Microscopie multiphotonique de cerveau de souris Effacé Exprimant YFP

Microscopie multiphotonique des organes de souris entiers est possible par compensation optiquement l'organe avant l'imagerie, mais pas tous les protocoles de préserver le signal de fluorescence des protéines fluorescentes. En utilisant une méthode de compensation optique avec de l'éthanol à base de déshydratation et d'alcool benzylique: benzoate de benzyle compensation, nous montrons des images haute résolution multiphotoniques de cerveau de souris exprimant toute la YFP.

La microscopie multiphotonique des tissus fixes est normalement limitée à de faibles profondeurs de pénétration de quelques centaines de microns seulement. Nous avons récemment démontré la première utilisation de la microscopie multiphotonique jusqu’à plusieurs millimètres de profondeur dans des organes de souris fixes en utilisant un dégagement optique avec une solution d’alcool benzogénique et de benzoate de benzoyle. Lors de notre première démonstration, la technique a imagé la fluorescence tissulaire intrinsèque.

Cependant, il y a un intérêt croissant pour l’utilisation de méthodes de clarification optique avec des tissus exprimant des protéines fluorescentes telles que la GFP. Nous présentons ici un protocole de microscopie multiphotonique du tissu cérébral nettoyé avec la même solution d’alcool benzobenzogénique qui préserve la fluorescence de la protéine fluorescente jaune exprimée par la cuisse. L’imagerie à haute résolution de l’organe entier de la souris à l’aide de la microscopie multiphotonique est rendue possible en dégageant optiquement l’organe avant l’imagerie sans éclaircissement. Multiphoton.

L’imagerie du cerveau est limitée à 300 microns sous la surface des tissus en raison des effets de diffusion des hautes lumières créés par les différences entre les indices de réfraction de l’eau et les protéines qui composent le tissu cérébral. Pour surmonter cette limitation, l’organe est déshydraté et l’eau est remplacée par un liquide qui a un indice de réfraction similaire à celui des protéines qui composent le tissu. Ce processus de clarification optique permet de réduire considérablement la diffusion de la lumière afin d’offrir une meilleure imagerie plus loin sous la surface des tissus.

Des images de Batta et al montrent comment cette technique peut être appliquée pour visualiser l’histologie de différents organes de souris en utilisant la fluorescence intrinsèque et la génération de secondes harmoniques. Cette première image est celle du testicule de souris, prise à 1,4 millimètre sous la surface du tissu. La propriété à haute résolution de la microscopie multiphotonique nous permet de zoomer et d’avoir un aperçu clair des spermatozoïdes individuels qui se forment dans les tubes séminifères.

Comme on le voit à l’extrême droite ici, nous montrons une image du poumon de la souris, qui a également été prise à 1,4 millimètre sous la surface du tissu. Cette image est une démonstration d’imagerie multiphotonique à deux canaux dans laquelle les composants de l’élastine sont marqués en rouge tandis que le collagène est étiqueté en vert, en zoomant sur les oli individuels sont facilement distinguables. Enfin, nous montrons des images haute résolution des régions internes du cerveau de la souris prenant 850 microns sous la surface des tissus En zoomant sur le néocortex et l’hippocampe du cerveau, les astrocytes individuels et les corps cellulaires des neurones peuvent être clairement vus.

Cependant, lorsqu’il s’agit d’organes optiquement dégagés qui peuvent contenir des protéines fluorescentes telles que YFP, le protocole de clarification optique de badra ne préserve pas du tout le signal fluorescent de ces protéines fluorescentes. Le protocole présenté ici est une nouvelle façon d’effectuer le nettoyage optique de l’organe entier et l’imagerie de l’entorse de la souris tout en préservant le signal fluorescent de YFP et les neurones déshydratant le cerveau à l’aide d’une série graduée à l’éthanol et en éliminant avec une à deux solution de benzoate d’alcool, également connu sous le nom de BAB, ont montré qu’ils réduisaient les dommages aux protéines fluorescentes et préservaient leur signal fluorescent. Pour l’imagerie multiphotonique, les souris YFP sont d’abord pesées, puis anesthésiées par une injection intrapéritonéale de kétamine xylazine.

Une plaque chirurgicale d’anesthésie doit être confirmée avant de procéder à la chirurgie. L’animal doit être examiné toutes les cinq minutes pour voir s’il réagit à un pincement ferme de l’orteil ou de la queue. Si l’animal réagit, une dose supplémentaire de S de kétamine xylazine est nécessaire.

Une fois anesthésiées, les souris restent en adhérant chaque membre à un lit chirurgical à l’aide de ruban adhésif de laboratoire afin que la souris soit en position couchée, exposant sa poitrine pour la chirurgie Pour commencer, une incision est pratiquée sous le processus xiphoïde afin de faire une coupe le long de la base de la cage thoracique à l’aide de ciseaux et d’une pince à épiler pour tirer la peau vers l’arrière pendant que la coupe est faite, Deux coupures sont ensuite faites de chaque côté du sternum de la souris pour créer un lambeau de tissu qui est maintenu à l’écart de la cavité thoracique à l’aide d’un hémostat pour laisser le cœur exposé. Ensuite, une aiguille de calibre 23 est insérée dans le ventricule gauche du cœur, et une petite incision est pratiquée dans la paroi musculaire de l’oreillette droite pour permettre au sang de s’échapper. Immédiatement après l’incision de l’oreillette droite, une perfusion avec une solution saline tamponnée au phosphate de quatre degrés Celsius est commencée jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de sang qui s’écoule de l’oreillette droite.

Pendant la perfusion, une pompe épistolique est utilisée et réglée sur une puissance de pompage qui éjecte le liquide à 1,5 à deux pouces de la pointe de l’aiguille. Une fois que tout le sang a été drainé, le milieu de perfusion est remplacé par une solution d’aldéhyde paraforme à 4 % à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que le corps de la souris devienne sensiblement rigide et rigide. Après la perfusion, la souris est retirée du lit chirurgical et décapitée pour commencer l’excision du cerveau à l’aide de pinces et de ciseaux à iris.

Le crâne est retiré en petites sections en commençant par l’arrière du crâne et en avançant. De petites incisions sont faites tous les deux à quatre millimètres avec les ciseaux à travers le crâne tandis que les pinces sont utilisées pour éloigner soigneusement l’os du cerveau en petites sections, ceci est fait jusqu’à ce que toute la surface supérieure du cerveau soit exposée. Le cerveau est ensuite excisé du crâne à l’aide d’une spatule chirurgicale et placé pour prendre un flacon en verre d’aldéhyde paraforme à 4 % pour le fixer pendant six heures.

Bien que nous nous concentrions principalement sur l’imagerie du cerveau de souris exprimant YFP pour cette démonstration, nous dégagerons également optiquement une souris, une patte arrière et sectionnerons un intestin grêle pour montrer au mieux les capacités de nettoyage de cette procédure. Après la post-fixation, le cerveau et d’autres tissus sont lavés deux fois dans du PBS. Les échantillons de tissus sont ensuite déshydratés à température ambiante par une série d’incubations d’éthanol à des concentrations de 50 %, 70 %, 90 % et 100 % d’éthanol.

Chaque incubation dure deux heures, puis une seconde. Une incubation 100 % éthanol de 12 heures est réalisée pour extraire efficacement l’eau des tissus fixés. Après déshydratation, la dernière solution d’éthanol à 100 % est versée et les échantillons de tissus sont immergés dans une solution individuelle d’éthanol pour BAB pendant deux heures avant d’être immergés dans une solution d’élimination à 100 % BAB.

Une fois à bab, le cerveau et d’autres échantillons de tissus deviendront sensiblement transparents en quatre à cinq heures. Ici, nous montrons une vidéo en accéléré des six premières heures du processus de nettoyage optique. Le saut marque le moment où la solution individuelle d’éthanol à BAB a été remplacée par une solution 100 % BAB.

Au bout de six heures, tous les organes montrent des signes de transparence, par exemple, l’os de la patte arrière de la souris est maintenant clairement visible pour de meilleurs résultats de nettoyage. Le cerveau doit être laissé à l’état libre pendant six jours à température ambiante à l’abri de la lumière vive. Une fois que le cerveau est dégagé et prêt pour l’imagerie, il est fixé au fond de votre boîte de Pétri à l’aide d’acrylique Sano ou de super colle.

Une fois que la colle a séché, le cerveau est émergé dans BAB et la boîte de Pétri est placée sous l’objectif d’imagerie. Pour l’imagerie, nous utilisons un microscope multiphotonique qui intègre un laser saphir titane MI tie réglable entre une longueur d’onde d’excitation de 710 à 990 nanomètres. La longueur d’onde d’excitation que nous utilisons pour générer des signaux YFP est de 886 nanomètres.

Le signal fluorescent réfléchissant est ensuite capturé à l’aide d’un objectif cinq x de l’icône NIK qui permet d’obtenir une imagerie à grand champ de vision. Le signal fluorescent réfléchissant est filtré à l’aide d’un filtre passe-bande 5 35 50 et collecté à l’aide d’un plieur à haute efficacité quantique. Les images multiplicatrices deux d’OMA Matsu sont traitées à l’aide d’un logiciel d’image de balayage à une résolution de 2048 par 2048 pixels en utilisant une fréquence de balayage de deux millisecondes par ligne pour générer des images YFP haute résolution.

Une fois l’imagerie terminée, le cerveau est retiré de la parabole P two et stocké dans BAB et protégé de la lumière pour une imagerie future. Les images et vidéos représentatives présentées ici démontrent la capacité d’imagerie multiphotonique à haute résolution rendue possible par la clairance optique. L’imagerie cérébrale entière permet aux neurones de marquage YFP dans les différentes couches de l’hippocampe et du néocortex d’être clairement visibles jusqu’à deux millimètres sous la surface du tissu.

Ici, nous montrons une vidéo d’une pile d’images de 1,2 millimètre d’une entorse buccale entière, prise de 0,8 à deux millimètres dans le cerveau pour révéler les différentes couches anatomiques de l’hippocampe. Ce qui suit est une image représentative d’une section coronale de 1,94 millimètre appelée à Bergman, tirée de l’image de deux millimètres de profondeur coincée dans laquelle les différentes couches de l’hippocampe ont été étiquetées. En zoomant sur le néocortex, les axones individuels et les corps cellulaires neuronaux des neurones péraux de la cinquième couche du néocortex sont clairement distinguables jusqu’à 1,02 millimètre sous la surface du tissu.

Ici, nous montrons une image collée de neurones de la couche cinq pris entre 700 et 1020 microns sous la surface du tissu. Ce qui suit est une image représentative de cette pile prise à 774 microns dans le cerveau. À l’aide de cette même pile d’images, une reconstruction 3D de la région neuronale a été réalisée à l’aide du logiciel Image J.

La capacité de haute résolution de la microscopie multi-bot nous permet également de présenter des images de neurones individuels entiers. Nous montrons ici une reconstruction d’un neurone de la couche cinq du néocortex dans lequel les processus génétiques D sont clairement visibles. Ceci conclut notre présentation de la clairance optique, entorse de souris entière exprimant YFP.

La mise en œuvre de cette technique est relativement simple et, comme nous l’avons montré, peut être utilisée pour visualiser et imager de nombreuses régions et structures différentes de l’entorse de la souris. Merci d’avoir regardé et bonne chance.