Name: Préparation de dérivés myéloïdes cellules suppressives (MDSC) de Naive et pancréatique souris porteuses de tumeurs par cytométrie en flux et automatisé de tri magnétique de cellules activées (autoMACS) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Apprenez à isoler les cellules MDSC viables à partir de la rate de souris par cytométrie en flux et tri magnétique AutoMACS. Cette méthode rapide permet d'enrichir efficacement les leucocytes Gr-1+ pour des études immunologiques.

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Nous reconnaissons le flux USF cytométrie Core Facility. Nous tenons à remercier le Dr Denise Cooper pour le partage des ressources. Nous aimerions également remercier Maya Cohen, Laura Pendleton et Diana Latour pour leur aide dans la mise en place et le tournage de cette vidéo. NN soutenu par la NSF FG-LSAMP pont à la bourse de doctorat DRH # 0929435. Ce travail a été financé par l&#39;American Cancer Society Research Grant # institutionnel 93-032-13/Moffitt Cancer Center attribué à TG.

Avant de commencer, préparer les solutions suivantes: 3% de coloration des médias (SM): -3% De sérum bovin foetal (FBS) dans 1X tampon phosphate salin (PBS) MACS tampon (Mo): - 0,5% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) dans 1XPBS 1. Les rates de récolte provenant de souris <ol><li> Voie sous-cutanée d&#39;injecter 6-8 semaines d&#39;âge C57BL / 6 souris (Harlan) avec 1,5 x 10 5 murins Panc02 cellules en suspension dans 100 ul de PBS 1x (porteur de tumeurs; TB). Les souris témoins (Naïve) de recevoir 100 1XPBS ul. </li><li> Environ quatre semaines après l&#39;injection, les souris euthanasier par asphyxie de dioxyde de carbone. </li><li> Rates de récolte de la souris par dissection aide de pinces et ciseaux, puis peser à l&#39;aide d&#39;un équilibre. Placer les rates séparé, étiqueté tubes de 50 ml coniques contenant 1 x PBS. </li></ol> 2. Générer un Fourches unicellulairen des leucocytes de la rate Toutes les procédures doivent être effectuées dans un environnement stérile sous une hotte de sécurité biologique et les cellules et d&#39;anticorps conservés sur la glace. <ol><li> Assembler le tamis de dissociation cellulaire par l&#39;insertion du tamis à mailles dans l&#39;ouverture de la coupelle vers le bas. Ensuite, insérez la bague de retenue dans la zone filetée avec le côté rainuré et d&#39;utiliser le porte-clés pour serrer la bague de retenue, tenant ainsi à l&#39;écran en place. Placez le tamis monté dans une boîte de Pétri contenant 10 ml 1 x PBS. </li><li> Rates Piscine et pilon en verre utilisation pour moudre la rate contre le grillage de la cellule de dissociation tamis et dans la boîte de Pétri. Répétez l&#39;opération pour chaque groupe de traitement de la souris. </li><li> Suspension cellulaire filtre dans un tube de 50 ml conique à l&#39;aide d&#39;une passoire 70 um cellulaire et d&#39;une pipette de 5 ml sérologique. Centrifuger à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min. </li><li> Enlever le surnageant et remettre en suspension le culot dans 5 ml 1 x tampon de lyse RBC par la rate. Pipet et vigoureusement vers le bas. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Arrêter la réaction en ajoutant 20 ml de 1 x PBS. Pipet et vigoureusement vers le bas. Centrifuger à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min. </li><li> Enlever le surnageant et remettre en suspension le culot dans 20 ml de PBS stérile 1 x. Pipet et vigoureusement vers le bas. </li><li> Compter les cellules en utilisant le bleu trypan et un hémacytomètre et resuspendre à la concentration désirée en SM 3% de telle sorte que 50 pl est équivalente à 5x10 5-1x10 6 cellules (1x10 7 cellules / ml - 2x10 7 cellules / ml). </li></ol> 3. Cell-surface de coloration / immunophénotypage des MDSC par cytométrie en flux <ol><li> Étiquetez les puits d&#39;une plaque de 96 puits fond en V pour le contrôle et les échantillons expérimentaux et des taches simples pour les contrôles de rémunération (n ° Teinté, NS; Mac-1-FITC; Gr-1-APC et DAPI). </li><li> Ajouter 5x10 5-1x10 6 cellules équivalentes à 50 pl / puits de splénocytes à leurs puits respectifs dans le 96-V-même la plaque inférieure. Centrifugerplaque à 12.000 tours par minute (250-300 xg) pendant 5 min. </li><li> Préparer &quot;Mix Master&quot; (MM) de la souris BD Bloquer Fc (rat anti-souris CD16/32 anticorps monoclonal) dilué dans SM 3%, dans un microtube de 1,5 ml sur la glace. Comme point de départ, utilisez 1 ug Fc Bloquer dans SM 3% pour un volume final de 50 ul par puits. </li><li> Retirez délicatement le surnageant de chaque puits de la 96-V-même la plaque inférieure en mettant rapidement inverser la plaque sur et à l&#39;arrière, sur un conteneur à déchets ou dans l&#39;évier sans interruption des culots cellulaires. </li><li> Vortex, centrifuger brièvement MM Bloquer Fc pendant 5 secondes et ajouter 50 ul à tous les granulés dans le 96-V-même la plaque inférieure. Bien mélanger en douceur pipetant, laissant des échantillons dans leurs puits. Incuber la plaque pendant 15 min dans l&#39;obscurité sur la glace. Centrifuger la plaque à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min. </li><li> Préparer &quot;Mix Master&quot; (MM) de fluorochrome-anticorps conjugués dilués dans SM 3% dans un microtube de 1,5 ml sur la glace, tandis que les échantillons incuber avec le bloc Fc. Anticorps doit être adaptéepour déterminer les dilutions optimales pour les procédures de coloration. Comme point de départ, combiner une dilution 1:25 de Mac-1-FITC et dilution 1:20 de Gr-1-APC dans SM 3% pour un volume final de 50 ul, par échantillon. </li><li> Retirez délicatement le surnageant de chaque puits de la 96-V-bottom et comme décrit précédemment. </li><li> Vortex, centrifuger brièvement MM d&#39;anticorps conjugués coloration fluorescente pendant 5 secondes et ajouter 50 ul de contrôle et de pastilles expérimentales. Bien mélanger en douceur pipetant. Pour une seule tache compensations, ajoutez une dilution 1:25 de Mac-1-FITC, dilution 1:20 de Gr-1-APC et 75 ng / ml de DAPI, dans SM 3% pour un volume final de 50 ul par puits à leurs puits respectifs. Ajouter 50 ul SM 3% à souillé bien (aucune tache). Bien mélanger et incuber les cellules dans 96 puits à fond en V plaque pendant 30 min dans l&#39;obscurité sur la glace. </li><li> FACS étiquettes des tubes (5 ml, 12 mm x 75 mm tubes en polystyrène fond rond) pour correspondre à chaque puits de la plaque de 96 puits à fond en V. Ajouter 200 ul SM 3% à chaque FACSTube. </li><li> Centrifuger la plaque à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min et retirez surnageants. Laver granulés par addition de 100 ul SM 3% à chaque pastille et bien mélanger délicatement par aspiration et refoulement. Centrifuger la plaque à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min. Répétez l&#39;étape laver une fois de plus. </li><li> Retirez délicatement le surnageant de chaque puits de la 96-V-bottom et comme décrit précédemment. Remettre en suspension chaque culot dans 100 SM 3% ul et bien mélanger. </li><li> Transférer 100 ul culot remis en suspension à partir de chaque puits de la 96-V-même la plaque inférieure à leur tube FACS respectivement étiquetés. </li><li> Avant l&#39;analyse des flux cytométrie, ajouter 75 ng / ml de DAPI à contrôler et échantillons expérimentaux et de contrôle unique de compensation DAPI tache. </li><li> Effectuer flux d&#39;acquisition de données par cytométrie de pourcentages MDSC. Effectuer une compensation utilisant le négatif (pas de contrôle tache) et les contrôles simples positifs. Mettre en place un dot plot qui affiche la diffusion vers l&#39;avant (FSC) par rapport à côté (SSC) en échelle logarithmique afin que les populations de leucocytes deintérêt peut être identifié. Dessiner une grande porte sur tous les leucocytes, à l&#39;exclusion des débris et des bouquets avec le plus bas vers l&#39;avant et la diffusion latérale. De cette porte parent, créez un tracé nouveau point qui affiche SSC par rapport DAPI et porte sur DAPI-(live) des cellules. Sélectionnez cette population nouvellement fermé et créer un nuage de points qui affiche Mac-1 par rapport Gr-1 et la porte sur votre positif double (Mac-1 + Gr-1 +) MDSC. </li></ol> 4. Enrichissement magnétique de GR-1 + de leucocytes <ol><li> Aliquotes 1x10 7 autres leucocytes non colorés dans des tubes FACS étiquetés de façon appropriée et centrifuger à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min. </li><li> Préparer MM de Gr-1-PE anticorps dans un microtube de 1,5 ml. Pour un maximum de 10 7 cellules, utilisez une dilution 1:10 de Gr-1-PE anticorps dans 50 Mo ul, par échantillon. Pour les numéros de cellulaires plus, l&#39;échelle des volumes en conséquence. Centrifuger brièvement pendant 5 secondes, ajouter aux leucocytes dans des tubes FACS et incuber pendant 15 min à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li&gt; <li> Ajouter 2 ml de bromure de méthyle à des tubes FACS, de centrifugeuses à 12.000 tours par minute (250-300 xg) pendant 5 min et éliminer le surnageant. </li><li> Préparer MM de l&#39;Anti-PE microbilles dans un microtube de 1,5 ml. Pour un maximum de 10 7 cellules, utiliser une dilution 1:04 de l&#39;anti-PE microbilles dans 200 MB ul, par échantillon. Pour les numéros de cellulaires plus, l&#39;échelle des volumes en conséquence. Centrifuger brièvement pendant 5 secondes, ajouter aux leucocytes dans des tubes FACS et incuber pendant 15 min à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Ajouter 2 ml de bromure de méthyle à des tubes FACS, de centrifugeuses à 12.000 tours par minute (250-300 xg) pendant 5 min et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot dans 3 ml de SB. Filtrez dans une passoire 70 um dans une nouvelle, marquée tube de 50 ml conique. </li><li> Préparer et le Premier MACS Auto Pro Separator. Recharge toutes les bouteilles avec les solutions appropriées et de vider la bouteille de déchets, si nécessaire. Activer instrument sur et examiner l&#39;état de récipients de fluide et de colonne (s) après l&#39;initialisation. Tous les symboles doivent être de couleur verte. Dans le menu, sélectionnez &quot;Séparation&quot; de la partie supérieurebarre de menu puis &quot;Lavez maintenant&quot; de la barre de menu inférieure. Sélectionnez &quot;Rinçage&quot; de l&#39;option pop-up suivi de &quot;Run&quot; pour démarrer le processus d&#39;amorçage. Une fois le processus d&#39;amorçage est terminé avec succès, l&#39;instrument affichera alors qu&#39;il est &quot;prêt pour la séparation&quot; dans le menu Status. </li><li> Choisissez convient portoir réfrigéré pour les tailles de tubes et les placer tube de 50 ml conique avec des cellules marquées magnétiquement dans la ligne A, 50 ml tube conique pour la collecte de la fraction négative à la ligne B et 15 ml tube conique pour la collecte de fraction positive dans la ligne C. </li><li> Choisissez &quot;POSSEL_S&quot; programme de séparation des cellules pour la sélection positive des cellules cibles marquées en mode sensible à partir d&#39;échantillons. Cellules cibles marquées magnétiquement sont retenus sur la colonne automates; cellules non marquées sont libérés dans le tube de prélèvement fraction négative dans B. Sur la ligne de rétraction automatique de l&#39;aimant, les cellules cibles marquées seront libérés dans le tube de prélèvement positif à la ligne C du tube crémaillère. </li></ol>+ de leucocytes enrichies <ol><li> Recount Gr-1 + et Gr-1 - fractions en utilisant du bleu trypan et un hémocytomètre. Resuspendre les cellules à concentration souhaitée dans le milieu de coloration 3% alors que 50 ul est équivalent à 5x10 5-1x10 6 cellules (1x10 7 cellules / ml - 2x10 7 cellules / ml) et le transfert de 50 pi à conséquence étiquetés tubes FACS. </li><li> Préparer un MM de Mac-1 seulement, à une dilution 1:25 dans SM 3% pour un volume final de 50 ul par échantillon. Colorer les cellules et de préparer simples compensations taches de Gr-PE, Mac-1 FITC et DAPI pour l&#39;analyse par cytométrie en flux. Ajouter 200 pi 3% SM et le colorant DAPI viabilité comme décrit précédemment. </li><li> Effectuer flux d&#39;acquisition par cytométrie de données pour déterminer Gr-1 + et Gr-1 - pourcentages et aussi comparer les pourcentages MDSC enrichissement pré-et post-autoMACS. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Ici, nous montrons r<html> résultats eprésentant pour l&#39;enrichissement autoMACS de Gr-1 + leucocytes à partir du mélange, la rate naïfs pour FACS ultérieures de tri du MDSC (Figure 1). 1x10 6 leucocytes naïfs ont été colorées avec Mac-1-FITC et Gr-1-APC anticorps pour identifier les pourcentages MDSC en utilisant un instrument BD LSRII, avant tri autoMACS. 1x10 7 leucocytes naïfs ont ensuite été colorées avec des anticorps anti-Gr-1-PE anticorps et PE-Microbilles pour l&#39;enrichissement de la Gr-1 + leucocytes en utilisant un séparateur autoMACS Pro. Post-autoMACS enrichissement, GR-1 pourcentages en Gr-1 + et Gr-1 - fractions recueillies ont été évaluées en utilisant la cytométrie de flux. 1x10 6 Gr-1 + de leucocytes ont été enlevés et colorées avec Mac-1-FITC anticorps à analyser et à comparer les pourcentages de MDSC enrichi, mis en commun des leucocytes naïfs à la non-enrichi, mis en commun porteuses de tumeurs leucocytes par cytométrie de flux. fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. L&#39;enrichissement autoMACS de Naïve Gr-1 + leucocytes pour FACS MDSC de tri. Les rates ont été récoltées à partir de souris porteuses de tumeurs pancréatiques et naïf et transformé en mono-cellulaires suspensions. Cytométrie en flux de surface de leucocytes colorés avec naïfs Mac-1 et Gr-1 fluorescente-conjugués d&#39;anticorps, avant l&#39;enrichissement autoMACS (A). L&#39;analyse par cytométrie en flux de Gr-1 + (B) et Gr-1 - (C) des fractions post-autoMACS enrichissement de Gr-1 + cellules de mise en commun leuckocytes naïfs colorées avec Gr-1-PE et des anticorps anti-PE microbilles. L&#39;analyse par cytométrie en flux du MDSC et Gr-1 + pourcentages post-autoMACS enrichissement de Gr-1 + de cellules de mise en commun des leucocytes naïfs (D) par rapport aux non-enrichis leucocytes communs de souris porteuses de tumeurs (E) (souris naïves, n = 5 ; souris porteuses de tumeurs, n = 3). MDSC et GR-1 pourcentages sont déclenchés dans les tracés de contours représentatives et des histogrammes.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Il s&#39;agit d&#39;une méthode détaillée pour le traitement et immunophentyping populations MDSC qui est applicable à différents tissus lymphoïdes de modèles animaux différents. En particulier, l&#39;enrichissement autoMACS peut être utilisé pour l&#39;isolement des différents populations de leucocytes comprenant Gr-1 épuisement des splénocytes 4, la purification de sous-ensembles à partir de splénocytes myéloïdes et les ganglions lymphatiques 5, isolement de la moelle osseuse neutrophiles 14...

<table border="1"><tbody><tr><td> REACTIF </td><td> SOCIÉTÉ </td><td> Catalogue </td><td> COMMENTAIRES </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline 1X </td><td> Thermo Scientific Hyclone </td><td> SH30028.02 </td><td> Ca 2 + / Mg 2 + / rouge de phénol libre </td></tr><tr><td> L&#39;albumine de sérum bovin (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> Laissez dissoudre BSA intacte dans du PBS; Environnement stérile </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal (FBS) </td><td> Thermo Scientific Hyclone </td><td> SV3001403HI </td><td> Inactivé par la chaleur; Environnement stérile </td></tr><tr><td> Rat anti-souris CD16/32 anticorps monoclonal (Fc Bloquer) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553142 </td><td> Environnement stérile </td></tr><tr><td> Anti-souris CD11b (Mac-1) FITC </td><td> eBiosciences </td><td> 11-0112 </td><td> StérileEnvironnement </td></tr><tr><td> Anti-souris Ly6G (Gr-1) APC </td><td> eBiosciences </td><td> 17-5931 </td><td> Environnement stérile </td></tr><tr><td> Anti-souris Ly6G (Gr-1) PE </td><td> eBiosciences </td><td> 12-5931 </td><td> Environnement stérile </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D1306 </td><td> Environnement dilution en série stérile </td></tr><tr><td> Dissociation cellulaire Sieve </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CD1-1kt </td><td> Autoclave avant utilisation </td></tr><tr><td> 70-um crépine </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> Environnement stérile </td></tr><tr><td> Tampon de lyse 1X RBC </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td> Chaud à la température ambiante avant utilisation; Environnement stérile </td></tr><tr><td> Des boîtes de Pétri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-12 </td><td> Environnement stérile </td></tr><tr><td> 50ml contubes iCal </td><td> Thermo Scientific </td><td> 339652 </td><td> Environnement stérile </td></tr><tr><td> 5ml 12X75mm tubes en polystyrène fond rond </td><td> BD Biosciences </td><td> 352054 </td><td> Connu sous le nom tubes FACS; Environnement stérile </td></tr><tr><td> 96 puits à fond en V plaques </td><td> Corning </td><td> 3897 </td><td> Environnement stérile </td></tr><tr><td> Bleu de Trypan </td><td> Cellgro </td><td> 25-900-CI </td><td> Environnement stérile </td></tr><tr><td> PE Microbilles </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-048-801 </td><td> Environnement stérile </td></tr><tr><td> AutoMACS Pro Separator </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> Colonnes autoMACS </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-021-101 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS course tampon </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-091-221 </td><td&gt; </td></tr></tbody></table>

préparation de dérivés myéloïdes cellules suppressives (mdsc) de naive et pancréatique souris porteuses de tumeurs par cytométrie en flux et automatisé de tri magnétique de cellules activées (automacs)

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSC sont une population hétérogène de macrophages, les cellules dendritiques immatures et des granulocytes qui s&#39;accumulent dans les organes lymphoïdes dans des conditions pathologiques, y compris les infections parasitaires, l&#39;inflammation, le stress traumatique, réaction du greffon contre l&#39;hôte, le diabète et le cancer 1-7. Chez la souris, MDSC expresse Mac-1 (CD11b) et Gr-1 (Ly6G et Ly6C) antigènes de surface 7. Il est important de noter que MDSC sont bien étudiés dans divers porteurs d&#39;une tumeur hôtes où ils sont sensiblement élargies et réprimer les anti-tumoraux des réponses immunitaires par rapport à leurs homologues naïfs 7-10. Toutefois, en fonction de l&#39;état pathologique, il ya différentes sous-populations de MDSC avec des mécanismes distincts et les cibles de la répression 11,12. Par conséquent, des méthodes efficaces pour isoler des populations viables MDSC sont importants dans l&#39;élucidation de leurs différents mécanismes moléculaires de la suppression in vitro et in vivo. Récemment, le Ghansah groupe a signalé l&#39;expansion de la MDSC dans un modèle murin du cancer du pancréas. Notre porteur de tumeurs MDSC afficher une perte de l&#39;homéostasie et augmentation de la fonction suppressive par rapport à naïve MDSC 13. Pourcentages MDSC sont beaucoup moins dans les compartiments lymphoïdes de souris naïves vs porteur de tumeurs. Il s&#39;agit d&#39;une mise en garde majeure, qui empêche souvent les analyses comparatives précises de ces MDSC. Par conséquent, l&#39;enrichissement de Gr-1 + leucocytes chez des souris naïves avant le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) améliore la pureté, la viabilité et réduit considérablement le temps de tri. Toutefois, l&#39;enrichissement de la Gr-1 + leucocytes de souris porteuses de tumeurs est facultative car ceux-ci sont en abondance pour FACS rapides de tri. Par conséquent, dans ce protocole, nous décrivons une méthode très efficace de immunophénotypage MDSC et enrichissante Gr-1 + leucocytes de la rate de souris naïves pour le tri MDSC en temps opportun. Immunocompétents souris C57BL / 6 sont inoculés avec murin Panc02 CElls voie sous-cutanée alors que les souris naïves recevoir 1XPBS. Environ 30 jours après l&#39;inoculation; rates sont récoltées et transformées en une seule cellule suspensions en utilisant un tamis de dissociation cellulaire. Les splénocytes sont ensuite globules rouges (RBC) lysées et une aliquote de ces leucocytes sont colorés en utilisant conjugués au fluorochrome des anticorps contre Mac-1 et Gr-1 à des pourcentages immunophénotype MDSC par cytométrie en flux. Dans une expérience parallèle, les leucocytes entiers de souris naïves sont colorées avec fluorescente conjugués GR-1, incubées avec des anticorps PE-microbilles et sélectionné de façon positive à l&#39;aide un système automatisé de tri magnétique de cellules activées (autoMACS) Pro Separator. Ensuite, une aliquote de GR-1 + de leucocytes sont colorés avec Mac-1 anticorps pour identifier les l&#39;augmentation des pourcentages MDSC par cytométrie en flux. Maintenant, ces Gr1 + de leucocytes enrichis sont prêts pour tri par FACS du MDSC à être utilisé dans les analyses comparatives (naïve vs porteur de tumeurs) in vivo et in vitro </em&gt; tests.

C&#39;est une méthode rapide et complète de l&#39;immunophénotypage myéloïdes dérivées des cellules suppressives (MDSC) et l&#39;enrichissement de Gr-1<sup&gt; +</sup&gt; Leucocytes de la rate de souris. Cette méthode utilise la cytométrie en flux et cellulaire autoMACS tri pour enrichir viable Gr-1<sup&gt; +</sup&gt; Leucocytes avant tri par FACS du MDSC pour une utilisation<em&gt; In vivo</em&gt; Et<em&gt; In vitro</em&gt; Tests.

Préparation de dérivés myéloïdes cellules suppressives (MDSC) de Naive et pancréatique souris porteuses de tumeurs par cytométrie en flux et automatisé de tri magnétique de cellules activées (autoMACS)

Les MDSC constituent une population hétérogène de macrophages, de cellules dendritiques et de granulocytes immatures qui s'accumulent dans les organes lymphoïdes lors de processus pathologiques...

L'objectif général de l'expérience suivante est de produire rapidement une population enrichie en leucocytes positifs pour le GR contenant des cellules myéloïdes suppressives ou MDSCs viables, à partir de rates de souris, pour une utilisation dans des tests in vivo et in vitro. Premièrement, les rates provenant de plusieurs souris sont regroupées et traitées afin d'obtenir une suspension unicellulaire. Afin de quantifier le pourcentage de MDSCs avant enrichissement, un petit aliquot des cellules regroupées est transféré dans une plaque de 96 puits à fond en V.Les antigènes de surface MAC un et GR un sont marqués et les cellules marquées sont transférées dans des tubes FACS pour une analyse par cytométrie en flux. Les leucocytes restants, regroupés, sont colorés avec un anticorps conjugué à un fluorochrome dirigé contre GR un, puis incubés avec des microbilles magnétiques qui se lient au fluorochrome présent sur l'anticorps anti-GR un. Les populations GR un positives et GR un négatives sont ensuite séparées à l’aide d’un séparateur AutoMax pro afin d’évaluer la réussite de l’enrichissement en GR un de la population.Un petit aliquot est prélevé et analysé pour l'expression de GR un et MAC un afin d'évaluer les pourcentages de MDSC. La comparaison des données d'immunophénotypage obtenues montre une augmentation des pourcentages de MDSC dans la population leucocytaire enrichie en GR un par rapport à la population non enrichie. En outre, on observe une augmentation des MDSC naïves, produisant une population comparable aux MDSC présents chez les sujets porteurs de tumeur.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la coloration classique en flux et le tri basé sur la cytométrie en flux à grande vitesse de M DSCs à partir de tissus lymphoïdes, est que notre technique de mélange maître empêche les variations importantes de nos résultats en assurant une coloration équivalente des leucocytes en surface, respectivement le typage tissulaire et le tri AutoMax de m DSCs et de cellules positives GR un. La démonstration des procédures sera assurée par Nadine Nelson, étudiante diplômée de notre laboratoire, et le Dr. Haw sra, directrice du centre de cytométrie en flux de l'USF. La procédure suivante doit être réalisée dans un environnement stérile sous une hotte de sécurité biologique, les cellules et les anticorps devant être maintenus sur de la glace.Si possible, assemblez le tamis de dissociation cellulaire en insérant l'écran en treillis dans l'ouverture du récipient, vers le bas. Insérez ensuite l'anneau de maintien dans la zone filetée, côté cannelé vers le haut, et utilisez la clé à anneau pour serrer l'anneau de maintien afin de fixer l'écran. Placez le tamis assemblé dans une boîte de Pétri contenant 10 millilitres d'une solution tampon XPBS.Prélèver les splènes de souris C57BL/6 âgées de six à huit semaines, porteuses de tumeur ou témoins naïves, et les placer sur le tamis à dissociation cellulaire. Ensuite, utiliser un pilon en verre pour broyer les splènes à travers le tamis dans la boîte de Pétri. Répéter ce processus pour chaque groupe de traitement de souris.Ensuite, à l’aide d’une pipette serologique de cinq millilitres, appliquez la suspension cellulaire sur un tamis cellulaire de 70 microns et laissez-la filtrer dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifugez à 250 à 300 ×g pendant cinq minutes. Après la centrifugation, retirez le surnageant et remettez en suspension le culot en ajoutant cinq millilitres de tampon de lyse des globules rouges par rate, puis pipetez vigoureusement de haut en bas. Incubez à température ambiante pendant cinq minutes. À la fin de l’incubation, arrêtez la réaction en ajoutant 20 millilitres de PBS et en pipetant vigoureusement de haut en bas.Ensuite, centrifuger à 250 à 300 × g pendant cinq minutes après avoir retiré le surnageant, le culot dans 20 millilitres de PBS stérile et compter les cellules. À l’aide de bleu de trypan et d’un hémocytomètre, resuspendre les cellules à une concentration de 1 × 10⁷ à 2 × 10⁷ cellules par millilitre dans le milieu de coloration à 3 %. L’obtention d’une coloration optimale est l’aspect le plus difficile de cette procédure.Cela peut être réalisé avec succès en titrant les anticorps au préalable. Utilisez la préparation de mélanges maîtres et la coloration de surface en petits volumes, comme décrit dans ce protocole. Pour colorer les cellules en vue d'une analyse par cytométrie en flux, étiquetez les puits d'une plaque vbo 96 puits pour les échantillons témoins et expérimentaux ainsi que pour les colorations simples.Pour les témoins de compensation, ajouter cinq fois 10 à la puissance 5 à une fois 10 à la puissance 6 cellules dans 50 µL dans chacun des puits étiquetés. Ensuite, centrifuger la plaque à 250-300 ×g pendant cinq minutes après la centrifugation. Observer la plaque par en dessous.En regardant vers le haut pour s'assurer que les culots sont présents dans les puits, préparez un mélange maître de bloc BDFC murin contenant l'anticorps monoclonal de rat anti-muse CD16/32 dilué dans du milieu de marquage à 3 % dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre sur de la glace vortex. Ensuite, centrifugez brièvement pendant cinq secondes en tenant la plaque V fond creux de 96 puits au-dessus d'un récipient de déchets ou d'un évier. Retournez rapidement la plaque puis remettez-la à l'endroit pour éliminer le surnageant sans perturber les culots cellulaires.Ensuite, ajouter 50 microlitres du mélange maître de blocage FC à tous les culots dans la plaque V en fond de 96 puits en mélangeant délicatement par aspiration et distribution. Placer la plaque sur de la glace et incuber 15 minutes à l’abri de la lumière. Centrifuger la plaque à 250 à 300 ×g pendant cinq minutes. Préparer un mélange maître d’anticorps Mac un fitzy et GR un A PC dilués dans du milieu de marquage à 3 % dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre sur glace.Vortexez brièvement et centrifugez pendant cinq secondes. Après la centrifugation, retournez la plaque pour éliminer le surnageant de chaque puits, puis ajoutez 50 microlitres du mélange d'anticorps aux pastilles témoins ou expérimentales. Mélangez soigneusement en pipettant doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Pour les compensations de coloration simple, ajoutez 50 microlitres de MAC un F GR un A PC ou DPI dilué dans le milieu de coloration à 3 % dans les puits appropriés. Pour le témoin sans coloration, ajoutez 50 microlitres de milieu de coloration à 3 % dans le puit approprié et mélangez.Incubez ensuite la plaque pendant 30 minutes à l'obscurité sur de la glace. Pendant l'incubation, étiquetez des tubes fax de manière à ce qu'ils correspondent à chaque puits de la plaque et ajoutez 200 microlitres de milieu de coloration à 3 % dans chaque tube fax. Une fois l'incubation de 30 minutes terminée, centrifugez la plaque à 250 à 300 ×g pendant cinq minutes.Après la centrifugation, éliminer les surnageants comme précédemment. Ensuite, laver les culots en ajoutant 100 microlitres de milieu de coloration à 3 % à chaque culot. Bien mélanger en pipettant doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas.Centrifuger de nouveau la plaque pendant cinq minutes. Répéter l'étape de lavage une fois de plus après la centrifugation, éliminer le surnageant comme précédemment et resuspendre chaque culot dans 100 microlitres de milieu de coloration à 3 %, puis bien mélanger. Ensuite, transférer 100 microlitres des cellules resuspendues depuis chaque puits de la plaque vers le tube fax respectivement étiqueté.Ensuite, ajouter 75 nanogrammes par millilitre de DPI aux échantillons témoins et expérimentaux ainsi qu'au témoin de compensation simple coloration DPI. Acquérir les données cytométriques afin de déterminer les pourcentages de MDSC comme décrit dans le document accompagnant, puis enrichir les leucocytes positifs pour GR un : prélever une aliquote de 1 × 10⁷ des leucocytes résiduaires non colorés dans des tubes fax correctement étiquetés et centrifuger à 250-300 × g pendant cinq minutes. Ajouter 50 microlitres d'une dilution au 1/10 de l'anticorps GR un PE dans du tampon max et incuber 15 minutes à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière.Après l'incubation, ajoutez deux millilitres de tampon max dans chaque tube fax et centrifugez à 250 à 300 ×g pendant cinq minutes. Après la centrifugation, éliminez le surnageant. Ensuite, ajoutez 200 microlitres d'une dilution au 1/4 de microbilles anti-PE dans du tampon max dans chaque tube et incubez pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière.Ajoutez deux millilitres de tampon max dans des tubes fax et centrifugez à 250 à 300 ×g pendant cinq minutes. Resuspendez ensuite le culot dans trois millilitres de tampon de marquage, filtré à l’aide d’un tamis de 70 µm, dans un nouveau tube conique de 50 millilitres étiqueté. Pour ce protocole, nous utilisons une séparation magnétique automatique.La séparation magnétique est un excellent choix de méthode. Si vous devez séparer un grand nombre de cellules rapidement, de manière économique et en fonction d'un marqueur de surface, assurez-vous de vérifier vos résultats à la fin par cytométrie en flux. Pour préparer et amorcer le séparateur AutoMax pro, veillez à ce que tous les flacons soient remplis avec les solutions appropriées.Allumez l'appareil. Ensuite, après l'initialisation, examinez l'état des récipients à fluides et des colonnes. Tous les symboles doivent être verts.Ensuite, dans le menu, sélectionnez « séparation » dans la barre de menu supérieure, puis « lavage ». Maintenant, dans la barre de menu inférieure, sélectionnez « rinçage » dans l'option contextuelle, puis « exécuter » pour démarrer le processus d'amorçage. Une fois le processus d'amorçage correctement terminé, l'appareil indiquera qu'il est prêt pour la séparation.Sous le menu d'état, placez le tube conique de 50 millilitres contenant les cellules marquées magnétiquement dans la rangée A d'un porte-tubes refroidi de taille appropriée. Ensuite, placez un tube conique de 50 millilitres destiné à la collecte de la fraction négative dans la rangée B et un tube conique de 15 millilitres destiné à la collecte de la fraction positive dans la rangée C. Sélectionnez le programme de séparation de cellules POS S cell pour la sélection positive des cellules cibles marquées en mode sensible à partir des échantillons. Dès le début du programme, les cellules cibles marquées magnétiquement seront retenues sur la colonne AutoMax, tandis que les cellules non marquées seront dirigées vers le tube de collecte de la fraction négative situé en rangée B. L'aimant sera ensuite retiré, permettant aux cellules cibles marquées d'être libérées dans le tube de collecte positif situé en rangée C du porte-tubes.Après l'enrichissement, utilisez le bleu de trypan et un hémocytomètre pour recompter les fractions GR1 positif et GR1 négatif. Resuspendez ensuite les cellules à une concentration de 1 × 10⁷ cellules par millilitre à 2 × 10⁷ cellules par millilitre dans du milieu de marquage à 3 % et transférez 50 microlitres dans des tubes FACS respectivement étiquetés. Marquez les cellules avec MAC1 et le colorant de viabilité DAPI pour la cytométrie en flux et les corrections de simple marquage.Réaliser l'acquisition des données par cytométrie en flux afin de déterminer les pourcentages de cellules GR1-positives et GR1-négatives, et également comparer les pourcentages de MDSC avant et après l'enrichissement par AutoMax. Les spléens ont été prélevés chez des souris porteuses de tumeurs pancréatiques et chez des souris naïves, puis transformés en suspensions monocellulaires comme décrit dans cet article vidéo. La cytométrie en flux a été utilisée pour analyser les leucocytes naïfs, marqués à la surface par des anticorps fluorescents conjugués dirigés contre MAC1 et GR1. Comme indiqué ici, seul un très faible pourcentage (1,19 %) de MDSC doublement positifs pour MAC1 et GR1 a été observé avant l'enrichissement par AutoMax. En revanche, après enrichissement de la population positive pour GR1, cette sous-population cellulaire devient nettement plus importante (10,5 % chez les souris naïves) et atteint désormais un niveau comparable à celui des souris porteuses de tumeurs (25,3 %).Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que la MDSC accélérée, le tri par cytométrie en flux, les expériences de transfert in vivo, la PCR quantitative en temps réel et le western blotting, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant les mécanismes moléculaires responsables de l'expansion, de la migration, de la différenciation des MDSC et de leur suppression des réponses immunitaires.

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Préparation de dérivés myéloïdes cellules suppressives (MDSC) de Naive et pancréatique souris porteuses de tumeurs par cytométrie en flux et automatisé de tri magnétique de cellules activées (autoMACS) (Vidéo) | JoVE Journal

Préparation de dérivés myéloïdes cellules suppressives (MDSC) de Naive et pancréatique souris porteuses de tumeurs par cytométrie en flux et automatisé de tri magnétique de cellules activées (autoMACS)

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