Odorant induites réponses enregistrées à partir de neurones récepteurs olfactifs en utilisant la technique de la pipette d'aspiration

L’objectif global de cette procédure est d’enregistrer les réponses induites par les odeurs des neurones récepteurs olfactifs de souris. Ceci est accompli en disséquant d’abord l’épithélium olfactif et en isolant les neurones récepteurs olfactifs de la souris. La deuxième étape consiste à placer les neurones récepteurs olfactifs isolés dans une chambre d’enregistrement montée sur un microscope inversé.

Des micromanipulateurs maintiennent l’électrode d’enregistrement et un changeur de solution. Ensuite, aspirez un neurone récepteur olfactif identifié dans l’extrémité d’une électrode de pipette d’aspiration. La dernière étape consiste à placer la pipette avec la cellule aspirée dans sa pointe devant un changeur de solution pour exposer le neurone à des odorants.

En fin de compte, la méthode d’enregistrement à la pipette aspirante est utilisée pour étudier la fonction des neurones des récepteurs olfactifs. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la technique de pince de tension de cellule entière est qu’elle permet de longues durées d’enregistrement en utilisant des changements de solution rapides et précis. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la forme de la pipette d’enregistrement est importante et il est difficile d’apprendre à placer les cellules de l’alvéole de manière stable dans la pointe de la pipette.

Commencez cette procédure en tirant une micro-pipette avec un capillaire en verre de bosilicate déploré UNFI dans un extracteur de micro-pipette à long cône. Transférez ensuite la pipette dans un porte-micro-pipette sur mesure monté sur un microscope vertical. Le microscope est doté d’un rouge dans l’oculaire et d’un couteau en diamant mobile monté sur la platine.

Ensuite, observez la pointe de la pipette sous l’objectif 20 x. Utilisez le redle comme guide. Tracez délicatement la pipette à un angle de 90 degrés à l’aide du couteau diamanté fabriqué sur mesure au diamètre extérieur de la pipette de 10 micromètres.

Déplacez le couteau diamanté plus loin vers la pointe. Appliquez progressivement une pression dessus. La pointe de la pipette doit se casser proprement à l’endroit où elle a été gravée.

Ensuite, sous un feu d’objectif 40x, polissez la pointe de la pipette à un diamètre intérieur de cinq micromètres à l’aide d’un filament chauffé électriquement. Une fois terminée, la micro-pipette est prête à être utilisée pour enregistrer les courants des souris orns. À l’étape suivante, sacrifiez une souris et retirez sa tête.

Ensuite, retirez la peau recouvrant le crâne, puis coupez la tête en deux le long de la ligne médiane. Ensuite, transférez les deux têtes Hemi dans un stéréomicroscope à dissection. Retirez la cloison nasale et retirez les cornets olfactifs.

Placez le tissu dans une boîte de Pétri avec une solution de ringer de mammifère contenant du glucose. Après cela, décollez l’épithélium olfactif du cartilage sous-jacent de deux cornets. Transférez le tissu dans un tube einor contenant 250 microlitres de ringer.

Conservez ensuite le tissu restant à quatre degrés Celsius pour plus tard. Utilisez vortex, le tube EOR contenant l’épithélium olfactif, deux fois brièvement, pendant une seconde à vitesse moyenne. Cette étape conduit à la dissociation mécanique du NS de l’épithélium.

Placez ensuite la solution de ringer contenant les orns dissociés dans la chambre d’enregistrement montée sur le microscope, retirez les gros morceaux de tissu dans la suspension à l’aide d’une paire de pinces fines. Laissez l’ORN reposer pendant 20 minutes avant de commencer la perfusion continue avec la solution de ringer et de passer aux enregistrements dans cette procédure, remplissez la pipette de solution de ringer. Placez la pipette dans le support de pipette et fixez-le à la tête de l’amplificateur de la pince de raccordement.

Ensuite, connectez la conduite d’huile à l’orifice latéral du porte-pipette. Abaissez ensuite la pipette dans la chambre d’enregistrement. Réglez la hauteur du réservoir d’huile pour établir une pression légèrement positive à l’extrémité de la pipette.

Cela peut être fait en observant les débris cellulaires s’éloigner ou se rapprocher de la pipette. Essayez de ne pas contaminer l’extrémité de la pipette avec des débris cellulaires. Ensuite, scannez la chambre d’enregistrement à la recherche d’un ORN isolé, qui peut être reconnu par sa morphologie bipolaire typique à l’aide d’un grossissement de 20 à 40 x.

Déplacez ensuite l’électrode d’enregistrement à proximité du corps de la cellule ORN. Aspirez doucement l’air relié au réservoir d’huile afin que le corps cellulaire pénètre dans l’extrémité de la pipette. Continuez à appliquer l’aspiration avec précaution et lentement jusqu’à ce que tout le corps cellulaire soit aspiré dans l’extrémité de la pipette d’aspiration, laissant la dendrite et les cils exposés à la solution du bain.

Déplacez la pipette d’aspiration de la section contenant les orns décantés vers la section d’enregistrement de la chambre. Placez soigneusement la pipette d’aspiration devant le tube à trois barillets pour l’échange de solution. La pipette d’aspiration doit être placée suffisamment près de l’ouverture du tube à trois barils pour que l’ORN soit exposé à un flux laminaire et évite ainsi les turbulences de mélange. Pour réaliser l’échange de solution, déplacez la limite entre les flux parallèles de solution qui s’écoule du tube à trois barils du changeur de solution à travers l’extrémité de la pipette d’aspiration pour surveiller la qualité et la fiabilité de l’échange de solution.

Le courant de jonction évoqué par le déplacement de la cellule entre des solutions de composition ionique différente peut être mesuré. Le temps d’échange de la solution est généralement d’environ 20 millisecondes. Lorsque le neurone récepteur olfactif est inséré dans une solution odorante, une réponse évoquée par l’odorant peut être provoquée ici.

Un ORN a été exposé à une centaine de micro molaires d’eugénol pendant une seconde, comme l’indique la barre au-dessus de l’enregistrement. Dans le panneau supérieur, le courant du récepteur a été filtré à une bande passante de zéro à 50 hertz pour afficher le courant du récepteur Seul le panneau inférieur montre le même enregistrement filtré à la large bande passante de zéro à 5 000 hertz pour afficher également les potentiels d’action. Voici les doses-réponses d’un ORN sensible à l’eugénol L’eugénol a été utilisé à des concentrations allant de 0,3 micromolaire à cent micromolaires.

La durée du stimulus était d’une seconde et les traces étaient filtrées de zéro à 50 hertz. Une augmentation progressive de la concentration d’odorant a conduit à une réponse plus importante et plus rapide, qui s’est également terminée plus lentement. Une fois l’exposition aux odorants terminée, les ORNS peuvent afficher un modèle de réponse oscillatoire lors de longues stimulations à des concentrations intermédiaires d’odorisant.

Ici, un ORN sensible à l’acétophénone a été stimulé pendant huit secondes après une réponse maximale rapide et transitoire au début de la stimulation. Une série de réponses récurrentes plus petites sont observées lors de la tentative de cette procédure. Il est important de ne pas oublier de manipuler les neurones récepteurs olfactifs avec précaution et d’être très patient.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.