Name: Lutilisation de moyen dexpectoration artificielle pour tester lefficacité des antibiotiques contre Pseudomonas aeruginosa Dans des conditions plus pertinents à la fibrose kystique du poumon (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Découvrez comment évaluer l'efficacité des antibiotiques contre les biofilms de Pseudomonas aeruginosa en utilisant un milieu de expectoration artificiel. Cette méthode reproduit les conditions pulmonaires de la mucoviscidose pour des tests plus pertinents.

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Nous reconnaissons l&#39;appui de l&#39;Institut national du Royaume-Uni pour la recherche en santé, le Dr Hadwen Trust pour la recherche humaine, le Royaume-Uni leader de financement de la recherche médicale charité exclusivement des techniques de recherche non-animale pour remplacer l&#39;expérimentation animale, et le Wellcome Trust (Grant 089 215). Nous reconnaissons également Novartis Pharmaceuticals UK Ltd (l&#39;éducation sans restriction de subvention).

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<li>Fouhy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusible+signal+factor-dependent+cell-cell+signaling+and+virulence+in+the+nosocomial+pathogen+Stenotrophomonas+maltophilia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Diffusible signal factor-dependent cell-cell signaling and virulence in the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia.</a> J. Bacteriol. 189, 4964-4968 (2007).</li>
<li>Winstanley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+introduced+genomic+prophage+islands+are+critical+determinants+of+in+vivo+competitiveness+in+the+Liverpool+Epidemic+Strain+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa.</a> Genome Res. 19, 12-23 (2009).</li>
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</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Dans cette étude nous avons utilisé un modèle in vitro roman basé sur l&#39;ASM à reproduire P. conditions biofilm aeruginosa dans les 4 poumon FC. Le modèle a été modifié avec succès à petite échelle, à haut débit des tests des agents antimicrobiens. Les étapes critiques de ce test sont les suivants: <ol><li> Conformément préparation des médias ASM et la stérilité maintien. Nous avons consacré de longues heures à l&#39;optimisation de la manière dont chaque composant est ajouté à obtenir des résultats reproductibles à chaque fois. Filtration de l&#39;ASM est lent mais il est préférable d&#39;autoclavage, ce qui peut endommager le composant mucine. Nous ne conseillons pas l&#39;addition d&#39;antibiotiques, comme suggéré par d&#39;autres 11, car cela pourrait imposer considérables pressions sélectives, des mutations d&#39;entraînement, induire la lyse prophage 16 et modifier de manière significative l&#39;expression de plusieurs gènes bactériens. </li><li> Le test doit être optimisée en fonction de l&#39;o du volumef ASM utilisé. Shaking vitesses sont augmentées pour les petits volumes et une plus courte biofilm du cycle de vie est observée. </li></ol> Une application évidente du modèle à petite échelle biofilm ASM est la détermination plus réaliste de susceptibilités biofilm antimicrobiens (BSMIC 90). Niches anaérobies et microaérophiles sont présents dans le poumon des FC et il est évident que l&#39;oxygène est limité au plus profond de maturité biofilms 2, 17. Nous démontrons ici que 10/14 P. clinique isolats aeruginosa de patient atteint de mucoviscidose présentent une considérable crachats (4 - ≥ 128 fois) diminution de la sensibilité à la tobramycine dans des conditions microaérophiles en ASM. Les résultats de cette étude suggèrent que les antibiotiques, tels que la tobramycine, pourrait être moins efficace contre P. infections aeruginosa dans les poumons CF que ceux indiqués par les méthodes classiques de test de sensibilité. Ces résultats reflètent les études antérieures sur la sensibilité aux antimicrobiens des biofilms 10. Petit-échelle des dosages ASM ainsi fournir une plate-forme simple, le débit élevé pour générer des données significatives de sensibilité aux antibiotiques afin de mieux éclairer les décisions thérapeutiques. Le test est limité dans la même manière que les tests de sensibilité aux antibiotiques classiques par le fait que des colonies isolées sont cueillies pour le dépistage qui peuvent ne pas être représentatif de la population dans son ensemble. Cependant, nous croyons qu&#39;une approche (i) à l&#39;aide non-surface de croissance biofilm fixé et (ii) applicable à des conditions microaérophiles, représente une alternative claire et un potentiel d&#39;amélioration des méthodes existantes. Nous concluons que cet essai est un modèle approprié pour étudier P. populations biofilm aeruginosa. D&#39;autres tests dans des contextes cliniques serait de vérifier si la sensibilité aux antibiotiques sur la base de biofilm développé P. aeruginosa pourrait conduire à des choix différents antibiotiques avec potentiellement de meilleurs résultats cliniques et microbiologiques. Des enquêtes similaires en utilisant des modèles classiques de biofilm ont montré que les valeurs BSMIC conduiredes recommandations différentes pour le traitement antibiotique 5,17. En plus des tests de l&#39;efficacité des agents anti-infectieux, le système ASM représente un pas cher, alternative simple et reproductible pour des modèles animaux pour des études telles que celles visant à comprendre la diversification de P. populations aeruginosa. Nous avons observé une hétérogénéité importante dans les populations naturelles de P. aeruginosa récupéré de patient atteint de mucoviscidose crachats 18, 19. Comme la diversification phénotypique et génotypique peut être observée au cours de la croissance à l&#39;ASM 4 (et nos données non publiées), ce qui en fait un joli modèle in vitro des maladies pulmonaires FC. La relative simplicité du modèle ASM, il est facile de concevoir des expériences d&#39;adaptation à long terme visant, par exemple, à surveiller les effets des antibiotiques ou autres facteurs de stress sur P. Population de divergence aeruginosa. En outre, d&#39;autres bactéries pathogènes peuvent être cultivées dansASM. Par exemple, Fouhy et al. 2007 ont utilisé l&#39;ASM pour étudier la formation de biofilm par S. maltophillia 20.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> L&#39;ADN de sperme de poisson </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74782 </td></tr><tr><td> Mucine de porc estomac, de type II </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2378 </td></tr><tr><td> L-alanine </td><td> Acros Organics </td><td> 102830250 </td></tr><tr><td> L-Arginine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5006 </td></tr><tr><td> L (+)-asparagine monohydraté </td><td> Acros Organics </td><td> 175271000 </td></tr><tr><td> L (+)-acide aspartique </td><td> Acros Organics </td><td> 105041000 </td></tr><tr><td> L-cystéine </td><td> Sigma-Adrich </td><td> 168149 </td></tr&gt; <tr><td> L (+)-acide glutamique </td><td> Acros Organics </td><td> 156211000 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td></tr><tr><td> Glycine </td><td> Acros Organics </td><td> 220911000 </td></tr><tr><td> L-histidine </td><td> Sigma-Adrich </td><td> H8000 </td></tr><tr><td> L-isoleucine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2752 </td></tr><tr><td> L-leucine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L8000 </td></tr><tr><td> L (+)-lysine monochlorhydrate </td><td> Acros Organics </td><td> 125222500 </td></tr><tr><td> L-Méthionine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9625 </td></tr><tr><td> L-phénylalanine </td><td> Acros Organics </td><td> 130310250 </td></tr><tr><td> L-proline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0380 </td></tr><tr><td> L-sérine </td><td> Acros Organics </td><td> 132660250 </td></tr><tr><td> L-Thréonine </td><td> Acros Organics </td><td> 138930250 </td></tr><tr><td> L (-)-tryptophane </td><td> Acros Organics </td><td> 140590250 </td></tr><tr><td> L-Tyrosine </td><td> Acros Organics </td><td> 140641000 </td></tr><tr><td> L-valine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> V0500 </td></tr><tr><td> L&#39;acide diéthylènetriaminepentaacétique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 32318 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S/3160/60 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> BDH </td><td> BDH0258 </td></tr><tr><td&gt; KOH </td><td> BDH </td><td> BDH0262 </td></tr><tr><td> Émulsion de jaune d&#39;oeuf </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 17148 </td></tr><tr><td> ME 2 Pompe à vide à membrane </td><td> Vacuubrand </td><td> 696126 </td></tr><tr><td> Filtres Steritop (taille des pores: 0,22 um, la taille du cou: 45 mm) </td><td> Millipore </td><td> SCGPT10RE </td></tr><tr><td> Luria-Bertani </td><td> Sigma </td><td> L2897 </td></tr><tr><td> Microplaques de 96 puits </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581 </td></tr><tr><td> Tissus de 24 puits culture traités plaques </td><td> Iwaki </td><td> 3820-024 </td></tr><tr><td> Packs CampyGen génération de gaz </td><td> Oxoid </td><td> CN0025 </td></tr><tr><td> Chambre microaérophile </td><td> Oxoid </td><td> HP0011 </td></tr><tr><td> Tobramycine sulfate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1783 </td></tr><tr><td> Cellulase, à partir d&#39;Aspergillus Niger </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 22178 </td></tr><tr><td> Résazurine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 199303 </td></tr><tr><td> Citrate.H 2 0 </td><td> BDH </td><td> BDH0288 </td></tr><tr><td> Fluostar oméga lecteur de microplaques </td><td> BMG-Labtech </td><td> SPECTROstar Omega </td></tr></tbody></table>

l&#39;utilisation de moyen d&#39;expectoration artificielle pour tester l&#39;efficacité des antibiotiques contre<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em&gt; dans des conditions plus pertinents à la fibrose kystique du poumon

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Il est de plus en plus préoccupés par la pertinence des tests in vitro de sensibilité aux antimicrobiens lorsqu&#39;ils sont appliqués à des isolats de P. aeruginosa de fibrose kystique (FK) patients. Les méthodes existantes assurée par un seul ou de quelques isolats cultivés en aérobiose et en plancton. Prédéterminés seuils sont utilisés pour définir si les bactéries sont sensibles ou résistantes à un antibiotique donné 1. Toutefois, au cours des infections pulmonaires chroniques dans les FC, P. populations aeruginosa existent dans des biofilms et il est évident que l&#39;environnement est en grande partie microaérophile 2. La différence marquée dans des conditions entre les bactéries dans les poumons et ceux lors de tests a remis en question la pertinence de fiabilité et même de ces 3 tests. Moyennes expectoration artificielle (ASM) est un milieu de culture contenant les composants de l&#39;expectoration patient atteint de mucoviscidose, y compris les acides aminés, et l&#39;ADN de mucine libre. P aeruginosa &lt;/ Em&gt; La croissance de la croissance au cours des infections imite ASM FC, avec la formation de biofilm structures d&#39;auto-agrégation et 4,5,6 divergence de la population. L&#39;objectif de cette étude était de développer un test de microtitrage plaque d&#39;étudier la sensibilité aux antimicrobiens de P. aeruginosa basé sur la croissance à l&#39;ASM, qui est applicable aux deux conditions microaérophiles et aérobie. Un test a été développé ASM dans un format microplaque. P. biofilms aeruginosa ont été autorisés à se développer pour 3 jours avant l&#39;incubation avec des agents antimicrobiens à des concentrations différentes pour 24 heures. Après la perturbation du biofilm, la viabilité cellulaire a été mesurée par coloration avec la résazurine. Ce test a été utilisé pour déterminer la concentration minimale inhibitrice des cellules sessiles (SMIC) de la tobramycine pour 15 différents P. isolats aeruginosa dans des conditions aérobies et microaérophiles et les valeurs du SMIC ont été comparés à ceux obtenus avec la croissance de bouillon standard. Bien qu&#39;il n&#39;y aitcertains éléments de preuve pour les valeurs de CMI accrues pour les isolats cultivés dans ASM par rapport à leurs homologues planctoniques, les plus grandes différences ont été trouvées avec des bactéries testées dans des conditions microaérophiles, qui ont montré une résistance beaucoup plus porté à un&gt; 128 fois, vers la tobramycine dans le système ASM lors par rapport à des tests réalisés dans des conditions aérobies. L&#39;absence d&#39;association entre les méthodes actuelles de tests de sensibilité et le résultat clinique a mis en doute la validité des méthodes actuelles 3. Plusieurs modèles in vitro ont déjà été utilisés pour étudier P. biofilms aeruginosa 7, 8. Cependant, ces méthodes reposent sur ​​des biofilms de surface ci-jointes, tandis que les biofilms ASM ressemblent à ceux observés dans le poumon FC 9. En outre, la concentration en oxygène réduite dans le mucus a été montré pour modifier le comportement de P. aeruginosa 2 et affectent la sensibilité aux antibiotiques 10. Par conséquent using ASM dans des conditions microaérophiles peuvent fournir un environnement plus réaliste dans lequel d&#39;étudier la sensibilité aux antimicrobiens.

Actuelle des tests de diagnostic de sensibilité aux antimicrobiens repose sur la croissance planctonique des isolats en nutriments riches, des conditions aérobies. Ici, nous employons un moyen alternatif d&#39;expectoration artificielle pour étudier la sensibilité aux antimicrobiens des biofilms de Pseudomonas aeruginosa dans des conditions aérobies et microaérophiles plus représentatives de la fibrose pulmonaire kystique.

L&#39;utilisation de moyen d&#39;expectoration artificielle pour tester l&#39;efficacité des antibiotiques contre<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Dans des conditions plus pertinents à la fibrose kystique du poumon

L'inquiétude croissante concernant la pertinence des tests de sensibilité antimicrobienne in vitro appliqués aux isolats de P. aeruginosa provenant de kystes...

L'objectif de cette expérience est d'évaluer l'efficacité des antibiotiques contre les biofilms de Pseudomonas aeruginosa dans des conditions représentatives des infections chroniques observées dans les poumons de patients atteints de mucoviscidose, en utilisant un milieu de crachats artificiel défini. Les biofilms bactériens sont cultivés dans des plaques de microtitration à 24 puits.Les biofilms sont ensuite exposés à des antibiotiques. Ensuite, les cultures traitées par l'antibiotique sont désagrégées à l'aide de cellulase et incubées avec un colorant métabolique srin, qui passe du bleu au rose sous l'action des cellules viables. En mesurant l'absorbance des puits, on peut déterminer la concentration minimale inhibitrice des cellules de biofilm, ou B-S-M-I-C, afin de quantifier la sensibilité aux antibiotiques dans des conditions proches des conditions physiologiques.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la détermination des concentrations minimales inhibitrices basée sur une culture planctonique, est que les bactéries sont cultivées dans un milieu spécialisé contenant tous les composants du crachat, favorisant ainsi la formation de biofilms. Ces biofilms sont nettement plus résistants aux antibiotiques. Pour préparer le milieu, commencez par préparer deux flacons contenant chacun 250 millilitres d'eau stérile dans le premier flacon.Ajoutez progressivement en remuant, puis ajoutez quatre grammes d'ADN de sperme de poisson à 250 millilitres d'eau stérile. Mélangez la solution à température ambiante et laissez l'ADN se dissoudre dans le deuxième flacon. Ajoutez progressivement cinq grammes de mucine de type deux provenant de l'estomac porcin et remuez. Une fois les solutions d'ADN et de mucine prêtes, dissoudre les acides aminés dans 100 millilitres d'eau stérile, à l'exception de la L-tyrosine et de la L-cystéine, qui doivent être dissoutes respectivement dans 25 millilitres d'eau ou dans 25 millilitres de potasse 0,5 molaire. Ensuite, préparer 5,9 milligrammes de DTPA, cinq grammes de chlorure de sodium et 2,2 grammes de chlorure de potassium dans 100 millilitres d'eau. Combiner toutes les solutions différentes dans une bouteille d'un litre, puis ajouter cinq millilitres d'émulsion de jaune d'œuf, et compléter le mélange jusqu'à 850 millilitres avec de l'eau.À l'aide d'une solution molaire de triss, ajustez le pH à 6,9 et complétez le volume final à un litre avec de l'eau. Pour stériliser le milieu, filtrez-le à l'aide d'une pompe à vide de marque ME deux, munie d'un diaphragme, et d'un système de filtration stérile Millipore doté d'un embout de 45 millimètres et d'une taille de pore de 0,2 micron. Le processus de filtration peut être réalisé sur deux jours. Le milieu A SM peut être conservé à quatre degrés Celsius pendant un mois au maximum.Commencez par diluer des cultures de pseudomona arosa incubées toute une nuit dans du milieu LB afin d'obtenir une DO de 0,05. Ensuite, diluez davantage les bactéries au ratio de 1 à 100 dans une plaque de milieu SM, en ajoutant 1,8 millilitre de culture bactérienne diluée par puits dans 21 puits d'une plaque de culture tissulaire de 24 puits, et ajoutez le même volume de milieu SM dans les trois puits restants, qui serviront de témoins négatifs blancs. Fermez hermétiquement la plaque de 24 puits contenant le biofilm, puis placez-la dans des conditions microaérophiles afin de permettre la formation de biofilms, conditions que l'on peut obtenir à l'aide de sachets générateurs de gaz CampyGen placés dans de grands bocaux anaérobies.Incuber la culture dans un agitateur réglé à 75 tr/min pendant trois jours à 37 degrés Celsius. Après trois jours, les biofilms apparaîtront sous forme d'une masse gélatineuse contenant des cellules bactériennes et ne pourront pas être disruptés par pipetage. Une fois les biofilms formés, ajouter 200 microlitres par puits d'antibiotique à des concentrations diluées en série. Veiller à préparer au moins quatre réplicats pour chaque concentration de médicament à tester et à laisser quatre puits contenant des biofilms non traités afin qu'ils puissent servir de témoins négatifs.Ensuite, incuber les plaques préalablement pendant encore 24 heures après l'incubation avec les antibiotiques. Utiliser 100 microlitres par puits de cellulase diluée à 100 milligrammes par millilitre dans un tampon citrate pour rompre les biofilms, puis incuber les plaques sur un agitateur réglé à 150 tr/min en conditions aérobies à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après cette incubation, un pipetage manuel peut être utilisé pour désagréger davantage les biofilms si des agrégats cellulaires sont visibles dans le milieu.Ensuite, ajoutez 100 microlitres de rezin par puits pour quantifier la viabilité des cellules libérées des biofilms, puis incubez les cellules pendant une à deux heures. À 37 degrés Celsius, seules les cellules viables sont capables de métaboliser le colorant bleu zarin en sa forme rose fluorescente. Après l'incubation, transférez les échantillons dans une plaque de 96 puits et mesurez la fluorescence des puits en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 540 nanomètres et une longueur d'onde d'émission de 590 nanomètres.Afin de quantifier la viabilité bactérienne et la sensibilité aux médicaments, soustrayez d'abord la fluorescence de fond du témoin blanc des autres puits. Ensuite, calculez le pourcentage d'inhibition en divisant la fluorescence moyenne de chaque concentration par la fluorescence moyenne des témoins non traités, puis en multipliant par 100. La B-S-M-Y-C est définie comme la concentration d'antibiotique provoquant une inhibition de 90 % de l'activité métabolique, comme le montrent ces micrographies électroniques : les cellules cultivées en biofilms diffèrent considérablement des bactéries cultivées en cultures planctoniques.En particulier, de grandes quantités de matrice extracellulaire, indiquées en jaune, entourent les cellules du biofilm en vert, mais pas celles des colonies planctoniques. De plus, les bactéries présentes dans les biofilms sont généralement plus résistantes aux antibiotiques dans cette expérience. La concentration minimale inhibitrice de la tobramycine pour la culture planctonique de Pseudomonas aeruginosa en bleu s'est révélée d'environ quatre microgrammes par millilitre.En revanche, comme indiqué en rouge, 100 % des bactéries présentes dans les biofilms ont survécu à des concentrations allant jusqu'à 512 microgrammes par millilitre d'antibiotique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment cultiver des bactéries dans un milieu de mucosités artificiel défini. Vous devriez également être capable de réaliser un test de sensibilité aux antibiotiques afin de déterminer la concentration minimale inhibitrice nécessaire pour inhiber la croissance bactérienne dans un environnement plus proche de celui observé dans les poumons de patients atteints de mucoviscidose.

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Immunologie et infection

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Source: Jackson, L., et al. Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in situ visualization of Pseudomonas aeruginosa within chemically cleared cystic fibrosis sputum using fluorescent labeling and confocal microscopy to reveal bacterial localization and biofilm structure.

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