Microscopie multiphotonique de cerveau de souris Effacé Exprimant YFP

La microscopie multiphotonique de tissus fixés est normalement limitée à de faibles profondeurs de pénétration, de seulement quelques centaines de micromètres. Nous avons récemment démontré la première utilisation de la microscopie multiphotonique à des profondeurs atteignant plusieurs millimètres dans des organes de souris fixés, en utilisant un éclaircissement optique avec une solution d'alcool benzoïque et de benzoate de benzoyle. Dans notre démonstration initiale, la technique permettait d'imager la fluorescence intrinsèque du tissu.

Cependant, l'intérêt pour l'utilisation de méthodes de clarification optique sur des tissus exprimant des protéines fluorescentes telles que la GFP est en constante augmentation. Nous présentons ici un protocole d'imagerie par microscopie multiphoton de tissu cérébral clarifié, utilisant la même solution de benzoate d'alcool qui préserve la fluorescence de la protéine fluorescente jaune exprimée par la cuisse. Un promoteur dans le cerveau de souris L'imagerie en haute résolution d'organes entiers de souris par microscopie multiphoton devient possible grâce à la clarification optique de l'organe avant l'acquisition, sans clarification.Multiphoton.

L'imagerie du cerveau est limitée à 300 micromètres sous la surface du tissu en raison des effets de diffusion causés par les différences d'indices de réfraction entre l'eau et les protéines qui constituent le tissu cérébral. Pour surmonter cette limitation, l'organe est déshydraté et l'eau est remplacée par un fluide ayant un indice de réfraction similaire à celui des protéines constitutives du tissu. Ce processus de clarification optique permet de réduire fortement la diffusion de la lumière, offrant ainsi une meilleure imagerie à des profondeurs plus importantes sous la surface du tissu.

Les images de Batta et al illustrent comment cette technique peut être appliquée pour visualiser l'histologie de différents organes de souris à l'aide de la fluorescence intrinsèque et de la génération de seconde harmonique. Cette première image montre le testicule de souris, prise à 1,4 millimètre sous la surface du tissu. La propriété de haute résolution de la microscopie multiphotonique nous permet de zoomer et d'observer clairement les cellules spermatiques individuelles en formation dans les tubules séminifères.

Comme on le voit tout à droite ici, nous présentons une image du poumon de souris, également prise à 1,4 millimètre sous la surface du tissu. Cette image illustre une imagerie multiphoton à deux canaux dans laquelle les composants d'élastine sont marqués en rouge tandis que le collagène est marqué en vert, et en agrandissant, les alvéoles individuels sont facilement discernables. Enfin, nous montrons des images haute résolution des régions internes du cerveau de souris prises à 850 micromètres sous la surface du tissu. En zoomant sur le néocortex et l'hippocampe du cerveau, les astrocytes individuels et les corps cellulaires des neurones peuvent être clairement observés.

Cependant, lorsqu'on utilise des organes rendus transparents optiquement qui peuvent contenir des protéines fluorescentes telles que la YFP, le protocole de clarification optique de Badra ne préserve pas du tout le signal fluorescent de ces protéines. Le protocole présenté ici constitue une méthode innovante permettant d'effectuer la clarification optique et l'imagerie d'organes entiers de souris tout en préservant le signal fluorescent de la YFP, en déshydratant le cerveau à l'aide d'une série progressive d'éthanol et en le clarifiant avec une solution de benzoate d'alcool benzylique dans un rapport un à deux, communément appelée BAB, ce qui s'est révélé réduire les dommages aux protéines fluorescentes et préserver leur signal. Pour l'imagerie multiphoton, les souris exprimant la YFP sont d'abord pesées, puis anesthésiées par une injection intrapéritonéale de kétamine-xylazine.

Une anesthésie chirurgicale doit être confirmée avant de procéder à l'intervention. L'animal doit être vérifié toutes les cinq minutes pour voir s'il réagit à une pression ferme sur l'orteil ou la queue. Si l'animal réagit, une dose supplémentaire de kétamine et de xylazine est nécessaire.

Une fois anesthésiés, les souris sont maintenues en place en fixant chaque membre sur un lit chirurgical à l’aide de ruban adhésif de laboratoire, de manière à ce que la souris soit en position dorsale, exposant ainsi son thorax pour l’intervention chirurgicale. Pour commencer, une incision est pratiquée sous le processus xiphoïde afin de découper le long de la base de la cage thoracique à l’aide de ciseaux, tandis que la peau est écartée à l’aide de pinces ; deux autres incisions sont ensuite effectuées de chaque côté du sternum de la souris pour former un lambeau de tissu, qui est maintenu écarté de la cavité thoracique à l’aide d’un hémostat, laissant ainsi le cœur exposé. Ensuite, une aiguille de calibre 23 est insérée dans le ventricule gauche du cœur, et une petite incision est pratiquée dans la paroi musculaire de l’oreillette droite afin de permettre l’évacuation du sang. Immédiatement après la section de l’oreillette droite, une perfusion avec du tampon phosphate salin à quatre degrés Celsius est initiée jusqu’à ce qu’aucun sang ne s’écoule plus de l’oreillette droite.

Pendant la perfusion, une pompe épisotique est utilisée et réglée sur une puissance de pompage permettant d'éjecter le liquide à une distance de 1,5 à 2 pouces de l'extrémité de l'aiguille. Une fois tout le sang évacué, le milieu de perfusion est remplacé par une solution de paraformaldéhyde à 4 % à quatre degrés Celsius, jusqu'à ce que le corps de la souris devienne nettement rigide. Après la perfusion, la souris est retirée du lit chirurgical et décapitée afin de commencer l'excision du cerveau à l'aide de pinces et de ciseaux à iris.

Le crâne est retiré par de petites sections en partant de l'arrière du crâne et en avançant vers l'avant. De petites incisions sont effectuées tous les deux à quatre millimètres avec les ciseaux à travers le crâne, tandis que la pince est utilisée pour retirer soigneusement l'os du cerveau par petites sections, jusqu'à ce que toute la surface supérieure du cerveau soit exposée. Le cerveau est ensuite excisé du crâne à l'aide d'une spatule chirurgicale et placé dans un flacon en verre contenant du paraformaldéhyde à 4 % pour une fixation de six heures.

Bien que nous nous concentrons principalement sur l'imagerie du cerveau de souris exprimant la protéine fluorescente jaune (YFP) pour cette démonstration, nous réaliserons également le clarification optique d'une souris entière, d'une patte arrière et d'une section d'intestin grêle afin de mieux illustrer les capacités de clarification de cette procédure. Après la fixation postérieure, le cerveau et les autres tissus sont lavés deux fois dans du PBS. Les échantillons de tissus sont ensuite déshydratés à température ambiante par une série d'incubations dans de l'éthanol aux concentrations de 50 %, 70 %, 90 % et 100 %.

Chaque incubation dure deux heures, puis une seconde incubation avec de l'éthanol à 100 % pendant 12 heures est effectuée afin d'extraire efficacement l'eau du tissu fixé. Après la déshydratation, la dernière solution d'éthanol à 100 % est éliminée et les échantillons de tissu sont immergés dans une solution éthanol/BAB en rapport un pour un pendant deux heures, avant d'être plongés dans une solution de clarification BAB à 100 %.

Une fois placés dans le BAB, les échantillons de cerveau et d'autres tissus deviennent nettement transparents en quatre à cinq heures. Nous présentons ici une vidéo accélérée des six premières heures du processus de clarification optique. La marque de saut indique le moment où la solution éthanol/BAB en proportion un pour un a été remplacée par une solution de BAB à 100 %.

Après six heures, tous les organes présentent des signes de transparence ; par exemple, l'os de la patte arrière de la souris est désormais clairement visible pour de meilleurs résultats de clarification. Le cerveau doit être laissé en clarification pendant six jours à température ambiante, à l'abri de la lumière vive. Une fois le cerveau clarifié et prêt pour l'imagerie, il est fixé au fond de votre boîte de Pétri à l'aide de colle acrylique Sano ou de super colle.

Une fois que la colle est sèche, le cerveau est immergé dans du BAB et la boîte de Pétri est placée sous l'objectif pour l'acquisition d'images. Pour l'acquisition, nous utilisons un microscope à deux photons équipé d'un laser au saphir dopé au titane MI tie, dont la longueur d'onde d'excitation est réglable entre 710 et 990 nanomètres. La longueur d'onde d'excitation utilisée pour générer les signaux YFP est de 886 nanomètres.

Le signal fluorescent réfléchi est ensuite capturé à l’aide d’un objectif NIK icon five x qui permet une imagerie avec un grand champ de vision. Le signal fluorescent réfléchi est filtré à l’aide d’un filtre passe-bande 535/50 et collecté à l’aide d’un multiplicateur à haute efficacité quantique. Les images Multiplier two d’OMA Matsu sont traitées à l’aide du logiciel Scan Image avec une résolution de 2048 par 2048 pixels et un taux de balayage de deux millisecondes par ligne afin de générer des images YFP haute résolution.

Une fois l'acquisition d'images terminée, le cerveau est retiré de la boîte P deux et conservé dans du BAB à l'abri de la lumière pour des acquisitions ultérieures. Les images et vidéos représentatives présentées ici illustrent la capacité d'imagerie multiphotonique haute résolution rendue possible par la clarification optique. L'imagerie du cerveau entier permet de visualiser clairement les neurones marqués par la YFP dans les différentes couches de l'hippocampe et du néocortex, jusqu'à une profondeur de deux millimètres sous la surface du tissu.

Ici, nous présentons une vidéo d'un empilement d'images de 1,2 millimètre de l'ensemble de la bouche en cas d'entorse, réalisée entre 0,8 et deux millimètres à l'intérieur du cerveau afin de révéler les différentes couches anatomiques de l'hippocampe. Ce qui suit est une image représentative d'une coupe coronale à 1,94 millimètre, appelée Bergman, extraite de l'empilement d'images profond de deux millimètres, dans laquelle les différentes couches de l'hippocampe ont été étiquetées. En effectuant un zoom sur le néocortex, les axones individuels et les corps cellulaires des neurones de la couche cinq des neurones péral du néocortex sont clairement discernables jusqu'à 1,02 millimètre sous la surface du tissu.

Ici, nous présentons un empilement d'images de neurones de la couche cinq, prises entre 700 et 1020 micromètres sous la surface du tissu. L'image suivante est une image représentative de cet empilement, prise à 774 micromètres de profondeur dans le cerveau. À l'aide de ce même ensemble d'images, une reconstruction 3D de la région neuronale a été réalisée à l'aide du logiciel Image J.

La capacité de haute résolution de la microscopie multi-bot nous permet également de présenter des images de neurones entiers individuels. Ici, nous montrons une reconstruction d'un neurone de la couche V du néocortex, dans lequel des processus dendritiques sont clairement visibles. Cela conclut notre présentation du clarification optique, du cerveau entier de souris exprimant la protéine fluorescente jaune (YFP).

La réalisation de cette technique est relativement simple et, comme nous l'avons montré, peut être utilisée pour observer et imager de nombreuses régions et structures différentes de la cheville de la souris. Merci d'avoir regardé et bonne chance.