L'utilisation de moyen d'expectoration artificielle pour tester l'efficacité des antibiotiques contre

L'objectif de cette expérience est d'évaluer l'efficacité des antibiotiques contre les biofilms de Pseudomonas aeruginosa dans des conditions représentatives des infections chroniques observées dans les poumons de patients atteints de mucoviscidose, en utilisant un milieu de crachats artificiel défini. Les biofilms bactériens sont cultivés dans des plaques de microtitration à 24 puits.

Les biofilms sont ensuite exposés à des antibiotiques. Ensuite, les cultures traitées par l'antibiotique sont désagrégées à l'aide de cellulase et incubées avec un colorant métabolique srin, qui passe du bleu au rose sous l'action des cellules viables. En mesurant l'absorbance des puits, on peut déterminer la concentration minimale inhibitrice des cellules de biofilm, ou B-S-M-I-C, afin de quantifier la sensibilité aux antibiotiques dans des conditions proches des conditions physiologiques.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la détermination des concentrations minimales inhibitrices basée sur une culture planctonique, est que les bactéries sont cultivées dans un milieu spécialisé contenant tous les composants du crachat, favorisant ainsi la formation de biofilms. Ces biofilms sont nettement plus résistants aux antibiotiques. Pour préparer le milieu, commencez par préparer deux flacons contenant chacun 250 millilitres d'eau stérile dans le premier flacon.

Ajoutez progressivement en remuant, puis ajoutez quatre grammes d'ADN de sperme de poisson à 250 millilitres d'eau stérile. Mélangez la solution à température ambiante et laissez l'ADN se dissoudre dans le deuxième flacon. Ajoutez progressivement cinq grammes de mucine de type deux provenant de l'estomac porcin et remuez.

Une fois les solutions d'ADN et de mucine prêtes, dissoudre les acides aminés dans 100 millilitres d'eau stérile, à l'exception de la L-tyrosine et de la L-cystéine, qui doivent être dissoutes respectivement dans 25 millilitres d'eau ou dans 25 millilitres de potasse 0,5 molaire. Ensuite, préparer 5,9 milligrammes de DTPA, cinq grammes de chlorure de sodium et 2,2 grammes de chlorure de potassium dans 100 millilitres d'eau. Combiner toutes les solutions différentes dans une bouteille d'un litre, puis ajouter cinq millilitres d'émulsion de jaune d'œuf, et compléter le mélange jusqu'à 850 millilitres avec de l'eau.

À l'aide d'une solution molaire de triss, ajustez le pH à 6,9 et complétez le volume final à un litre avec de l'eau. Pour stériliser le milieu, filtrez-le à l'aide d'une pompe à vide de marque ME deux, munie d'un diaphragme, et d'un système de filtration stérile Millipore doté d'un embout de 45 millimètres et d'une taille de pore de 0,2 micron. Le processus de filtration peut être réalisé sur deux jours. Le milieu A SM peut être conservé à quatre degrés Celsius pendant un mois au maximum.

Commencez par diluer des cultures de pseudomona arosa incubées toute une nuit dans du milieu LB afin d'obtenir une DO de 0,05. Ensuite, diluez davantage les bactéries au ratio de 1 à 100 dans une plaque de milieu SM, en ajoutant 1,8 millilitre de culture bactérienne diluée par puits dans 21 puits d'une plaque de culture tissulaire de 24 puits, et ajoutez le même volume de milieu SM dans les trois puits restants, qui serviront de témoins négatifs blancs. Fermez hermétiquement la plaque de 24 puits contenant le biofilm, puis placez-la dans des conditions microaérophiles afin de permettre la formation de biofilms, conditions que l'on peut obtenir à l'aide de sachets générateurs de gaz CampyGen placés dans de grands bocaux anaérobies.

Incuber la culture dans un agitateur réglé à 75 tr/min pendant trois jours à 37 degrés Celsius. Après trois jours, les biofilms apparaîtront sous forme d'une masse gélatineuse contenant des cellules bactériennes et ne pourront pas être disruptés par pipetage. Une fois les biofilms formés, ajouter 200 microlitres par puits d'antibiotique à des concentrations diluées en série. Veiller à préparer au moins quatre réplicats pour chaque concentration de médicament à tester et à laisser quatre puits contenant des biofilms non traités afin qu'ils puissent servir de témoins négatifs.

Ensuite, incuber les plaques préalablement pendant encore 24 heures après l'incubation avec les antibiotiques. Utiliser 100 microlitres par puits de cellulase diluée à 100 milligrammes par millilitre dans un tampon citrate pour rompre les biofilms, puis incuber les plaques sur un agitateur réglé à 150 tr/min en conditions aérobies à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après cette incubation, un pipetage manuel peut être utilisé pour désagréger davantage les biofilms si des agrégats cellulaires sont visibles dans le milieu.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de rezin par puits pour quantifier la viabilité des cellules libérées des biofilms, puis incubez les cellules pendant une à deux heures. À 37 degrés Celsius, seules les cellules viables sont capables de métaboliser le colorant bleu zarin en sa forme rose fluorescente. Après l'incubation, transférez les échantillons dans une plaque de 96 puits et mesurez la fluorescence des puits en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 540 nanomètres et une longueur d'onde d'émission de 590 nanomètres.

Afin de quantifier la viabilité bactérienne et la sensibilité aux médicaments, soustrayez d'abord la fluorescence de fond du témoin blanc des autres puits. Ensuite, calculez le pourcentage d'inhibition en divisant la fluorescence moyenne de chaque concentration par la fluorescence moyenne des témoins non traités, puis en multipliant par 100. La B-S-M-Y-C est définie comme la concentration d'antibiotique provoquant une inhibition de 90 % de l'activité métabolique, comme le montrent ces micrographies électroniques : les cellules cultivées en biofilms diffèrent considérablement des bactéries cultivées en cultures planctoniques.

En particulier, de grandes quantités de matrice extracellulaire, indiquées en jaune, entourent les cellules du biofilm en vert, mais pas celles des colonies planctoniques. De plus, les bactéries présentes dans les biofilms sont généralement plus résistantes aux antibiotiques dans cette expérience. La concentration minimale inhibitrice de la tobramycine pour la culture planctonique de Pseudomonas aeruginosa en bleu s'est révélée d'environ quatre microgrammes par millilitre.

En revanche, comme indiqué en rouge, 100 % des bactéries présentes dans les biofilms ont survécu à des concentrations allant jusqu'à 512 microgrammes par millilitre d'antibiotique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment cultiver des bactéries dans un milieu de mucosités artificiel défini. Vous devriez également être capable de réaliser un test de sensibilité aux antibiotiques afin de déterminer la concentration minimale inhibitrice nécessaire pour inhiber la croissance bactérienne dans un environnement plus proche de celui observé dans les poumons de patients atteints de mucoviscidose.