Name: Analyse unicellulaire des Les biofilms par microscopie à fluorescence et cytométrie de flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Apprenez à analyser les sous-populations cellulaires dans les biofilms de Bacillus subtilis par microscopie à fluorescence et cytométrie de flux. Cette méthode permet de quantifier la différenciation cellulaire spécialisée.

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Ce travail est financé par le Programme de recherche du jeune chercheur, à partir du Centre de recherche sur les maladies infectieuses (ZINF) de l&#39;Université de Würzburg. Juan Garcia C-Betancur est un garçon un doctorat de la Graduate School of Life Sciences (GSLS) de l&#39;Université de Würzburg.

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<li>Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EpsE+flagellar+clutch+is+bifunctional+and+synergizes+with+EPS+biosynthesis+to+promote+Bacillus+subtilis+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The EpsE flagellar clutch is bifunctional and synergizes with EPS biosynthesis to promote Bacillus subtilis biofilm formation.</a> PLoS Genet. 6, e1001243-e1001243 (2010).</li>
<li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+population+heterogeneity+during+growth+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cell population heterogeneity during growth of Bacillus subtilis.</a> Genes Dev. 19, 3083-3094 (2005).</li>
<li>Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+signaling+in+a+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Paracrine signaling in a bacterium.</a> Genes Dev. 23, 1631-1638 (2009).</li>
<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Jongbloed, J. D., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+differential+gene+expression+by+improved+cyan+fluorescent+protein+and+yellow+fluorescent+protein+production+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Visualization of differential gene expression by improved cyan fluorescent protein and yellow fluorescent protein production in Bacillus subtilis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6809-6815 (2004).</li>
<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+gene+expression+patterns+of+competence+development+and+initiation+of+sporulation+in+Bacillus+subtilis+grown+on+chemically+defined+media%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of gene expression patterns of competence development and initiation of sporulation in Bacillus subtilis grown on chemically defined media.</a> J. Appl. Microbiol. 101, 531-541 (2006).</li>
<li>Veening, J. W., Kuipers, O. P., Brul, S., Hellingwerf, K. J., Kort, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phosphorelay+perturbations+on+architecture%2C+sporulation%2C+and+spore+resistance+in+biofilms+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Effects of phosphorelay perturbations on architecture, sporulation, and spore resistance in biofilms of Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 188, 3099-3109 (2006).</li>
<li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22, 945-953 (2008).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, 199-210 (2008).</li>
<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistability%2C+epigenetics%2C+and+bet-hedging+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li>
<li>Aguilar, C., Vlamakis, H., Guzman, A., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KinD+is+a+checkpoint+protein+linking+spore+formation+to+extracellular-matrix+production+in+Bacillus+subtilis+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">KinD is a checkpoint protein linking spore formation to extracellular-matrix production in Bacillus subtilis biofilms.</a> MBio. 1, (2010).</li>
<li>Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structurally+diverse+natural+products+that+cause+potassium+leakage+trigger+multicellularity+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).</li>
<li>Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannibalism+enhances+biofilm+development+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cannibalism enhances biofilm development in Bacillus subtilis.</a> Mol. Microbiol. 74, 609-618 (2009).</li>
<li>Arima, K., Kakinuma, A., Tamura, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactin%2C+a+crystalline+peptidelipid+surfactant+produced+by+Bacillus+subtilis%3A+isolation%2C+characterization+and+its+inhibition+of+fibrin+clot+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 488-494 (1968).</li>
<li>Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+accessory+protein+required+for+anchoring+and+assembly+of+amyloid+fibres+in+B.+subtilis+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms.</a> Mol. Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).</li>
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<li>Yasbin, R. E., Young, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+in+Bacillus+subtilis+by+bacteriophage+SPP1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Transduction in Bacillus subtilis by bacteriophage SPP1.</a> J. Virol. 14, 1343-1348 (1974).</li>
<li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li>
<li>Nakano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((srfA+is+an+operon+required+for+surfactin+production%2C+competence+development%2C+and+efficient+sporulation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">srfA is an operon required for surfactin production, competence development, and efficient sporulation in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 173, 1770-1778 (1991).</li>
<li>Gonzalez-Pastor, J. E., Hobbs, E. C., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannibalism+by+sporulating+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cannibalism by sporulating bacteria.</a> Science. 301, 510-513 (2003).</li>
<li>Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+about+Bacillus+subtilis+as+a+multicellular+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 638-643 (2007).</li>
<li>Shapiro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu. Rev. Microbiol. 52, 81-104 (1998).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Le fait que les communautés bactériennes montrent sous-populations de cellules exprimant ensemble spécifique de gènes preuves de la complexité des communautés microbiennes 33,34. Ce protocole devrait aider à déterminer si l&#39;expression de tout gène d&#39;intérêt est limitée à une sous-population particulière de cellules spécialisées au sein de la communauté microbienne. La visualisation de ces sous-populations nécessite le développement de nouvelles techniques, parce que les méthodes traditionnelles pour s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Technique </td><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Le numéro de catalogue </td></tr><tr><td rowspan="11"> MSgg composition </td><td> phosphate de potassium 5mM </td><td> Roth </td><td> 6878 </td></tr><tr><td> MOPS 100mm </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Le chlorure de magnésium 2 mM </td><td> Roth </td><td> 2189,1 </td></tr><tr><td> 700μM de chlorure de calcium </td><td> Roth </td><td> A119.1 </td></tr><tr><td> 50 um de chlorure ferrique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 157740 </td></tr><tr><td> 1 uM chlorure de zinc </td><td> Applichem </td><td> A2076 </td></tr><tr><td> Thiamine 2 pm </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74625 </td></tr><tr><td> 0,5% de glycérol </td><td> Roth </td><td> 7533 </td></tr><tr><td> Glutacompagnon de 0,5% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 49621 </td></tr><tr><td> Le tryptophane 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0254 </td></tr><tr><td> Phénylalanine 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2126 </td></tr><tr><td> La fixation de cellules </td><td> Paraformaldéhyde </td><td> Roth </td><td> 0335 </td></tr><tr><td></td><td> Nom de l&#39;équipement </td><td> Entreprise </td><td> Le numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Sonication </td><td> Sonicator portable </td><td> Bandelin </td><td> D-1000 </td></tr><tr><td> Microscopie de fluorescence </td><td> Microscope à fluorescence </td><td> Leica </td><td> DMI6000B </td></tr><tr><td></td><td> Nom du logiciel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Microscopie de fluorescence </td> &lt;td&gt; Asaf </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> La cytométrie en flux </td><td> FCASDiva </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> La cytométrie en flux </td><td> FlowJo </td><td> Treestar </td><td></td></tr></tbody></table>

analyse unicellulaire des<embacillus subtilis> les biofilms par microscopie à fluorescence et cytométrie de flux

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

La formation du biofilm est un attribut général à presque tous les 1-6 bactéries. Lorsque les bactéries forment des biofilms, les cellules sont enfermés dans la matrice extracellulaire qui est le plus souvent constitué par les protéines et les exopolysaccharides, entre autres facteurs 7-10. La communauté microbienne enfermé au sein du biofilm se montre souvent la différenciation des sous-populations distinctes de cellules spécialisées 11-17. Ces sous-populations coexistent et font souvent preuve d&#39;organisation spatiale et temporelle au sein du biofilm 18-21. La formation du biofilm dans les modèle Bacillus subtilis organisme exige la différenciation des sous-populations distinctes de cellules spécialisées. Parmi eux, la sous-population des producteurs de la matrice, responsable de produire et de sécréter la matrice extracellulaire du biofilm est essentiel pour la formation de biofilm 11,19. Ainsi, la différenciation des producteurs de la matrice est une caractéristique de la formation de biofilms dans B. subtilis. Nous avons utilisé des reporters fluorescents de visualiser et de quantifier la sous-population des producteurs de la matrice dans les biofilms de B. subtilis 15,19,22-24. Concrètement, nous avons observé que la sous-population des producteurs de la matrice différencie en réponse à la présence d&#39;auto-produit un signal extracellulaire surfactine 25. Intéressant, surfactine est produit par une sous-population de cellules spécialisées différentes de la sous-population de producteurs de matrice de 15. Nous avons détaillé dans le présent rapport l&#39;approche technique nécessaire pour visualiser et de quantifier la sous-population des producteurs de la matrice et les producteurs dans les biofilms surfactine de B. subtilis. Pour ce faire, les journalistes fluorescents de gènes nécessaires à la production de la matrice et de la production surfactine sont insérés dans le chromosome de B. subtilis. Reporters ne sont exprimées que dans une sous-population de cellules spécialisées. Ensuite, les sous-populations peuvent êtrecontrôlée à l&#39;aide de microscopie par fluorescence et la cytométrie de flux (voir fig 1). Le fait que différentes sous-populations de cellules spécialisées au sein des communautés coexistent multicellulaires de bactéries nous donne une perspective différente sur la régulation de l&#39;expression génique chez les procaryotes. Ce protocole traite de ce phénomène expérimentalement et il peut être facilement adapté à n&#39;importe quel modèle de travail d&#39;autre part, d&#39;élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents hétérogénéité phénotypique au sein d&#39;une communauté microbienne.

Biofilms microbiens sont généralement constitués par des sous-populations distinctes de cellules spécialisées. Analyse unicellulaire de ces sous-populations nécessite l&#39;utilisation de reporters fluorescents. Nous décrivons ici un protocole de visualiser et de contrôler plusieurs subpopulationswithin<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms en utilisant la microscopie par fluorescence et la cytométrie en flux.

Analyse unicellulaire des<emBacillus subtilis> Les biofilms par microscopie à fluorescence et cytométrie de flux

La formation de biofilms est un attribut général commun à presque toutes les bactéries 1-6. Lorsque les bactéries forment des biofilms, les cellules sont enchâssées dans une matrice extracellulaire composée principalement de...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser et de quantifier les sous-populations distinctes de cellules spécialisées qui se différencient dans les biofilms de l'organisme modèle, Bacillus subtilis. Ceci est réalisé en insérant d'abord des capteurs transcriptionnels dans le chromosome de B. subtilis. Ces capteurs seront exprimés exclusivement dans la sous-population de cellules étudiée.L'étape suivante consiste à favoriser le développement d'un biofilm en cultivant B. subtiles dans le milieu inducteur de biofilm, MS GG gg. Après la formation du biofilm, les cellules issues du biofilm sont dispersées et fixées avec du paraformaldéhyde. La dernière étape de la procédure consiste à détecter le signal de fluorescence émis par les cellules individuelles de la communauté microbienne à l'aide de la microscopie à fluorescence et de la cytométrie en flux.En fin de compte, les résultats montrent comment les cellules spécialisées dans la production et la sécrétion de la matrice extracellulaire qui constitue le biofilm forment une sous-population différente des cellules sécrétant le surfactant, la molécule de signalisation responsable de la différenciation de la sous-population de productrices de matrice. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la quantification de l'expression transcriptionnelle à l'aide de tests de viabilité ou d'analyses par microréseaux, est qu'elle nous permet de surveiller l'expression génique au niveau de la cellule unique et de visualiser des populations cellulaires particulièrement petites spécialisées dans l'expression d'un gène spécifique.Ces expressions génétiques ne seront pas détectées lors de l'analyse de la population globale. Des plasmides intégratifs sont utilisés pour marquer les B subtiles et un exemple est montré ici. PTAA, le promoteur des gènes responsables de la production de tass.Une protéine matricielle est clonée dans le vecteur en utilisant les sites de restriction ECO R un et Hindi trois. L'expression du gène rapporteur CFP est désormais sous le contrôle de ptap A. Pour commencer la procédure de marquage de B, linéariser de façon spécifique le plasmide intégratif par digestion enzymatique. L'enzyme de restriction recommandée est XH oh un. Lorsque le plasmide intégratif est prêt, induire la compétence naturelle chez la souche B subtiles 1 68 en cultivant les cellules dans un milieu inducteur de compétence pendant cinq heures à 37 degrés Celsius.Ajouter le plasmide linéarisé dans la culture de cellules compétentes de B. subtiles et incuber deux heures à 37 degrés Celsius ; après deux heures, étaler les cellules sur gélose contenant de la spectinomycine et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le chromosome de B. subtiles possède deux loci neutres, AmyE et LAC A, qui peuvent être utilisés pour intégrer des fusions rapporteuses sans affecter le développement du biofilm. Le plasmide PKM008 linéarisé s'intègre dans le génome de B. subtiles par recombinaison double.L'étape suivante consiste à transférer le gène rapporteur de la souche marquée vers une souche capable de former des biofilms, en utilisant le protocole de transduction par le bactériophage SPP1. Dans le cadre de cette vidéo, seules les étapes importantes du protocole sont montrées. Faire croître la souche donneuse 1 68, porteuse de la fusion rapporteur, en milieu TY à 37 degrés Celsius jusqu'à ce que la culture atteigne la phase stationnaire précoce, puis ajouter 200 microlitres de cellules à 100 microlitres de suspension phagique diluée dans un tube en verre.Et laissons à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, pipetez de l'agar TY mou chaud dans le tube et mélangez soigneusement par vortex. Étalez délicatement sur une boîte de TY fraîche et incubez à 37 degrés Celsius pendant huit à 16 heures afin de permettre l'apparition de halos de phages.Pour recueillir les halos de phages, ajoutez trois millilitres de milieu TY dans la boîte et utilisez la pipette en verre pour fragmenter l'agar supérieur. Transférez la suspension d'agar dans un tube conique de 15 millilitres. Vortexez doucement pour rompre l'agar, puis centrifugez à 1000 G pendant 15 minutes.Transférez le surnageant dans un nouveau tube. Faites passer le surnageant à travers un filtre à seringue de 22 microns. Utilisez ce surnageant pour infecter une culture de la souche réceptrice cultivée dans du milieu TY.Ajouter 30 microlitres de surnageant à 10 millilitres de culture diluée au dixième, puis incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, centrifuger à 5 000 tr/min pendant sept minutes, resuspendre le culot dans 200 microlitres de milieu TY et étaler sur une boîte contenant de la spectinomycine plus 10 millimolaire de citrate de sodium.Incuber à 37 degrés Celsius pendant 12 à 36 heures. Sélectionner une colonie et la faire croître toute la nuit dans du LB liquide à 37 degrés Celsius. Enfin, déposer trois microlitres de la culture de nuit sur un milieu solide inducteur de biofilm.Laisser les cellules croître pendant 72 heures à 30 degrés Celsius. Après trois jours de croissance, les biofilms formés à la surface de l'agar Ms.GG développeront une architecture morphologique complexe à la surface de l'agar. Pour commencer cette procédure, utiliser un cure-dent ou des pinces pour retirer le biofilm de la surface de l'agar MSGG.La consistance du biofilm devrait permettre de le détacher intact de la surface de l'agar. Placez le biofilm en un seul morceau dans trois millilitres de tampon PBS et dispersez-le délicatement. Effectuez 12 impulsions avec un rendement de trois et une amplitude de 0,7 seconde pour fixer les échantillons avant l'analyse au niveau de la cellule unique.Resuspendez 300 microlitres de la suspension cellulaire dans un millilitre de solution d'aldéhyde paraformique à 4 %, puis incubez à température ambiante pendant exactement sept minutes. Après la fixation de sept minutes, lavez les cellules trois fois dans un tampon PBS. Enfin, resuspendez les cellules dans 300 microlitres de tampon PBS avant l'observation en microscopie à fluorescence.Préparez une lame de microscope en pipetant 200 microlitres d'agarose à 0,8 % sur la lame, puis en la recouvrant délicatement d'une autre lame. Après deux minutes, retirez doucement la lame supérieure afin d'obtenir une couche d'agarose fixée à la lame située en bas. Déposez deux microlitres de cellules fixées à la surface de la couche d'agarose et recouvrez avec une lamelle de microscope.Placez l'échantillon sur la platine du microscope à fluorescence. Réglez la période d'excitation selon un témoin négatif qui ne montre aucune fluorescence dans les conditions sélectionnées pour l'expérience. L'exposition doit être comprise entre 50 et 200 millisecondes.Acquérir une image en fluorescence ainsi qu'une image en champ clair pour chaque champ observé. Pour préparer les cellules en vue d'une analyse par cytométrie en flux, disperser l'échantillon de cellules fixées par sonication douce. Effectuer deux séries de 12 impulsions avec un niveau de sortie de cinq et une amplitude de 0,7 seconde afin de disperser les agrégats en cellules individuelles sans provoquer de lyse cellulaire.Confirmez l'efficacité de la dispersion cellulaire par microscopie optique. Ensuite, diluez l'échantillon d'un facteur 100 dans du tampon PBS. Un cytomètre de flux BD FACS Canto II sera utilisé pour cette analyse afin de détecter la fluorescence YFP.Une excitation laser à 488 nanomètres couplée à un filtre 5 30 30 est utilisée pour la fluorescence du CFP. Une excitation laser à 405 nanomètres couplée à un filtre 4 0 8 40 est utilisée ; étalonner le cytomètre en flux avec deux contrôles négatifs. Un échantillon de tampon PBS sans cellules en suspension doit servir de contrôle négatif pour la taille des particules détectées par le cytomètre en flux.Un échantillon sans marqueur fluorescent doit servir de témoin négatif pour la sensibilité fluorescente de la cytométrie en flux. Après étalonnage, placer l'échantillon marqué avec un marqueur fluorescent dans le cytomètre en flux pour chaque échantillon, analyser au moins 50 000 événements avec un débit compris entre 303 000 événements par seconde. Lorsque B. subtiles croît sur une boîte de milieu inducteur de biofilm, la formation de biofilm MSGG est observée après trois jours d'incubation à 30 degrés Celsius.Le biofilm présente une architecture morphologique complexe qui indique la présence de sous-populations cellulaires distinctes participantes. Par exemple, la production de la matrice extracellulaire et des biofilms entraîne la formation de rides à la surface de la colonie. Cette figure montre un exemple de visualisation de la différenciation cellulaire dans une souche marquée unique à l’aide de la microscopie à fluorescence.Cette souche porte le rapporteur fluorescent Ptap, un CFP exprimé dans la sous-population de cellules productrices de matrice, colorée en bleu. Cette sous-population produit et sécrète la matrice extracellulaire qui constitue le biofilm. Cette image suivante résulte de la visualisation par microscopie de fluorescence d'une souche doublement marquée portant le rapporteur Ptap, un CFP, et le rapporteur supplémentaire P Surfactin YFP.Ce deuxième rapporteur permet de surveiller la sous-population de cellules responsables de la sécrétion de la molécule de signalisation surfactine, qui déclenche la cascade de signalisation conduisant à la différenciation des producteurs de matrice. Ici, les producteurs de matrice sont colorés artificiellement en bleu, tandis que les producteurs de surfactant sont colorés artificiellement en jaune, résultats de la cytométrie en flux 2D utilisant une souche unique marquée portant le rapporteur ptap. Un YFB est présenté ici.La souche témoin non traitée, sans aucun gène de protéine fluorescente, présentait une population unique composée de cellules à faible fluorescence relative, porteuses de ptap. Un YFP en conditions non inductrices de biofilm n'a pas permis de distinguer la sous-population de producteurs de matrice, et l'ensemble de la population montrait également une faible fluorescence relative. En revanche, en conditions inductrices de biofilm, une sous-population de cellules présentant une forte fluorescence relative a été détectée sous forme d'une épaule située à droite de la population à faible fluorescence relative.Les résultats obtenus à partir de la cytométrie en flux 3D sont présentés ici. Les signaux de fluorescence des canaux surveillés sont représentés sur l'axe des X pour YFP et sur l'axe des Y pour CFP. Le panneau supérieur gauche montre une souche dépourvue de gènes de protéines fluorescentes, servant de contrôle pour la fluorescence de fond. Dans le panneau supérieur droit, une souche marquée unique a été utilisée pour détecter la sous-population de producteurs de surfactine dans le canal de fluorescence YFP encadré en jaune.Dans le panneau inférieur gauche, une souche marquée différente a été utilisée pour détecter la sous-population de producteurs de matrice. Dans le canal de fluorescence CFP encadré en bleu, les sous-populations de producteurs de matrice et de producteurs de tensioactif sont surveillées à l’aide de la souche doublement marquée et les résultats sont présentés. Dans ce panneau inférieur droit.Deux sous-populations de cellules exprimant des niveaux élevés des marqueurs fluorescents sont détectées. Chaque population est encadrée, montrant qu'il n'y a aucun chevauchement dans l'expression des marqueurs entre les deux sous-populations de cellules spécialisées. Cette dernière figure montre la quantification des sous-populations de productrices de matrice et de cellules cannibales par cytométrie en flux 3D.Dans le panneau supérieur droit, une souche marquée unique a été utilisée pour détecter la sous-population de cannibales. Dans le canal de fluorescence YFP encadré en jaune, on a décrit que cette sous-population de cannibales se différencie de manière coordonnée avec la sous-population de producteurs de matrice. Dans le panneau inférieur gauche, la sous-population de producteurs de matrice est détectée dans une autre souche marquée unique, dans le canal de fluorescence CFP.Encadrés en bleu, les résultats de la souche doublement marquée dans le panneau inférieur droit ont révélé une seule sous-population de cellules fluorescentes exprimant à la fois le YFP et le CFP, encadrés en vert. L'expression simultanée des deux marqueurs indique que les deux voies de différenciation cellulaire sont activées de manière coordonnée au sein de la même sous-population. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de visualiser et de quantifier les sous-populations cellulaires distinctes qui constituent un biofilm microbien, grâce à l'analyse cellulaire de la population, comme la microscopie fluorescente ou la cytométrie en flux.

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