Name: Analyse unicellulaire des Les biofilms par microscopie à fluorescence et cytométrie de flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Apprenez à analyser les sous-populations cellulaires dans les biofilms de Bacillus subtilis par microscopie à fluorescence et cytométrie de flux. Cette méthode permet de quantifier la différenciation cellulaire spécialisée.

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Ce travail est financé par le Programme de recherche du jeune chercheur, à partir du Centre de recherche sur les maladies infectieuses (ZINF) de l&#39;Université de Würzburg. Juan Garcia C-Betancur est un garçon un doctorat de la Graduate School of Life Sciences (GSLS) de l&#39;Université de Würzburg.

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<li>Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EpsE+flagellar+clutch+is+bifunctional+and+synergizes+with+EPS+biosynthesis+to+promote+Bacillus+subtilis+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The EpsE flagellar clutch is bifunctional and synergizes with EPS biosynthesis to promote Bacillus subtilis biofilm formation.</a> PLoS Genet. 6, e1001243-e1001243 (2010).</li>
<li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+population+heterogeneity+during+growth+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cell population heterogeneity during growth of Bacillus subtilis.</a> Genes Dev. 19, 3083-3094 (2005).</li>
<li>Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+signaling+in+a+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Paracrine signaling in a bacterium.</a> Genes Dev. 23, 1631-1638 (2009).</li>
<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Jongbloed, J. D., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+differential+gene+expression+by+improved+cyan+fluorescent+protein+and+yellow+fluorescent+protein+production+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Visualization of differential gene expression by improved cyan fluorescent protein and yellow fluorescent protein production in Bacillus subtilis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6809-6815 (2004).</li>
<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+gene+expression+patterns+of+competence+development+and+initiation+of+sporulation+in+Bacillus+subtilis+grown+on+chemically+defined+media%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of gene expression patterns of competence development and initiation of sporulation in Bacillus subtilis grown on chemically defined media.</a> J. Appl. Microbiol. 101, 531-541 (2006).</li>
<li>Veening, J. W., Kuipers, O. P., Brul, S., Hellingwerf, K. J., Kort, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phosphorelay+perturbations+on+architecture%2C+sporulation%2C+and+spore+resistance+in+biofilms+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Effects of phosphorelay perturbations on architecture, sporulation, and spore resistance in biofilms of Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 188, 3099-3109 (2006).</li>
<li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22, 945-953 (2008).</li>
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<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistability%2C+epigenetics%2C+and+bet-hedging+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li>
<li>Aguilar, C., Vlamakis, H., Guzman, A., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KinD+is+a+checkpoint+protein+linking+spore+formation+to+extracellular-matrix+production+in+Bacillus+subtilis+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">KinD is a checkpoint protein linking spore formation to extracellular-matrix production in Bacillus subtilis biofilms.</a> MBio. 1, (2010).</li>
<li>Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structurally+diverse+natural+products+that+cause+potassium+leakage+trigger+multicellularity+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).</li>
<li>Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannibalism+enhances+biofilm+development+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cannibalism enhances biofilm development in Bacillus subtilis.</a> Mol. Microbiol. 74, 609-618 (2009).</li>
<li>Arima, K., Kakinuma, A., Tamura, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactin%2C+a+crystalline+peptidelipid+surfactant+produced+by+Bacillus+subtilis%3A+isolation%2C+characterization+and+its+inhibition+of+fibrin+clot+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 488-494 (1968).</li>
<li>Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+accessory+protein+required+for+anchoring+and+assembly+of+amyloid+fibres+in+B.+subtilis+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms.</a> Mol. Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).</li>
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<li>Yasbin, R. E., Young, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+in+Bacillus+subtilis+by+bacteriophage+SPP1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Transduction in Bacillus subtilis by bacteriophage SPP1.</a> J. Virol. 14, 1343-1348 (1974).</li>
<li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li>
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<li>Gonzalez-Pastor, J. E., Hobbs, E. C., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannibalism+by+sporulating+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cannibalism by sporulating bacteria.</a> Science. 301, 510-513 (2003).</li>
<li>Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+about+Bacillus+subtilis+as+a+multicellular+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 638-643 (2007).</li>
<li>Shapiro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu. Rev. Microbiol. 52, 81-104 (1998).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Le fait que les communautés bactériennes montrent sous-populations de cellules exprimant ensemble spécifique de gènes preuves de la complexité des communautés microbiennes 33,34. Ce protocole devrait aider à déterminer si l&#39;expression de tout gène d&#39;intérêt est limitée à une sous-population particulière de cellules spécialisées au sein de la communauté microbienne. La visualisation de ces sous-populations nécessite le développement de nouvelles techniques, parce que les méthodes traditionnelles pour s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Technique </td><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Le numéro de catalogue </td></tr><tr><td rowspan="11"> MSgg composition </td><td> phosphate de potassium 5mM </td><td> Roth </td><td> 6878 </td></tr><tr><td> MOPS 100mm </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Le chlorure de magnésium 2 mM </td><td> Roth </td><td> 2189,1 </td></tr><tr><td> 700μM de chlorure de calcium </td><td> Roth </td><td> A119.1 </td></tr><tr><td> 50 um de chlorure ferrique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 157740 </td></tr><tr><td> 1 uM chlorure de zinc </td><td> Applichem </td><td> A2076 </td></tr><tr><td> Thiamine 2 pm </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74625 </td></tr><tr><td> 0,5% de glycérol </td><td> Roth </td><td> 7533 </td></tr><tr><td> Glutacompagnon de 0,5% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 49621 </td></tr><tr><td> Le tryptophane 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0254 </td></tr><tr><td> Phénylalanine 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2126 </td></tr><tr><td> La fixation de cellules </td><td> Paraformaldéhyde </td><td> Roth </td><td> 0335 </td></tr><tr><td></td><td> Nom de l&#39;équipement </td><td> Entreprise </td><td> Le numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Sonication </td><td> Sonicator portable </td><td> Bandelin </td><td> D-1000 </td></tr><tr><td> Microscopie de fluorescence </td><td> Microscope à fluorescence </td><td> Leica </td><td> DMI6000B </td></tr><tr><td></td><td> Nom du logiciel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Microscopie de fluorescence </td> &lt;td&gt; Asaf </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> La cytométrie en flux </td><td> FCASDiva </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> La cytométrie en flux </td><td> FlowJo </td><td> Treestar </td><td></td></tr></tbody></table>

analyse unicellulaire des<embacillus subtilis> les biofilms par microscopie à fluorescence et cytométrie de flux

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

La formation du biofilm est un attribut général à presque tous les 1-6 bactéries. Lorsque les bactéries forment des biofilms, les cellules sont enfermés dans la matrice extracellulaire qui est le plus souvent constitué par les protéines et les exopolysaccharides, entre autres facteurs 7-10. La communauté microbienne enfermé au sein du biofilm se montre souvent la différenciation des sous-populations distinctes de cellules spécialisées 11-17. Ces sous-populations coexistent et font souvent preuve d&#39;organisation spatiale et temporelle au sein du biofilm 18-21. La formation du biofilm dans les modèle Bacillus subtilis organisme exige la différenciation des sous-populations distinctes de cellules spécialisées. Parmi eux, la sous-population des producteurs de la matrice, responsable de produire et de sécréter la matrice extracellulaire du biofilm est essentiel pour la formation de biofilm 11,19. Ainsi, la différenciation des producteurs de la matrice est une caractéristique de la formation de biofilms dans B. subtilis. Nous avons utilisé des reporters fluorescents de visualiser et de quantifier la sous-population des producteurs de la matrice dans les biofilms de B. subtilis 15,19,22-24. Concrètement, nous avons observé que la sous-population des producteurs de la matrice différencie en réponse à la présence d&#39;auto-produit un signal extracellulaire surfactine 25. Intéressant, surfactine est produit par une sous-population de cellules spécialisées différentes de la sous-population de producteurs de matrice de 15. Nous avons détaillé dans le présent rapport l&#39;approche technique nécessaire pour visualiser et de quantifier la sous-population des producteurs de la matrice et les producteurs dans les biofilms surfactine de B. subtilis. Pour ce faire, les journalistes fluorescents de gènes nécessaires à la production de la matrice et de la production surfactine sont insérés dans le chromosome de B. subtilis. Reporters ne sont exprimées que dans une sous-population de cellules spécialisées. Ensuite, les sous-populations peuvent êtrecontrôlée à l&#39;aide de microscopie par fluorescence et la cytométrie de flux (voir fig 1). Le fait que différentes sous-populations de cellules spécialisées au sein des communautés coexistent multicellulaires de bactéries nous donne une perspective différente sur la régulation de l&#39;expression génique chez les procaryotes. Ce protocole traite de ce phénomène expérimentalement et il peut être facilement adapté à n&#39;importe quel modèle de travail d&#39;autre part, d&#39;élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents hétérogénéité phénotypique au sein d&#39;une communauté microbienne.

Biofilms microbiens sont généralement constitués par des sous-populations distinctes de cellules spécialisées. Analyse unicellulaire de ces sous-populations nécessite l&#39;utilisation de reporters fluorescents. Nous décrivons ici un protocole de visualiser et de contrôler plusieurs subpopulationswithin<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms en utilisant la microscopie par fluorescence et la cytométrie en flux.

Analyse unicellulaire des<emBacillus subtilis> Les biofilms par microscopie à fluorescence et cytométrie de flux

La formation de biofilms est un attribut général commun à presque toutes les bactéries 1-6. Lorsque les bactéries forment des biofilms, les cellules sont enchâssées dans une matrice extracellulaire composée principalement de...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser et de quantifier les sous-populations distinctes de cellules spécialisées qui se différencient dans les biofilms de l'organisme modèle, Bacillus subtilis. Ceci est réalisé en insérant d'abord des capteurs transcriptionnels dans le chromosome de B. subtilis. Ces capteurs seront exprimés exclusivement dans la sous-population de cellules étudiée.L'étape suivante consiste à favoriser le développement d'un biofilm en cultivant B. subtiles dans le milieu inducteur de biofilm, MS GG gg. Après la formation du biofilm, les cellules issues du biofilm sont dispersées et fixées avec du paraformaldéhyde. La dernière étape de la procédure consiste à détecter le signal de fluorescence émis par les cellules individuelles de la communauté microbienne à l'aide de la microscopie à fluorescence et de la cytométrie en flux.En fin de compte, les résultats montrent comment les cellules spécialisées dans la production et la sécrétion de la matrice extracellulaire qui constitue le biofilm forment une sous-population différente des cellules sécrétant le surfactant, la molécule de signalisation responsable de la différenciation de la sous-population de

single-cell-analysis-bacillus-subtilis-biofilms-using-fluorescence

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Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Protocole décrivant l'application d'un système de cellule à circulation pour la croissance et l'analyse des biofilms microbiens pour la microscopie confocale à balayage laser (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa et le biofilm Saccharomyces cerevisiae en cellules à flux

Ce protocole prévoit une procédure étape par étape pour surveiller le comportement seule cellule de bactéries différentes dans le temps en utilisant la fluorescence automatisée de microscopie time-lapse. En outre, nous fournir des lignes directrices comment analyser les images de microscopie.

Imagerie de cellules vivantes de la<emBacillus subtilis> Et Streptococcus pneumoniae À l&#39;aide automatisée de microscopie time-lapse

Source : Cabeen, M. T., et al. Analyse microfluidique monocellulaire de Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)La vidéo montre l’utilisation d’un dispositif microfluidique pour observer la croissance bactérienne au niveau de la cellule unique. Il montre comment les cellules bactériennes non mobiles, confinées dans des tranchées à l’échelle microscopique, sont continuellement nourries et imagées au microscope à fluorescence. Cette configuration permet la visualisation en temps réel de la division...

Suivi de la croissance bactérienne à une seule résolution cellulaire dans un système microfluidique

Les biofilms ont des interactions complexes avec leur environnement. Pour étudier de manière exhaustive les interactions biofilm-environnement, nous présentons ici une série de méthodes permettant de créer un environnement chimique hétérogène pour le développement de biofilms, de quantifier la vitesse d’écoulement locale et d’analyser le transport de masse dans et autour des colonies de biofilms.

Méthodes de caractérisation de la Co-développement de biofilms et Habitat Hétérogénéité

Le rôle de l'assortiment (ségrégation spatiale) dans les scénarios d'évolution peut être examinée à l'aide des systèmes microbiens simples en laboratoire qui permettent le réglage de la distribution spatiale contrôlée. En modifiant la densité cellulaire fondateur, différents niveaux d' assortiment peuvent être visualisées en utilisant des souches bactériennes marquées par fluorescence dans les biofilms de colonies de Bacillus subtilis.

Surveillance spatiale Ségrégation en surface Colonizing populations microbiennes

Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour développer et analyser qualitativement les biofilms bactériens sur les hyphes fongiques par microscopie confocale et électronique.

Une nouvelle méthode d&#39;analyse qualitative multi-échelle des bactéries biofilms sur filamenteux Fungal Colonies utilisant confocale et microscopie électronique

Nous présentons une méthode pour l’analyse de la microfluidique de lignées de cellules bactériennes individuelles à l’aide de Bacillus subtilis à titre d’exemple. La méthode surmonte les lacunes des méthodes traditionnelles d’analyse en microbiologie en permettant l’observation de centaines de générations de cellules dans des conditions de croissance étroitement contrôlable et uniforme.

Analyse de Microfluidic unicellulaire de Bacillus subtilis

Cytométrie en combinaison avec les clusters visual vous propose une méthode rapide et facile à utiliser pour l’étude des biofilms aquatiques. Il peut être utilisé pour la caractérisation de biofilm, détection des changements dans la structure des communautés biofilm et détection des particules abiotiques incorporé dans le biofilm.

Caractérisation des Biofilms aquatiques avec écoulement Cytometry

Cet article fournit un guide étape par étape pour étudier la dynamique de localisation sous-cellulaire des protéines et pour surveiller les changements morphologiques à l'aide de la microscopie à haute résolution de fluorescence dans Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus.

Microscopie de fluorescence à cellules vivantes pour étudier la localisation des protéines subcellulaires et les changements de morphologie cellulaire chez les bactéries

L’imagerie des cellules bactériennes est une approche émergente de biologie des systèmes axée sur la définition de processus statiques et dynamiques qui dictent la fonction de grandes machines macromoléculaires. Ici, l’intégration de l’imagerie cellulaire vivante quantitative et de la tomographie cryo-électronique est utilisée pour étudier l’architecture et les fonctions du système de sécrétion de type IV de Legionella pneumophila.

Appliquer l’imagerie cellulaire en direct et la tomographie cryo-électronique pour résoudre les caractéristiques spatiotemporales du système de sécrétion Legionella pneumophila Dot/Icm

Ce protocole se concentre sur l’utilisation de la cytométrie en flux et des billes de comptage pour quantifier les spores bactériennes marquées au bromure d’éthidium. La méthode est également efficace pour analyser le couplage covalent des protéines à la surface des spores intactes.

Amélioration du dénombrement des spores de Bacillus subtilis et de l’analyse des marquages en cytométrie en flux

Apprenez à analyser les sous-populations cellulaires dans les biofilms de Bacillus subtilis par microscopie à fluorescence et cytométrie de flux. Cette méthode permet de quantifier la différenciation cellulaire spécialisée.

Analyse unicellulaire des Les biofilms par microscopie à fluorescence et cytométrie de flux

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