Analyse unicellulaire des Les biofilms par microscopie à fluorescence et cytométrie de flux

L'objectif général de cette procédure est de visualiser et de quantifier les sous-populations distinctes de cellules spécialisées qui se différencient dans les biofilms de l'organisme modèle, Bacillus subtilis. Ceci est réalisé en insérant d'abord des capteurs transcriptionnels dans le chromosome de B. subtilis. Ces capteurs seront exprimés exclusivement dans la sous-population de cellules étudiée.

L'étape suivante consiste à favoriser le développement d'un biofilm en cultivant B. subtiles dans le milieu inducteur de biofilm, MS GG gg. Après la formation du biofilm, les cellules issues du biofilm sont dispersées et fixées avec du paraformaldéhyde. La dernière étape de la procédure consiste à détecter le signal de fluorescence émis par les cellules individuelles de la communauté microbienne à l'aide de la microscopie à fluorescence et de la cytométrie en flux.

En fin de compte, les résultats montrent comment les cellules spécialisées dans la production et la sécrétion de la matrice extracellulaire qui constitue le biofilm forment une sous-population différente des cellules sécrétant le surfactant, la molécule de signalisation responsable de la différenciation de la sous-population de productrices de matrice. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la quantification de l'expression transcriptionnelle à l'aide de tests de viabilité ou d'analyses par microréseaux, est qu'elle nous permet de surveiller l'expression génique au niveau de la cellule unique et de visualiser des populations cellulaires particulièrement petites spécialisées dans l'expression d'un gène spécifique.

Ces expressions génétiques ne seront pas détectées lors de l'analyse de la population globale. Des plasmides intégratifs sont utilisés pour marquer les B subtiles et un exemple est montré ici. PTAA, le promoteur des gènes responsables de la production de tass.

Une protéine matricielle est clonée dans le vecteur en utilisant les sites de restriction ECO R un et Hindi trois. L'expression du gène rapporteur CFP est désormais sous le contrôle de ptap A. Pour commencer la procédure de marquage de B, linéariser de façon spécifique le plasmide intégratif par digestion enzymatique. L'enzyme de restriction recommandée est XH oh un. Lorsque le plasmide intégratif est prêt, induire la compétence naturelle chez la souche B subtiles 1 68 en cultivant les cellules dans un milieu inducteur de compétence pendant cinq heures à 37 degrés Celsius.

Ajouter le plasmide linéarisé dans la culture de cellules compétentes de B. subtiles et incuber deux heures à 37 degrés Celsius ; après deux heures, étaler les cellules sur gélose contenant de la spectinomycine et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le chromosome de B. subtiles possède deux loci neutres, AmyE et LAC A, qui peuvent être utilisés pour intégrer des fusions rapporteuses sans affecter le développement du biofilm. Le plasmide PKM008 linéarisé s'intègre dans le génome de B. subtiles par recombinaison double.

L'étape suivante consiste à transférer le gène rapporteur de la souche marquée vers une souche capable de former des biofilms, en utilisant le protocole de transduction par le bactériophage SPP1. Dans le cadre de cette vidéo, seules les étapes importantes du protocole sont montrées. Faire croître la souche donneuse 1 68, porteuse de la fusion rapporteur, en milieu TY à 37 degrés Celsius jusqu'à ce que la culture atteigne la phase stationnaire précoce, puis ajouter 200 microlitres de cellules à 100 microlitres de suspension phagique diluée dans un tube en verre.

Et laissons à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, pipetez de l'agar TY mou chaud dans le tube et mélangez soigneusement par vortex. Étalez délicatement sur une boîte de TY fraîche et incubez à 37 degrés Celsius pendant huit à 16 heures afin de permettre l'apparition de halos de phages.

Pour recueillir les halos de phages, ajoutez trois millilitres de milieu TY dans la boîte et utilisez la pipette en verre pour fragmenter l'agar supérieur. Transférez la suspension d'agar dans un tube conique de 15 millilitres. Vortexez doucement pour rompre l'agar, puis centrifugez à 1000 G pendant 15 minutes.

Transférez le surnageant dans un nouveau tube. Faites passer le surnageant à travers un filtre à seringue de 22 microns. Utilisez ce surnageant pour infecter une culture de la souche réceptrice cultivée dans du milieu TY.

Ajouter 30 microlitres de surnageant à 10 millilitres de culture diluée au dixième, puis incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, centrifuger à 5 000 tr/min pendant sept minutes, resuspendre le culot dans 200 microlitres de milieu TY et étaler sur une boîte contenant de la spectinomycine plus 10 millimolaire de citrate de sodium.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant 12 à 36 heures. Sélectionner une colonie et la faire croître toute la nuit dans du LB liquide à 37 degrés Celsius. Enfin, déposer trois microlitres de la culture de nuit sur un milieu solide inducteur de biofilm.

Laisser les cellules croître pendant 72 heures à 30 degrés Celsius. Après trois jours de croissance, les biofilms formés à la surface de l'agar Ms.GG développeront une architecture morphologique complexe à la surface de l'agar. Pour commencer cette procédure, utiliser un cure-dent ou des pinces pour retirer le biofilm de la surface de l'agar MSGG.

La consistance du biofilm devrait permettre de le détacher intact de la surface de l'agar. Placez le biofilm en un seul morceau dans trois millilitres de tampon PBS et dispersez-le délicatement. Effectuez 12 impulsions avec un rendement de trois et une amplitude de 0,7 seconde pour fixer les échantillons avant l'analyse au niveau de la cellule unique.

Resuspendez 300 microlitres de la suspension cellulaire dans un millilitre de solution d'aldéhyde paraformique à 4 %, puis incubez à température ambiante pendant exactement sept minutes. Après la fixation de sept minutes, lavez les cellules trois fois dans un tampon PBS. Enfin, resuspendez les cellules dans 300 microlitres de tampon PBS avant l'observation en microscopie à fluorescence.

Préparez une lame de microscope en pipetant 200 microlitres d'agarose à 0,8 % sur la lame, puis en la recouvrant délicatement d'une autre lame. Après deux minutes, retirez doucement la lame supérieure afin d'obtenir une couche d'agarose fixée à la lame située en bas. Déposez deux microlitres de cellules fixées à la surface de la couche d'agarose et recouvrez avec une lamelle de microscope.

Placez l'échantillon sur la platine du microscope à fluorescence. Réglez la période d'excitation selon un témoin négatif qui ne montre aucune fluorescence dans les conditions sélectionnées pour l'expérience. L'exposition doit être comprise entre 50 et 200 millisecondes.

Acquérir une image en fluorescence ainsi qu'une image en champ clair pour chaque champ observé. Pour préparer les cellules en vue d'une analyse par cytométrie en flux, disperser l'échantillon de cellules fixées par sonication douce. Effectuer deux séries de 12 impulsions avec un niveau de sortie de cinq et une amplitude de 0,7 seconde afin de disperser les agrégats en cellules individuelles sans provoquer de lyse cellulaire.

Confirmez l'efficacité de la dispersion cellulaire par microscopie optique. Ensuite, diluez l'échantillon d'un facteur 100 dans du tampon PBS. Un cytomètre de flux BD FACS Canto II sera utilisé pour cette analyse afin de détecter la fluorescence YFP.

Une excitation laser à 488 nanomètres couplée à un filtre 5 30 30 est utilisée pour la fluorescence du CFP. Une excitation laser à 405 nanomètres couplée à un filtre 4 0 8 40 est utilisée ; étalonner le cytomètre en flux avec deux contrôles négatifs. Un échantillon de tampon PBS sans cellules en suspension doit servir de contrôle négatif pour la taille des particules détectées par le cytomètre en flux.

Un échantillon sans marqueur fluorescent doit servir de témoin négatif pour la sensibilité fluorescente de la cytométrie en flux. Après étalonnage, placer l'échantillon marqué avec un marqueur fluorescent dans le cytomètre en flux pour chaque échantillon, analyser au moins 50 000 événements avec un débit compris entre 303 000 événements par seconde. Lorsque B. subtiles croît sur une boîte de milieu inducteur de biofilm, la formation de biofilm MSGG est observée après trois jours d'incubation à 30 degrés Celsius.

Le biofilm présente une architecture morphologique complexe qui indique la présence de sous-populations cellulaires distinctes participantes. Par exemple, la production de la matrice extracellulaire et des biofilms entraîne la formation de rides à la surface de la colonie. Cette figure montre un exemple de visualisation de la différenciation cellulaire dans une souche marquée unique à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Cette souche porte le rapporteur fluorescent Ptap, un CFP exprimé dans la sous-population de cellules productrices de matrice, colorée en bleu. Cette sous-population produit et sécrète la matrice extracellulaire qui constitue le biofilm. Cette image suivante résulte de la visualisation par microscopie de fluorescence d'une souche doublement marquée portant le rapporteur Ptap, un CFP, et le rapporteur supplémentaire P Surfactin YFP.

Ce deuxième rapporteur permet de surveiller la sous-population de cellules responsables de la sécrétion de la molécule de signalisation surfactine, qui déclenche la cascade de signalisation conduisant à la différenciation des producteurs de matrice. Ici, les producteurs de matrice sont colorés artificiellement en bleu, tandis que les producteurs de surfactant sont colorés artificiellement en jaune, résultats de la cytométrie en flux 2D utilisant une souche unique marquée portant le rapporteur ptap. Un YFB est présenté ici.

La souche témoin non traitée, sans aucun gène de protéine fluorescente, présentait une population unique composée de cellules à faible fluorescence relative, porteuses de ptap. Un YFP en conditions non inductrices de biofilm n'a pas permis de distinguer la sous-population de producteurs de matrice, et l'ensemble de la population montrait également une faible fluorescence relative. En revanche, en conditions inductrices de biofilm, une sous-population de cellules présentant une forte fluorescence relative a été détectée sous forme d'une épaule située à droite de la population à faible fluorescence relative.

Les résultats obtenus à partir de la cytométrie en flux 3D sont présentés ici. Les signaux de fluorescence des canaux surveillés sont représentés sur l'axe des X pour YFP et sur l'axe des Y pour CFP. Le panneau supérieur gauche montre une souche dépourvue de gènes de protéines fluorescentes, servant de contrôle pour la fluorescence de fond. Dans le panneau supérieur droit, une souche marquée unique a été utilisée pour détecter la sous-population de producteurs de surfactine dans le canal de fluorescence YFP encadré en jaune.

Dans le panneau inférieur gauche, une souche marquée différente a été utilisée pour détecter la sous-population de producteurs de matrice. Dans le canal de fluorescence CFP encadré en bleu, les sous-populations de producteurs de matrice et de producteurs de tensioactif sont surveillées à l’aide de la souche doublement marquée et les résultats sont présentés. Dans ce panneau inférieur droit.

Deux sous-populations de cellules exprimant des niveaux élevés des marqueurs fluorescents sont détectées. Chaque population est encadrée, montrant qu'il n'y a aucun chevauchement dans l'expression des marqueurs entre les deux sous-populations de cellules spécialisées. Cette dernière figure montre la quantification des sous-populations de productrices de matrice et de cellules cannibales par cytométrie en flux 3D.

Dans le panneau supérieur droit, une souche marquée unique a été utilisée pour détecter la sous-population de cannibales. Dans le canal de fluorescence YFP encadré en jaune, on a décrit que cette sous-population de cannibales se différencie de manière coordonnée avec la sous-population de producteurs de matrice. Dans le panneau inférieur gauche, la sous-population de producteurs de matrice est détectée dans une autre souche marquée unique, dans le canal de fluorescence CFP.

Encadrés en bleu, les résultats de la souche doublement marquée dans le panneau inférieur droit ont révélé une seule sous-population de cellules fluorescentes exprimant à la fois le YFP et le CFP, encadrés en vert. L'expression simultanée des deux marqueurs indique que les deux voies de différenciation cellulaire sont activées de manière coordonnée au sein de la même sous-population. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de visualiser et de quantifier les sous-populations cellulaires distinctes qui constituent un biofilm microbien, grâce à l'analyse cellulaire de la population, comme la microscopie fluorescente ou la cytométrie en flux.