La culture de cellules progénitrices neurales humaines dans un hydrogel en 3 dimensions Peptide auto-assemblage

L’objectif global de cette procédure est d’accélérer l’analyse de la différenciation neuronale des cellules progénitrices neurales humaines cultivées dans un environnement tridimensionnel. Ceci est accompli en cultivant d’abord les cellules dans la matrice pure d’hydrogel à base de peptides auto-assemblée. Ensuite, les cellules sont libérées des échafaudages tridimensionnels.

Dans la troisième étape, la coloration immuno-phytochimique des cellules est effectuée dans la dernière étape. Les cellules sont dénombrées par analyse cytométrique en flux. En fin de compte, le taux de différenciation neuronale ou le taux d’apoptose peut être déterminé par l’analyse cytométrique en flux pour les marqueurs neuronaux ou apoptotiques respectivement.

Avec cette technique, la quantification de la différenciation neurale est beaucoup plus rapide et les données Optane sont regroupées dans une base plus large et des techniques de microphotographie. Pour l’intégration des cellules dans la matrice pure, placez d’abord un couvercle en verre stérilisé de 13 millimètres de diamètre dans chacun des deux puits d’une plaque de culture cellulaire à quatre puits. Rangez ensuite la plaque sur un banc propre pour une utilisation ultérieure. Ensuite, détachez les cellules progénitrices neurales humaines ou NPC H en ajoutant 2,5 millilitres de trypsine fraîchement préparée.

Benzon une solution à la boîte de culture et à l’incubation de la suspension cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après cinq minutes, arrêtez la réaction avec une solution d’inhibiteur de trypsine benzon. Ensuite, après avoir fait tourner les cellules détachées à 3000 fois G à température ambiante pendant cinq minutes, suspendez la pastille résultante avec cinq millilitres d’une solution de saccharose à 10 %, puis lavez la suspension cellulaire dans les mêmes conditions de centrifugation.

Après avoir jeté le snat Resus, suspendez la pastille dans la solution de saccharose à une concentration cellulaire finale de un fois 10 à six cellules par millilitre. Maintenant, le plus rapidement possible, mélangez 60 microlitres de suspension cellulaire avec la première solution, transférez 120 microlitres de cette suspension dans le tube conique avec la solution deux et mélangez soigneusement, puis superposez immédiatement 100 microlitres du mélange sur chacune des lamelles de couverture dans la plaque à quatre puits. Enfin, ajoutez lentement 200 microlitres de milieu de culture cellulaire dans chaque puits.

Après deux à trois minutes, ajoutez encore 200 microlitres de milieu de culture cellulaire dans les puits pour initier l’auto-assemblage de la matrice. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant une heure sur la zone chauffée de votre banc propre. En évitant de déplacer la plaque de culture cellulaire autant que possible après l’assemblage des matrices, utilisez une pipette de 1000 microlitres pour retirer la plupart des milieux, mais pas tous, afin d’éviter que les matrices ne se dessèchent.

Lavez ensuite les matrices avec 500 microlitres de milieu frais pendant 10 minutes. Enfin, retirez le produit de lavage. Ajoutez 500 microlitres de milieu supplémentaires et placez la plaque de culture dans un incubateur.

si possible. Stockez les matrices dans leur propre incubateur pour éviter les secousses accidentelles des structures le premier jour de l’expérience de coloration. Retirez le support des matrices à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, puis lavez les échafaudages avec du PBS une fois pendant cinq minutes.

Retirez ensuite le PBS et ajoutez 400 microlitres de paraldéhyde dans chaque puits pour fixer les matrices et les incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Une fois les échafaudages fixés, lavez-les avec 500 microlitres de PBS pendant cinq minutes. Ensuite, incubez les structures et le tampon de blocage pendant six à neuf heures, en changeant le tampon une fois toutes les deux à trois heures avec une incubation finale pendant la nuit dans un nouveau tampon de blocage à quatre degrés Celsius le lendemain, retirez le tampon de blocage.

Ajoutez la solution d’anticorps dans les puits et incubez à nouveau les matrices à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Maintenant, retirez la solution d’anticorps primaire et lavez les échafaudages dans 500 microlitres de PBS pendant huit heures, en changeant le PBS toutes les deux heures, puis pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec du PBS frais. Après le lavage de nuit, retirez le PBS et incubez les échafaudages avec la solution d’anticorps secondaires pendant quatre heures à température ambiante dans l’obscurité.

Ensuite, lavez les échantillons avec du PBS quatre à six fois pendant une heure à chaque fois, puis incubez les structures avec du PBS frais à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant la nuit. Ajoutez maintenant 50 microlitres de MOE all dab co sur les lames de microscope pour les préparer au montage des matrices. Montez ensuite soigneusement une lamelle sur chaque diapositive.

Enfin, utilisez un microscope fluorescent pour obtenir des micrographies simples et des Zacks similaires aux NPC H colorant en vert pour l’expression du marqueur neuronal bêta trois tubuline montré ici. Après avoir lavé les échafaudages avec 500 microlitres de HBSS pendant une minute, utilisez une pipette de 1000 microlitres pour transférer les échafaudages dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, remettez en suspension la solution cellulaire plusieurs fois avec une pipette de 1000 microlitres pour perturber mécaniquement les matrices, puis centrifugez la solution d’échafaudage à 3000 fois G à température ambiante pendant cinq minutes, retirez le surnageant à l’aide d’une pipette, puis remettez en suspension la pastille dans 500 microlitres de solution de trypsine benzine en pipetant de haut en bas plusieurs fois.

Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius. Arrêtez la réaction après cinq minutes avec un millilitre d’inhibiteur de la trypsine. Pipetage de la solution de benza nase de haut en bas plusieurs fois après la rotation de la suspension cellulaire dans les mêmes conditions de centrifugation.

Retirez tous les débris de matrice en lavant deux fois les cellules avec deux millilitres de tampon HBSS. Enfin, éliminez les agrégats en faisant passer la solution de suspension cellulaire dans une centrifugeuse à crépine de 70 microns dans les mêmes conditions et collectez les cellules dans un milieu de culture cellulaire. Commencez par fixer les cellules désagrégées dans du paraldéhyde paraforme à 1 % pendant 15 minutes à température ambiante sur un agitateur.

Ensuite, après avoir fait tourner les cellules reus, suspendez la pastille dans le tampon de lavage. Maintenant, après avoir centrifugé les cellules pendant 10 minutes à 350 fois G à quatre degrés Celsius, mettez en suspension la pastille résultante dans 25 microlitres de la solution d’anticorps. Incuber la suspension cellulaire pendant deux heures à température ambiante sur un agitateur.

Ajoutez ensuite 300 microlitres de tampon pon directement aux échantillons, puis lavez les suspensions cellulaires deux fois dans les mêmes conditions de centrifugation. Après le deuxième lavage, ajoutez 25 microlitres de l’anticorps secondaire, puis incubez les cellules pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Ensuite, après avoir lavé les cellules deux fois de plus avec un tampon de saponine, résus suspend la pastille et 500 microlitres de tampon de lavage pour l’analyse cytométrique en flux.

Dans cette figure H, les cellules se développent en sphères, des structures densément tassées où le diamètre des sphères peut atteindre plusieurs centaines de microns entre les sphères. Des faisceaux de processus construits par les cellules peuvent être observés, comme l’indiquent les flèches blanches. Bien que les cellules individuelles puissent difficilement être reconnues, les cellules encapsulées dans une matrice pure complétée par de la laminine se développent dans des structures moins denses et sont distribuées de manière plus homogène comme le montre cette figure, les cellules uniques peuvent même être reconnues dans des zones moins denses comme l’indiquent les flèches noires Ici, les NPCs H différenciés pendant quatre jours dans un stratifié complété par une coloration verte pure Matrixx pour l’expression du marqueur neuronal.

Il a été démontré que la tubuline bêta trois évalue le pourcentage de cellules positives. Le nombre total de cellules peut être déterminé en énumérant les noyaux cellulaires colorés ici en bleu avec dappy. Cette microphotographie représente la projection complète d’une pile Z d’images prises avec un microscope fluorescent.

Les cellules libérées de la matrice peuvent être réinstallées, par exemple, sur des lamelles de couverture, comme le montre cette figure pour d’autres études fonctionnelles. Cette microphotographie montre des cellules cultivées en 3D après avoir été soumises à la procédure de libération mentionnée précédemment et cultivées pendant trois jours. La coloration de la tubuline bêta-trois en rouge révèle une morphologie comparable à celle des cellules hébergées dans l’échafaudage 3D en utilisant des cellules non colorées comme contrôle négatif.

L’AG représenté ici comme le cadre noir a été défini pour l’analyse ultérieure des cellules bêta trois tubulines positives dans ce graphique à points, les cellules positives apparaissent dans le cadre noir dans la partie droite de l’axe des x et la population intermédiaire dans le cadre pointillé et représentant très probablement des débris cellulaires peut également être observée. Cette dernière figure présente une comparaison du comptage manuel des cellules et du dénombrement par cytométrie en flux. Une proportion beaucoup plus élevée de cellules positives peut être détectée par l’analyse cytométrique en flux, comme l’indiquent les carrés noirs ouverts, puis peut être généralement dénombrée par comptage manuel, comme l’indiquent les triangles noirs pleins.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser des métriques médiocres pour la culture de MPC de bord dans un échafaudage 3D, et comment libérer les cellules de l’échafaudage pour les analyseurs de métriques de cyto de flux.