Détection MicroRNA dans les tumeurs prostatiques par quantitative PCR en temps réel (qPCR)

L'objectif général de l'expérience suivante est de quantifier les niveaux d'expression de molécules d'ARN micro dans le cancer de la prostate et les tissus prostatiques normaux à l'aide de la PCR quantitative en temps réel. Cela est réalisé en extrayant d'abord l'ARN total à partir de tissus prostatiques. Cela inclut l'ARN micro, ainsi que d'autres petits ARN.

Ensuite, l'ARN est rétrotranscrit pour générer de l'ADNc. Puis une PCR en temps réel basée sur le colorant SYBR Green est réalisée en utilisant l'ADNc comme matrice afin d'amplifier et de quantifier l'expression des microARN en temps réel. Les résultats obtenus montrent l'expression relative des microARN dans divers échantillons prostatiques, fondée sur la PCR quantitative en temps réel.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes réside dans sa grande sensibilité, sa précision, sa reproductibilité, ainsi que sa rapidité et son faible coût. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions essentielles dans le domaine de la biologie du cancer, car l'expression des microARN est souvent corrélée aux gènes fortement impliqués dans le processus tumoral. Nous pouvons donc utiliser la QPCR pour évaluer l'expression des microARN et analyser la manière dont celle-ci est corrélée avec des variables cliniques.

Ces biomarqueurs pourraient potentiellement être utilisés à la fois comme outils diagnostiques et pronostiques. Ils pourraient nous aider à diagnostiquer le cancer de la prostate ainsi qu'à déterminer quels cancers de la prostate sont agressifs. De plus, ces biomarqueurs pourraient présenter un potentiel en tant qu'agents thérapeutiques.

Cette méthode peut non seulement fournir des informations sur la genèse des tumeurs de la prostate, mais elle peut également être appliquée à d'autres cancers et maladies. Prélevez des échantillons de prostate au moment de l'ectomie et orientez l'échantillon en utilisant des repères anatomiques. Coloriez la prostate et les vésicules séminales comme suit : côté droit en vert, côté gauche en bleu.

Prenez une coupe transversale aléatoire au milieu du tissu perpendiculaire à la surface rectale, congélez l'échantillon et conservez-le à moins 80 degrés Celsius. Faites une photocopie, orientez les tranches des spécimens et divisez-les en quatre parties égales. Consultez un pathologiste afin de déterminer les zones tumorales par rapport aux zones normales sur l'image correspondante.

Utilisez les zones marquées comme guide pour identifier le tissu tumoral destiné à l'extraction d'ARN pour isoler l'ARN. Commencez par placer les échantillons prostatiques congelés sur de la glace sèche et en vous référant à la photocopie délimitée. Prélevez une petite portion du tumeur de la prostate.

Homogénéisez le tissu tumoral de la prostate dans un millilitre de réactif triol. Incubez les échantillons homogénéisés pendant cinq minutes. Ajoutez 0,2 millilitre de chloroforme aux échantillons à température ambiante et agitez vigoureusement pendant 15 secondes.

Incuber les échantillons pendant trois minutes à température ambiante, puis centrifuger à 12 000 ×g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer la phase aqueuse supérieure incolore dans des tubes neufs et ajouter 0,5 millilitre d'alcool isopropylique. Incuber les échantillons pendant 10 minutes à température ambiante, puis centrifuger à 12 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Aspirez soigneusement le surnageant sans perturber le culot contenant l'ARN. Ajoutez un millilitre d'éthanol à 75 % au culot d'ARN, vortexez l'échantillon, puis sédimentez par centrifugation pendant cinq minutes à 7 500 ×g à quatre degrés Celsius. Aspirez à nouveau le surnageant et séchez le culot d'ARN pendant cinq à dix minutes, en veillant à ce qu'il ne devienne pas complètement sec.

Rouge, dissoudre le culot dans de l'eau sans nucléase et utiliser un spectrophotomètre pour mesurer la concentration de l'ARN. Utiliser un bioanalyseur pour vérifier la qualité et l'intégrité des échantillons d'ARN. Réaliser la transcription inverse de l'ARN en ADNc à l'aide d'un kit de transcription inverse, selon les instructions du fabricant.

Pour générer une courbe standard, préparez une série de dilutions de l'ADNc original à partir d'un échantillon dont on sait qu'il présente une expression importante du gène d'intérêt. Réalisez une PCR en temps réel en préparant un mélange maître basé sur un volume de réaction de 20 microlitres de deux x quant. Détectez le mélange maître PCR cyber green 10 x microscript amorce universelle, 10 x microscript test d'amorces et de l'eau libre d'ARN.

Inclure deux jeux d'amorces, l'un pour le gène cible et un autre pour le gène de référence, dans ce cas, RNU six B. Pipeter deux microlitres de chaque dilution d'ADNc dans des tubes capillaires individuels du light cycler, puis ajouter 18 microlitres du mélange maître. Utiliser un adaptateur capillaire pour la centrifugation. Placer les capillaires dans un thermocycleur en temps réel à base de capillaires et exécuter le programme de PCR selon les instructions suivantes : 95 degrés Celsius pendant 15 minutes, suivi de 50 cycles de 94 degrés Celsius pendant 15 secondes.

55 degrés Celsius pendant 30 secondes et 70 degrés Celsius. Pendant 30 secondes, sélectionnez un échantillon comme calibrateur et fixez sa quantité cible normalisée à un. Comparez l'expression relative du micro ARN dans tous les autres échantillons par rapport au calibrateur afin de générer des courbes d'amplification.

Pour les réactions de PCR, utilisez le logiciel Molecular Biochemicals Light Cycler version 3.5 dans l'onglet de quantification. Quantifiez les réactions et exportez les données vers un fichier texte. Importez les données dans le logiciel d'analyse REL Quant pour générer les résultats de quantification.

Importez des fichiers séparés pour le gène cible, le gène de référence et les données de la courbe standard. Spécifiez la position du témoin pour le gène cible et le gène de référence, ainsi que les positions des échantillons. Les données sont exprimées comme le rapport cible sur référence de différents échantillons divisé par le rapport cible sur référence du témoin.

Utilisez la courbe standard précédemment établie pour un microARN et un gène de référence particuliers comme étalon de référence afin d'extrapoler les données quantitatives pour le microARN. Cibles de concentrations inconnues. Analysez trois échantillons en tant que groupe et calculez les concentrations moyennes et les écarts-types des triplicats.

Si l'un des triplicats est incohérent par rapport au reste du jeu, le programme l'exclura. Voici un exemple d'analyse A-Q-P-C-R de prélèvements prostatiques. Les graphiques montrent que les niveaux d'expression du gène de référence U six commencent l'amplification exponentielle vers le cycle 20, tandis que l'expression du gène cible, MIR 98, présente un démarrage retardé de l'amplification vers le cycle 25.

Les données de cette expérience ont été exportées sous forme de fichier texte et analysées à l'aide du logiciel d'analyse requ. Les positions des capillaires contenant l'étalon et les échantillons sont précisées. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée si elle est effectuée correctement. La fiabilité de cette technique dépend de la qualité de l'ARN.

Par conséquent, il est important de faire preuve de prudence lors de la manipulation de l'ARN, car celui-ci peut se dégrader très facilement.