La culture de cellules progénitrices neurales humaines dans un hydrogel en 3 dimensions Peptide auto-assemblage

L'objectif général de cette procédure est d'accélérer l'analyse de la différenciation neuronale de cellules progénitrices neurales humaines cultivées dans un environnement tridimensionnel. Ceci est réalisé en cultivant d'abord les cellules dans un hydrogel pur à base de peptides auto-assemblants. Ensuite, les cellules sont libérées des supports tridimensionnels.

Dans la troisième étape, la coloration phytochimique immunocytochimique des cellules est réalisée en dernière étape. Le dénombrement des cellules est effectué par analyse en cytométrie de flux. Enfin, le taux de différenciation neuronale ou le taux d'apoptose peut être déterminé par l'analyse en cytométrie de flux des marqueurs respectivement neuronaux ou apoptotiques.

Avec cette technique, la quantification de la différenciation neuronale est beaucoup plus rapide et les données Optane sont stockées sur une base plus large et des techniques de microphotographie. Pour l'incorporation des cellules dans la matrice pure, placez d'abord un couvre-objet en verre stérilisé de 13 millimètres de diamètre dans chacun des deux puits d'une plaque de culture cellulaire à quatre puits. Ensuite, conservez la plaque sur un banc propre en vue d'une utilisation ultérieure. Ensuite, détachez les cellules progénitrices neuronales humaines ou H NPCs en ajoutant 2,5 millilitres de trypsine fraîchement préparée.

Ajouter une solution de benzon à la boîte de culture et incuber la suspension cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après cinq minutes, arrêter la réaction à l’aide d’un inhibiteur de la trypsine, la solution de benzon. Ensuite, après avoir centrifugé les cellules détachées à 3000 × g à température ambiante pendant cinq minutes, resuspendre le culot obtenu dans cinq millilitres d’une solution de saccharose à 10 %, puis laver la suspension cellulaire dans les mêmes conditions de centrifugation.

Après avoir éliminé le surnageant Resus, resuspendez le culot dans la solution de saccharose jusqu'à une concentration cellulaire finale de un fois dix puissance six cellules par millilitre. Ensuite, le plus rapidement possible, mélangez 60 microlitres de suspension cellulaire avec la solution un, transférez 120 microlitres de cette suspension dans le tube conique contenant la solution deux, puis mélangez délicatement. Immédiatement après, déposez par couche 100 microlitres du mélange sur chacun des lamelles présents dans la plaque à quatre puits. Enfin, ajoutez lentement 200 microlitres de milieu de culture cellulaire dans chaque puits.

Après deux à trois minutes, ajoutez un autre 200 microlitres de milieu de culture cellulaire dans les puits afin d'initier l'auto-assemblage de la matrice. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant une heure sur la zone chauffée de votre table propre. Sans déplacer autant que possible la plaque de culture cellulaire une fois les matrices assemblées, utilisez une pipette de 1000 microlitres pour éliminer la majeure partie, mais pas la totalité, du milieu afin d'éviter que les matrices ne s'assèchent.

Ensuite, lavez les matrices avec 500 microlitres de milieu frais pendant 10 minutes. Enfin, retirez le milieu de lavage. Ajoutez 500 microlitres supplémentaires de milieu et placez la plaque de culture dans un incubateur.

Si possible, conserver les matrices dans un incubateur séparé afin d'éviter tout agitage accidentel des structures durant la première journée de l'expérience de coloration. Retirer le milieu des matrices à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, puis laver les supports une fois avec du PBS pendant cinq minutes.

Ensuite, retirez le PBS et ajoutez 400 microlitres de paraldéhyde dans chaque puits pour fixer les matrices, puis incubez-les pendant 30 minutes à température ambiante. Une fois les échafaudages fixés, lavez-les avec 500 microlitres de PBS pendant cinq minutes. Incubez ensuite les structures dans le tampon de blocage pendant six à neuf heures, en changeant le tampon toutes les deux à trois heures, suivi d'une incubation finale toute la nuit dans du tampon de blocage frais à quatre degrés Celsius. Le lendemain, retirez le tampon de blocage.

Ajoutez la solution d'anticorps dans les puits et incubez à nouveau les matrices à quatre degrés Celsius toute la nuit. Ensuite, retirez la solution d'anticorps primaire et lavez les échafaudages dans 500 microlitres de PBS pendant huit heures, en renouvelant le PBS toutes les deux heures, puis laissez-les ensuite tremper toute la nuit à quatre degrés Celsius avec du PBS frais. Après ce lavage prolongé, retirez le PBS et incubez les échafaudages avec la solution d'anticorps secondaire pendant quatre heures à température ambiante à l'abri de la lumière.

Ensuite, lavez les échantillons avec du PBS quatre à six fois, pendant une heure à chaque fois, puis incubez les structures avec du PBS frais à quatre degrés Celsius, à l'abri de la lumière, toute la nuit. Ajoutez maintenant 50 microlitres de MOE all dab co sur les lames de microscope pour les préparer à la mise en place des matrices. Puis, placez délicatement une lame couvre-objet sur chaque lame.

Enfin, utilisez un microscope à fluorescence pour obtenir des microphotographies uniques et des coupes en Z, similaires à la coloration en vert des H NPCs pour l'expression du marqueur neuronal bêta-tubuline trois illustrée ici. Après avoir lavé les échafaudages avec 500 microlitres de HBSS pendant une minute, utilisez une pipette de 1000 microlitres pour transférer les échafaudages dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, resuspendez plusieurs fois la solution cellulaire à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres afin de rompre mécaniquement les matrices, puis centrifugez la solution d’échafaudages à 3000 ×g à température ambiante pendant cinq minutes, éliminez le surnageant à l’aide d’une pipette, puis resuspendez le culot dans 500 microlitres de solution de trypsine-benzine en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas.

Incuber ensuite les cellules à 37 degrés Celsius. Arrêter la réaction après cinq minutes à l’aide d’un millilitre d’inhibiteur de trypsine. Effectuer plusieurs aspirations et distributions de la solution de benzase à l’aide d’une pipette après avoir centrifugé la suspension cellulaire dans les mêmes conditions de centrifugation.

Éliminer tous les débris de matrice en lavant les cellules avec deux millilitres de tampon HBSS, deux fois. Enfin, éliminer les agrégats en faisant passer la solution de suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire de 70 microns, puis centrifuger dans les mêmes conditions et recueillir les cellules dans le milieu de culture cellulaire. Commencer par fixer les cellules dissociées dans du paraformaldéhyde 1 % pendant 15 minutes à température ambiante sur un agitateur.

Ensuite, après avoir centrifugé les cellules, reprendre le culot dans du tampon de lavage. Après avoir centrifugé les cellules pendant 10 minutes à 350 ×g à quatre degrés Celsius, reprendre le culot obtenu dans 25 microlitres de solution d'anticorps. Incuber la suspension cellulaire pendant deux heures à température ambiante sous agitation.

Ensuite, ajouter 300 µL de tampon pon directement aux échantillons, puis laver les suspensions cellulaires deux fois dans les mêmes conditions de centrifugation. Après le deuxième lavage, ajouter 25 µL d'anticorps secondaire, puis incuber les cellules pendant une heure à température ambiante à l'abri de la lumière. Après deux nouveaux lavages avec le tampon saponine, resuspendre le culot dans 500 µL de tampon de lavage pour l'analyse par cytométrie en flux.

Dans cette figure, les H NPCs encapsulés et la matrice pure sont montrés : les cellules forment des structures sphériques et densément compactées, dont le diamètre peut atteindre plusieurs centaines de micromètres entre les sphères. Des faisceaux de prolongements formés par les cellules peuvent être observés, comme indiqué par les flèches blanches. Bien que les cellules individuelles soient difficilement reconnaissables, les cellules encapsulées dans la matrice pure supplémentée en laminine croissent en structures moins denses et sont distribuées de manière plus homogène, comme visible sur cette image ; des cellules isolées peuvent même être identifiées dans les zones moins denses, comme indiqué par les flèches noires. Ici, les H NPCs ont différencié pendant quatre jours dans une matrice pure supplémentée en laminine, coloration verte pour l'expression du marqueur neuronal.

La bêta-tubuline trois est utilisée pour évaluer le pourcentage de cellules positives. Le nombre total de cellules peut être déterminé en comptant les noyaux cellulaires colorés ici en bleu avec DAPI. Cette microphotographie représente la projection complète d’un empilement Z d’images prises au microscope fluorescent.

Les cellules libérées de la matrice peuvent être resemées, par exemple sur des lamelles, comme illustré sur cette figure pour des études fonctionnelles supplémentaires. Cette microphotographie montre des cellules cultivées en 3D après avoir subi la procédure de libération mentionnée précédemment et avoir été cultivées pendant trois jours. La coloration de la tubuline bêta trois en rouge révèle une morphologie comparable à celle des cellules hébergées dans l'échafaudage 3D, les cellules non colorées servant de contrôle négatif.

Le GA représenté ici par le cadre noir a été défini pour l'analyse ultérieure des cellules positives pour la bêta-tubuline III dans ce diagramme en nuage de points, où les cellules positives apparaissent à l'intérieur du cadre noir dans la partie droite de l'axe des x, tandis qu'une population intermédiaire, située dans le cadre en pointillés et probablement constituée de débris cellulaires, peut également être observée. Une comparaison du comptage manuel des cellules et du dénombrement par cytométrie en flux est présentée dans cette dernière figure. Une proportion nettement plus élevée de cellules positives peut être détectée par analyse en cytométrie en flux, comme l'indiquent les carrés noirs ouverts, par rapport à ce qui peut être généralement obtenu par comptage manuel, comme l'indiquent les triangles noirs pleins.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser des milieux pauvres pour la culture de MPCs périphériques dans un support tridimensionnel, et comment libérer les cellules du support pour des analyseurs cytométriques en flux.