Analyse unicellulaire des Les biofilms par microscopie à fluorescence et cytométrie de flux

L’objectif global de cette procédure est de visualiser et de quantifier les sous-populations distinctes de cellules spécialisées qui se différencient dans les biofilms de l’organisme modèle, les bacilles subtils. Ceci est accompli en insérant d’abord des rapporteurs transcriptionnels dans le chromosome des subtils B. Ces rapporteurs seront exprimés exclusivement dans la sous-population de cellules étudiées.

L’étape suivante consiste à promouvoir le développement d’un biofilm en cultivant des subtils B dans le milieu induisant le biofilm, Mme GG gg. Après la formation du biofilm, les cellules du biofilm sont dispersées et fixées avec du para formaldéhyde. La dernière étape de la procédure consiste à détecter le signal de fluorescence émis par les cellules individuelles de la communauté microbienne à l’aide de la fluorescence, de la microscopie et de la cytométrie en flux.

En fin de compte, les résultats montrent comment les cellules se sont spécialisées pour produire et sécréter. La matrice extracellulaire qui constitue le biofilm est une sous-population différente des cellules qui sécrètent le tensioactif, la molécule de signalisation responsable de la différenciation de la sous-population des producteurs de matrice. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la quantification de l’expression de la transcription à l’aide des tests Vita Ities d’analyse microrayonnante, est qu’elle nous permet de surveiller l’expression génique à un seul niveau cellulaire et de visualiser des populations cellulaires particulièrement petites de cellules spécialisées pour exprimer un gène spécifique.

Ces expressions génétiques ne seront pas détectées lors de l’analyse de la population globale. Les plasmides intégratifs sont utilisés pour marquer les subtilités B et un exemple est montré ici. PTAA, le promoteur des gènes responsables de la production de tass.

Une protéine matricielle est clonée dans le vecteur à l’aide des sites de restriction ECO R un et Hindi trois. L’expression du gène rapporteur CFP est maintenant sous le contrôle de ptap A pour commencer la procédure de marquage B, linéarise subtilement le plasmide intégratif par digestion enzymatique. L’enzyme de restriction recommandée est XH oh un lorsque le plasmide intégratif est prêt, induire la compétence naturelle dans la souche la plus subtile B 1 68 en cultivant les cellules dans le milieu inducteur de compétence pendant cinq heures à 37 degrés Celsius.

Ajoutez le plasmide linéarisé dans la culture de cellules B subtiles compétentes et incubez pendant deux heures à 37 degrés Celsius après deux heures, placez les cellules sur gélose avec de la mycine spect et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le chromosome B subtil possède deux loci neutres, Amy, E, E et LAC A, qui peuvent être utilisés pour intégrer des fusions rapporteures sans affecter le développement du biofilm. Le plasmide linéarisé PKM 0 0 8 s’intègre dans le génome des subtils B par double recombinaison.

L’étape suivante consiste à transférer le rapporteur de la souche marquée vers une souche capable de former des biofilms à l’aide du protocole de transduction de phage SPP one. Dans le cadre de cette vidéo, seules les étapes importantes du protocole sont présentées. Cultivez la souche donneuse 1 68, hébergeant la fusion rapporteure dans un milieu TY à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la culture atteigne la phase stationnaire précoce à 200 microlitres de cellules à 100 microlitres de stock de phages dilué dans un tube de verre.

Et restons-nous à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, pipetez la gélose molle TY chaude dans le tube et mélangez soigneusement par vortex. Étalez doucement sur une plaque TY fraîche et incubez à 37 degrés Celsius pendant huit à 16 heures pour permettre aux halos de phages de se lever.

Pour recueillir les halos de phages, ajoutez trois millilitres de milieu TY dans la plaque et utilisez la pipette en verre pour briser la gélose supérieure. Transférez la suspension de gélose dans un tube de faucon de 15 millilitres. Agitez doucement pour briser la gélose puis centrifugez à 1000 G pendant 15 minutes.

Transférez le surnageant dans un nouveau tube. Passez le surnageant à travers un filtre à seringue de 22 microns. Utilisez ce surnageant pour infecter une culture de la souche réceptrice cultivée dans un milieu TY.

Ajouter 30 microlitres de surnageant à 10 millilitres de culture diluée de un à 10, et incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après cette centrifugeuse à 5 000 tr/min pendant sept minutes, suspendez la pastille dans 200 microlitres de milieu TY et étalez-la sur une plaque contenant de la mycine SPECT plus 10 millimolaires. Citrate de sodium.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant 12 à 36 heures. Sélectionnez une colonie et cultivez-la toute la nuit dans du LB liquide à 37 degrés Celsius. Enfin, repérez trois microlitres de la culture de nuit sur un milieu inducteur de biofilm solide.

Laissez les cellules se développer pendant 72 heures à 30 degrés Celsius. Après trois jours de croissance, les biofilms formés à la surface de la gélose Ms.GG développeront une architecture morphologique complexe à la surface de la gélose. Pour commencer cette procédure, utilisez un cure-dent ou une pince à épiler pour retirer le biofilm de la surface de la gélose MSGG.

La consistance du biofilm doit permettre de le décoller de la surface de la gélose. En un seul morceau, placez le biofilm dans trois millilitres de tampon PBS, dispersez le biofilm par doux. Effectuez 12 impulsions avec une sortie de trois et une amplitude de 0,7 seconde pour fixer les échantillons avant l’analyse d’une seule cellule.

Resus suspend 300 microlitres de suspension cellulaire dans un millilitre, une solution d’aldéhyde paraforme à 4 %, et incube à température ambiante pendant exactement sept minutes. Après la fixation de sept minutes, laver les cellules dans le tampon PBS trois fois. Enfin, remettre les cellules en suspension dans 300 microlitres de tampon PBS avant la microscopie à fluorescence.

Préparez une lame de microscope en pipetant 200 microlitres de 0,8 % d’agros sur la lame et en la recouvrant soigneusement d’une autre lame. Au bout de deux minutes, retirez délicatement la lame supérieure pour obtenir une couche d’agros attachée à la lame sur le point inférieur. Deux microlitres de cellules fixes à la surface de la couche agros et la recouvrent d’un verre de couverture de microscope.

Placez l’échantillon sur la platine du microscope à fluorescence. Réglez la période d’excitation en fonction d’un contrôle négatif qui ne montre aucune fluorescence dans les conditions sélectionnées pour l’expérience. L’exposition doit être comprise entre 50 et 200 millisecondes.

Acquérez une image de fluorescence ainsi qu’une image en fond clair pour chaque champ de vision. Pour préparer les cellules à l’analyse par cytométrie en flux, dispersez l’échantillon de cellules fixées par sonication légère. Effectuez deux séries de 12 impulsions avec une sortie de cinq et une amplitude de 0,7 seconde pour disperser les amas dans des cellules uniques sans provoquer de lyse cellulaire.

Confirmer l’efficacité de la dispersion cellulaire par microscopie optique. Ensuite, diluez l’échantillon un à 100 dans le tampon PBS. Un cytomètre en flux BD fax canto two sera utilisé pour cette analyse de la fluorescence YFP.

Une excitation laser à 488 nanomètres couplée à un filtre 5 30 30 est utilisée pour la fluorescence CFP. Une excitation laser à 405 nanomètres couplée à un filtre 4 0 8 40 est utilisée, calibrer le cytomètre en flux avec deux commandes négatives. Un échantillon de tampon PBS sans cellules en suspension doit servir de contrôle négatif pour la taille de la particule détectée par le cytomètre en flux.

Un échantillon sans rapporteur fluorescent doit servir de contrôle négatif pour la sensibilité fluorescente de l’écoulement. Cytomètre après étalonnage, placez l’échantillon marqué avec un rapporteur fluorescent dans le cytomètre en flux pour chaque échantillon, analysez au moins 50 000 événements avec un débit compris entre 303 000 événements par seconde. Lorsque B Subtles se développe sur une plaque du milieu inducteur de biofilm, la formation de biofilm MSGG est observée après trois jours d’incubation à 30 degrés Celsius.

Le biofilm présente une architecture morphologique complexe qui est indicative des sous-populations cellulaires participantes distinctes. Par exemple, la production de matrice extracellulaire et de biofilms entraîne la formation de rides à la surface de la colonie. Cette figure montre un exemple de visualisation de la différenciation cellulaire dans une seule souche marquée à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Cette souche héberge le rapporteur fluorescent Ptap, un CFP qui est exprimé dans la sous-population de cellules productrices de matrice colorées en bleu. Cette sous-population produit et sécrète la matrice extracellulaire qui constitue le biofilm. L’image suivante est le résultat de la visualisation par microscopie à fluorescence d’une souche à double marquage qui héberge le rapporteur Ptap, A CFP, et le rapporteur supplémentaire P Surfactin YFP.

Ce second rapporteur permet de suivre la sous-population de cellules responsables de la sécrétion de la molécule de signalisation surfactine, qui déclenche la cascade de signalisation pour la différenciation des producteurs de matrice. Ici, les producteurs de matrice sont faussement colorés en bleu, tandis que les producteurs de tensioactifs sont faussement colorés en jaune, les résultats de la cytométrie en flux 2D utilisant une seule souche marquée hébergeant le rapporteur ptap. Un YFB est présenté ici.

La souche témoin non traitée sans aucun gène de protéine fluorescente a montré une seule population avec des cellules à faible fluorescence relative hébergeant la ptap. Une YFP dans des conditions non induisant un biofilm n’a pas différencié la sous-population de producteurs de matrice, et l’ensemble de la population a également montré une faible fluorescence relative. En revanche, dans des conditions d’induction de biofilm, une sous-population de cellules à forte fluorescence relative a été détectée comme une épaule à droite de la faible fluorescence relative.

Les résultats de pointe obtenus par cytométrie en flux 3D sont présentés ici. Les signaux de fluorescence des canaux surveillés sont présentés dans l’axe X pour YFP et l’axe Y Pour CFP, le panneau supérieur gauche montre une souche sans gènes de protéine fluorescente comme contrôle de la fluorescence de fond. Dans le panneau supérieur droit, une seule souche marquée a été utilisée pour détecter la sous-population de producteurs de surfactine dans le canal de fluorescence YFP encadré en jaune.

Dans le panneau inférieur gauche, une souche unique différente a été utilisée pour détecter la sous-population de producteurs de matrice. Dans le canal de fluorescence CFP encadré en bleu, les sous-populations de producteurs de matrices et de producteurs de tensioactifs sont suivies à l’aide de la souche doublement marquée et les résultats sont présentés. Dans ce panneau en bas à droite.

Deux sous-populations de cellules exprimant des niveaux élevés de rapporteurs fluorescents sont détectées. Chaque population est cadrée de manière à montrer qu’il n’y a pas de chevauchement dans l’expression des rapporteurs entre les deux sous-populations de cellules spécialisées. Cette dernière figure montre la quantification des sous-populations de producteurs de matrices et de cannibales par cytométrie en flux 3D.

Dans le panneau supérieur droit, une seule souche marquée a été utilisée pour détecter la sous-population de cannibales. Dans le canal de fluorescence YFP encadré en jaune, cette sous-population de cannibales a été décrite comme se différenciant de manière coordonnée avec la sous-population de producteurs de matrices. Dans le panneau inférieur gauche, la sous-population de producteurs de matrice est détectée dans une autre souche marquée unique dans le canal de fluorescence CFP.

Encadrés en bleu, les résultats de la souche doublement marquée dans le panneau inférieur droit ont montré une seule sous-population de cellules fluorescentes exprimant à la fois YFP et CFP encadrées en vert. L’expression simultanée des deux rapporteurs indique que les deux voies de différenciation cellulaire sont activées par coordination dans la même sous-population. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser et de quantifier les sous-populations distinctes de cellules qui constituent un biofilm microbien à l’aide de l’analyse cellulaire de la population cellulaire telle que la microscopie fluorescente ou la cytométrie en flux.