant une coupe pipette Pasteur, à partir des récipients d&#39;essai de vieux aux trois nouveaux conteneurs Le transfert de l&#39;Artemia est effectuée en utilisant une pipette d&#39;un diamètre suffisamment large pour ne pas endommager les organismes. Pendant cette phase, de 3 ml en plastique pipette Pasteur (à couper) peuvent être utilisés. 6,4. Les larves dans un bécher contenant soit vivant ou mort Artemia Après 1<html> 4 jours d&#39;exposition à la fin de l&#39;essai, le nombre de larves survivantes est compté et enregistré sur la feuille de calcul. CL 50 et / ou LC 20, CSEO et la CMEO de 14 jours, sont calculées et enregistrées, ainsi que les limites de confiance à 95% lorsque des méthodes appropriées, et le calcul. 7. Les résultats représentatifs À la fin de l&#39;essai (14 jours), calculer le pourcentage de mortalité à chaque concentration, selon la formule suivante: (M s / N) * 100 Où: M s est le nombre moyen de personnes sont mortes dans l&#39;échantillon analysé N est le nombre total de personnes exposées Le tableau 1 présente un exemple de données d&#39;un test (14d) avec Artemia exposés à dodécyl sulfate de sodium. <table border="1"><tbody><tr><td> Concentrations (mg / L) </td>&quot;&gt; Nombre de personnes sont mortes dans chaque réplique </td><td> Mortalité (%) </td></tr><tr><td></td><td> Je </td><td> II </td><td> III </td><td></td></tr><tr><td> Contrôle négatif </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1,56 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3,12 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 13 </td></tr><tr><td> 6,25 </td><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 27 </td></tr><tr><td> 12,5 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 90 </td></tr><tr><td> 25,0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 50,0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> En outre, de déterminer laCL 50 par un complot graphique gaussien logarithmique soit en utilisant des méthodes statistiques appropriées (par exemple de Spearman-Karber ou la méthode Probit). Le calcul de la CL 50 pour les données du tableau 1 est de 8,18 (de 7,15 à 9,37) mg / l. Si la concentration maximale testée a provoqué une baisse du taux de mortalité de 50%, vous ne devriez pas procéder au calcul de la valeur CL 50 qui serait alors peu fiables, voire non-calculable. Dans ce cas, cependant, serait approprié de répéter le test en étendant la gamme des concentrations testées. Alternativement, la valeur CL 50 est plus correctement exprimée comme supérieure à la plus forte concentration testée, indiquant peut-être le pourcentage de mortalité à la plus forte concentration testée et la plus forte concentration correspondant à un effet non. Les résultats sont considérés comme valides si à la fin de tester les conditions suivantes sont réunies: <ol class="lalpha"><li> le contrôle de taux de mortalité moyenest ≤ 20%; </li><li> où utilisant dodécylsulfate de sodium, le LC 50 à 14 jours est comprise dans l&#39;8,0 (± 5) mg / l intervalle. </li></ol> Si les conditions ci-dessus n&#39;ont pas été respectées, toutes les données obtenues avec le même lot d&#39;organismes devraient être considérés comme nuls et des tests répétés.

<ol><li>Togulga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Short-Term+Toxicity+of+Two+Toxicants+to+Artemia+Nauplii%5BTitle%5D)+AND+%22Tr.+J.+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">The Short-Term Toxicity of Two Toxicants to Artemia Nauplii.</a> Tr. J. of Zoology. 22, 259-266 (1998).</li>
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<li>Varo, I., Navarro, J. C., Amat, F., Guilhermino, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+cholinesterases+and+evaluation+of+the+inhibitory+potential+of+chlorpyrifos+and+dichlorvos+to+Artemia+salina+and+Artemia+parthenogenetica%5BTitle%5D)+AND+%22Chem%22%5BJournal%5D)">Characterisation of cholinesterases and evaluation of the inhibitory potential of chlorpyrifos and dichlorvos to Artemia salina and Artemia parthenogenetica.</a> Chem. 48, 563-569 (2002).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Artemia est l&#39;un des organismes d&#39;essai les plus précieuses disponibles pour des essais d&#39;écotoxicité et de la recherche fait jusqu&#39;ici nous permet d&#39;affirmer qu&#39;il est possible de maintenir plusieurs options relatives à l&#39;utilisation d&#39;Artemia en toxicologie et écotoxicologie. Les caractéristiques qui font de cette organisme dans une espèce appropriée pour des essais biologiques sont les suivants: une répartition géographique large, une grande adaptabilité aux condition...

Produit par Loredana Manfra de l&#39;Institut pour la protection de l&#39;environnement et de la recherche (ISPRA-ministère de la surveillance de la qualité de l&#39;environnement) et Federica Savorelli de l&#39;Agence régionale pour la protection de l&#39;environnement (Emilie-Romagne, Italie). Membres de référence pour le Groupe de travail sur les sous-le crustacé Artemia au sein du Groupe des méthodes biologiques - Saltwater / eau saumâtre et des sédiments de la Commission sur la qualité de l&#39;eau UNICHIM (l&#39;institut de normalisation technique d&#39;exploitation dans le secteur de la chimie). Vidéographie et montage par Marco Pisapia de l&#39;ISPRA (scientifique consultatif et services de documentation). Coordination de la production par Anna Maria Cicéron et Erika Magaletti de l&#39;ISPRA (ministère de la surveillance de la qualité de l&#39;environnement). Nous tenons à remercier l&#39;Agence régionale pour la protection de l&#39;environnement de l&#39;Emilie-Romagne, Ferrare et la Direction générale de BiologiCal Groupe Méthodes - Saltwater / eau saumâtre et des sédiments de la Commission sur la qualité de l&#39;eau UNICHIM de leur coopération; Rossella Boscolo et Massimo Gabellini de l&#39;ISPRA (Département de la prévention et l&#39;atténuation des impacts) pour leur soutien financier, et la London School of Languages ​​à Rome pour leur soutien linguistique. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de l&#39;article </td></tr><tr><td> Dodécyl sulfate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L4390 </td></tr></tbody></table> Appendice La algues médias doit être préparé en utilisant des réactifs de qualité analytique. Un litre de solution nutritive est préparée en dissolvant 300 g de NaNO 3, 30 g de KH 2 PO 4 g et 20 de NH 4 Cl dans l&#39;eau distillée. Quatre solutions de départ (A, B, C, D) De minéraux sont préparés comme suit: <ul><li> Un litre de solution &quot;A&quot; contenant 30 g de ZnSO 4 H 2 O, 25 g de CuSO 4 5 H 2 O, 30 g de CoSO 4 7 H 2 O et 20 g de MnSO 4 H 2 O dans l&#39;eau distillée; </li><li> Un litre de solution &quot;B&quot; contenant 50 g de FeCl 3 • 6 H 2 O dans l&#39;eau distillée; </li><li> Un litre de solution de &quot;C&quot; contenant 25 g de Na 2 MoO 4 • H 2 O 2 dans de l&#39;eau distillée; </li><li> Un litre de solution de &quot;D&quot; contenant 50 g de Na 2 EDTA di • H 2 O 2 dans de l&#39;eau distillée. </li></ul> Un litre d&#39;une solution définitive de minéraux (solution &quot;E&quot;) est obtenu en ajoutant des aliquotes des solutions mentionnées ci-dessus à l&#39;eau distillée. L&#39;ordre de plus il est recommandé: 100 ml de solution &quot;D&quot;, 10 ml de solution «C», 10 ml de solution «B» et 10 ml de solution «A». Trois initiativessolutions L (F, G, H) de vitamines sont préparés comme suit: <ul><li> Un litre de solution de «F», contenant 100 mg de biotine dans l&#39;eau distillée; </li><li> Un litre de solution &quot;G&quot; contenant 10 g de thiamine dans l&#39;eau distillée; </li><li> Un litre de solution &quot;H&quot; contenant 100 mg de cobalamine dans l&#39;eau distillée. </li></ul> Un litre d&#39;une solution définitive de vitamines (solution «I») est obtenu en ajoutant 10 ml des trois solutions initiales à l&#39;eau distillée. Un litre de l&#39;algue des médias est préparée par dissolution de 1 ml de la solution nutritive, 1 ml de la solution finale minérale (solution «E») et 1 ml de la solution finale en vitamine (solution «I») dans l&#39;eau de mer. Ce dernier peut être obtenue par dissolution reconnus réactifs de qualité analytique ou une formulation disponible dans le commerce dans l&#39;eau distillée ou désionisée. Mélanges de sel pour la création de l&#39;eau salée idéale sont disponibles dans le commerce, par exemple, les mélanges Instant Ocean. Il est recommanDed l&#39;aide d&#39;une eau de mer dont la salinité est de 30 (± 2) PSU et de la température de 20 (± 1) ° C.

À long terme des essais de toxicité létale avec le crustacé artemia franciscana</em

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Nos activités de recherche cibler l&#39;utilisation de méthodes biologiques pour l&#39;évaluation de la qualité de l&#39;environnement, avec une référence particulière à l&#39;eau salée / eau saumâtre et les sédiments. Le choix des indicateurs biologiques doivent être fondées sur des connaissances scientifiques fiables et, éventuellement, de la disponibilité des procédures normalisées. Dans cet article, nous présentons un protocole standardisé qui a utilisé la crustacés marins Artemia pour évaluer la toxicité des produits chimiques et / ou de marins matrices environnementales. Des scientifiques proposent que la crevette de saumure (Artemia) est un candidat approprié pour le développement d&#39;un bio-essai standard pour l&#39;utilisation dans le monde entier. Un certain nombre de documents ont été publiés sur les effets toxiques des produits chimiques divers et des substances toxiques sur la crevette de saumure (Artemia). L&#39;avantage majeur de ce crustacé pour les études de toxicité est la disponibilité globale des kystes secs; ceux-ci peuvent être immédiatement utilisés dans les essais et la culture difficile n&#39;est pas exigé <sup&gt; 1,2. Essais de toxicité Cyst-base ne coûtent pas cher, disponible en permanence, simple et fiable et sont donc une réponse importante aux besoins de routine de dépistage de la toxicité, pour les besoins de surveillance industriels ou à des fins réglementaires 3. La méthode proposée consiste à la mortalité comme critère d&#39;évaluation. Les chiffres de survivants ont été comptés et le pourcentage de décès ont été calculés. Les larves ont été considérés comme morts si elles ne présentent pas de tout mouvement interne ou externe pendant plusieurs secondes d&#39;observation 4. Cette procédure était de tests normalisés d&#39;une substance de référence (dodécyl sulfate de sodium); certains résultats sont rapportés dans ce travail. Cet article accompagne une vidéo qui décrit les performances des tests de toxicité de la procédure, montrant toutes les étapes liées au protocole.

Cette étude concerne le développement et la standardisation d&#39;un protocole méthodologique précieux pour déterminer à long terme (14 jours) toxicité létale exercée par des substances chimiques, les eaux usées industrielles ou des eaux usées et liquides des échantillons environnementaux sur le crustacé d&#39;eau salée,<em&gt; Artemia franciscana</em&gt;.

À long terme des essais de toxicité létale avec le Crustacé Artemia franciscana</em

Nos activités de recherche portent sur l'utilisation de méthodes biologiques pour l'évaluation de la qualité environnementale, avec une référence particulière aux milieux d'eau salée/saumâtre...

Nous sommes Laura Manfra et Federica Selli, chercheuses à l'Institut supérieur pour la protection et la recherche environnementales, ISRA, département du Laboratoire de surveillance de la qualité environnementale, Phytoplancton, éco-toxicologie et écologie. Nos activités de recherche visent l'utilisation de méthodes biologiques pour l'évaluation de la qualité environnementale, en particulier en ce qui concerne l'eau salée, l'eau saumâtre et les sédiments. Notre dernière étude porte sur le développement et la standardisation d'un protocole méthodologique pertinent permettant de déterminer la toxicité létale à long terme, sur 14 jours, exercée par des substances chimiques, des déchets industriels, des eaux usées, des eaux d'égout ou des échantillons environnementaux liquides sur le crustacé marin *Artemia franciscana*.Ce vidéo décrit la réalisation de tests de toxicité procédurale. Nos essais consistent à exposer des larves d'artia à une série de concentrations de substance ou à un échantillon test afin de déterminer la concentration ou les niveaux de dilution entraînant la mort de 50 % des organismes exposés au cours de 14 jours, tout en respectant les conditions définies par cette méthode. Si nécessaire et possible, les éléments suivants peuvent également être déterminés.Niveau de concentration provoquant la mort de 20 % des organismes exposés, le niveau de concentration analysé le plus élevé n'entraînant pas un taux de mortalité supérieur à celui du témoin négatif, et le niveau de concentration testé le plus bas entraînant après 14 jours un taux de mortalité supérieur à celui du témoin négatif. Pour effectuer les tests, notre équipe a requis des larves de Franciscain âgées de moins de 48 heures au stade deux ou trois, obtenues à partir d'œufs fraîchement éclos. Vous pouvez utiliser de l'eau de mer synthétique comme eau de dilution, préparée en dissolvant des réactifs de qualité analytique reconnue ou une formulation commercialement disponible dans de l'eau distillée ou déionisée.Après une agitation pendant 48 heures et une filtration sur des filtres d'une porosité d'au moins 0,45, vous pouvez conserver la dilution pendant un maximum de 30 jours à l'abri de la lumière. À une température de zéro à quatre degrés, vous devez nourrir les organismes d'essai Ella Ter avec des microalgues, qui croissent de façon exponentielle à des densités comprises entre 1,3 × 10⁶ et 2,0 × 10⁶ cellules par millilitre. La substance de référence dans cet essai est le dodécylsulfate de sodium.En plus du matériel de laboratoire habituel, vous aurez également besoin des récipients de test suivants : des béchers en verre borosilicaté de 100 millimètres, un flacon de 500 millimètres pour préparer la solution étalon, six flacons de cent millimètres pour préparer les solutions d'essai, des boîtes de Pétri en verre ou en poly de cinq centimètres de diamètre avec couvercles amovibles, utilisées pour activer les kystes et transférer les arties du plat d'éclosion vers les récipients de test. Des pipettes Pasteur en verre dont les extrémités ont été arrondies à la flamme pour transférer les noli, ou des pipettes en plastique jetables de trois millilitres à couper pour transférer les arties, des micropipettes et des pipettes graduées pour préparer les solutions d'essai. Six cylindres gradués de 50 millilitres pour transférer les solutions d'essai depuis les flacons vers les récipients de test afin de produire les organismes d'essai.Mettre 20 milligrammes de kystes dans une boîte de Pétri contenant 12 millilitres d'eau de dilution 48 heures avant le test. Maintenir la boîte à 25 degrés et à une intensité lumineuse de 4 000 lumens par mètre carré pendant une heure. Après 24 heures, transférer les larves éclosent dans une nouvelle boîte de Pétri remplie d'eau artificielle.Effectuez le transfert au microscope en utilisant une source lumineuse afin que les larves phototropes nouvellement écloses migrent vers le faisceau lumineux. Utilisez une pipette Pasteur en verre pour effectuer le transfert, en veillant à ne transférer que les larves naissantes et ni les kystes eux-mêmes ni les larves encore entourées de membranes. Placez la boîte contenant les larves dans une chambre thermostatée sombre pendant encore 24 heures à 25 degrés.La solution standard du produit à tester doit être préparée en dissolvant un demi-gramme de la substance dans une fiole de 500 millilitres. Compléter avec de l'eau déionisée ou distillée et agiter jusqu'à dissolution complète. Les solutions doivent être préparées au moment de l'utilisation, sauf si vous ne savez pas si la substance est stable en solution.Dans ce cas, vous pouvez préparer la solution étalon jusqu'à deux jours avant l'essai. Vous devez préparer le témoin négatif dans un flacon de 200 millilitres en ajoutant une quantité adéquate d'une suspension algale à l'eau de dilution de manière à obtenir une densité de 10 élevée à la puissance 5 cellules. Les solutions d'essai doivent être préparées dans des flacons de 5 à 100 millilitres en ajoutant la solution étalon à l'eau de dilution dans la quantité spécifiée afin d'obtenir les concentrations souhaitées pour l'essai.Pour nourrir les organismes, vous devez utiliser une suspension de microalgues quis de duna teta, en les ajoutant lors de la préparation des solutions d'essai jusqu'à ce qu'elles atteignent une densité de 10 puissance 5 cellules par millilitre. Mais avant de commencer, nous vous recommandons de suivre cet ordre d'ajout : dilution, suspension algale, puis solution standard. Introduisez des quantités égales, soit 50 millilitres des solutions d'essai, dans les récipients d'essai à l'aide du cylindre gradué.Préparer trois répliques pour chaque concentration pour chaque série de tests. Préparer un récipient témoin contenant un volume d'eau de dilution équivalent au volume des solutions d'essai. Introduire des volumes égaux d'environ 12 millilitres des solutions d'essai dans les boîtes de Pétri.Pour chaque série de tests, préparez une boîte de Petri témoin. 48 heures après l'activation des kystes, les larves atteindront le deuxième ou troisième stade larvaire et seront alors utilisables pour les tests. Sortez la boîte de Petri utilisée pour l'activation des kystes de la chambre thermostatée.Transférez une petite quantité de larves dans les boîtes de Pétri contenant les solutions témoin et de test. Lors de cette phase du test, vous pouvez effectuer le transfert à l’aide d’une pipette Pasteur en verre dont l’extrémité a été arrondie à la flamme, en utilisant une source de lumière positionnée latéralement afin d’encourager l’agrégation des artias. Transférez 10 larves provenant des solutions de test.Transférez les boîtes de Pétri aux récipients de test. Effectuez également cette opération en utilisant la pipette précédente et couvrez les béchers de test avec du parafilm, en laissant un espace pour le passage de l'air, en les maintenant à une température de 25 degrés pendant toute la durée du test. Et à une illumination de 900 lumens par mètre carré avec un cycle photopériodique de 14 heures de lumière pour 10 heures d'obscurité, deux jours après le début du test.Ensuite, après 5, 7, 9 et 12 jours, observer les artias au microscope et vérifier leur taux de survie. Le milieu et les compléments alimentaires doivent être renouvelés ; les organismes qui ne présentent aucun mouvement pendant environ 10 secondes doivent être considérés comme morts. Lors des tests, vous devez remplacer périodiquement les solutions d'essai, en les préparant le jour même de leur utilisation.Préparez les solutions d'essai à partir de la solution standard que vous avez préparée précédemment. Effectuez le transfert ARTIA en utilisant un EPI PET doté d’un diamètre suffisamment large pour ne pas endommager les organismes durant cette phase. Vous pouvez utiliser une pipette en plastique de trois millimètres destinée à des affiches, à couper après 14 jours d'exposition.À la fin des tests, comptez le nombre de larves survivantes et indiquez le résultat sur votre feuille de travail. Calculez la CL50 et/ou la CL20, la NOEC et la LOEC à 14 jours, puis indiquez leurs valeurs. Les limites de confiance à 95 % étaient appropriées ainsi que les méthodes de calcul.Si, à la fin des tests, les conditions suivantes ont été remplies, le taux de mortalité moyen des témoins est inférieur ou égal à 20 %, en utilisant du dodécylsulfate de sodium. La CL50 à 14 jours est comprise dans l'intervalle de 8,0 milligramme par litre. Si les conditions énoncées ne sont pas satisfaites, toutes les données obtenues avec le même lot d'organismes doivent être considérées comme non valables et les tests doivent être répétés.

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Cette vidéo présente un test de survie à court terme qui teste un traitement pour la toxicité aiguë ou teste une souche génétique pour la résistance à une condition toxique. L’exemple de protocole montre un exemple de test de survie dans lequel les vers sont testés pour leur capacité à résister au stress oxydatif induit par le paraquat (PQ).

C. elegans Essai de survie : un essai de toxicité à court terme

Un protocole est décrit pour la détection in vivo des effets des inhibiteurs mitochondriaux dans l’organisme modèle Caenorhabditis elegans et pour l’identification de composés potentiellement améliorants. Ce protocole peut être utilisé pour cribler les bibliothèques de médicaments à la recherche de composés modulant la fonction mitochondriale.

Un criblables<em&gt; In Vivo</em&gt; Essai de modulateurs mitochondriale utilisant transgénique Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Exposition aux substances toxiques environnementaux peut influer aiguë de développement avec des effets à long terme. Des protocoles détaillés sont fournis pour illustrer une stratégie utilisant un modèle de laboratoire efficace pour étudier l’effet de l’exposition embryonnaire précoce au bisphénol A. Nous fournissons la fécondité et tests comportements pour contrôler l’efficacité de nos produits toxiques exposition bio-essais.

Conséquences à long terme de comportements et reproduction d’exposition embryonnaire à faible dose des substances toxiques

Dans cet ouvrage, les auteurs décrivent un bioessai aiguë, chronique et multigénérationnelle pour étudier les effets des stresseurs simples et combinés sur le cyprinodonte Turquoise Nothobranchius furzeri. Ce protocole vise à étudier les caractéristiques démographiques (mortalité, croissance, fécondité, poids) et maximum thermique critique.

Protocole pour la toxicité aiguë et chronique écotoxicité Testing de la Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Dans ce protocole, nous montrent comment se reproduisent les adultes Astyanax mexicanus , élever les larves et effectuer ensemble monture immunohistochimie post larves de poissons pour comparer les phénotypes de surface et cave morphotypes.

Élever le tétra aveugle Astyanax mexicanus pour l’analyse des phénotypes de le Post-larval et l’ensemble monture immunohistochimie

Les embryons de poissons zèbres sont utilisés pour évaluer la toxicité des composés chimiques. Ils se développent à l'extérieur et sont sensibles aux produits chimiques, permettant la détection de changements phénotypiques subtils. L'expérience ne nécessite qu'une petite quantité de composé, qui est directement ajouté à la plaque contenant des embryons, ce qui rend le système de test efficace et rentable.

Évaluation rapide de la toxicité des composés chimiques à l'aide d'embryons de poisson zèbre

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Biodosage de létalité à l’aide d’Artemia salina L.

Ici, nous présentons un protocole de culture de nématodes individuels isolés sur des milieux solides pour le suivi des paramètres physiologiques tout au long de la vie et la quantification de la fluorescence. Ce système de culture comprend une barrière d’acide palmitique autour des puits à ver unique pour empêcher les animaux de fuir, ce qui permet l’utilisation d’interventions aversives, y compris des bactéries pathogènes et des facteurs de stress chimiques.

Culture à long terme de Caenorhabditis elegans individuelle sur milieu solide pour la surveillance longitudinale de la fluorescence et les interventions aversives

L’article propose une nouvelle méthode in vitro pour l’évaluation rapide et sensible de la toxicité et de l’écotoxicité des polluants, basée sur la motilité des hémocytes de Mytilus galloprovincialis . La méthode vise à contribuer au développement d’essais d’exposition toxicologiques et écotoxicologiques plus éthiques et plus sensibles.

Un essai toxicologique et écotoxicologique basé sur la motilité des hémocytes de la moule (Mytilus galloprovincialis)

Ce protocole décrit une procédure de dépistage de médicaments chez les larves de poisson-zèbre 3 à 7 jours après la fécondation, suivie d’une évaluation morphologique.

Dépistage de petites molécules et essais de toxicité chez les larves de poisson-zèbre à un stade précoce

Découvrez un protocole standardisé pour évaluer la toxicité létale à long terme sur Artemia franciscana. Cette méthode de 14 jours permet de déterminer les concentrations mortelles des polluants marins.

À long terme des essais de toxicité létale avec le Crustacé Artemia franciscana

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