Name: Faible enrichissement moléculaire des protéines de poids sur les films minces de silice mésoporeuse de recherche de biomarqueurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: Découvrez une méthode d'enrichissement de protéines de faible poids moléculaire sur films minces de silice mésoporeuse pour le profilage du sérum. Cette technique améliore la découverte de biomarqueurs diagnostiques.

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Ce travail a été financé par l&#39;Alliance des nanosanté pré-centre Prix (W81XWH-11-2-0168) et le Texas Center for nanomédecine cancer (1U54CA151668-01).

1. La fabrication de puces <ol><li> Créer la solution de revêtement pour la puce en commençant par la solution de précurseur de silicate hydrolysé. Mélanger 14 ml de tétraéthylorthosilicate (TEOS) avec 17 ml d&#39;éthanol, 6,5 mL d&#39;eau déminéralisée et de 0,5 mL de HCl 6M sous forte agitation (1200 tours par minute) en utilisant une plaque chauffante remuer. Chauffer cette solution à 80 ° C pendant 2 heures, en maintenant l&#39;agitation constante. </li><li> Préparer des solutions de polymères en ajoutant l&#39;souhaitée tri-bloc coploymer (pluronic F127, L121 et P123) à 10 ml d&#39;éthanol à température ambiante sous forte agitation. Compléter le mélange en ajoutant 7,5 ml de la solution de silicate (provenant de l&#39;étape 1.1) dans la solution de copolymère tri-séquencé suivie par 2 heures de forte agitation à température ambiante. Cela représente la solution de revêtement final. </li><li> Appliquer une ml de solution de revêtement à une tranche de silicium 4 pouces par centrifugation à une vitesse de 1500 tours par minute pendant 20 secondes. Puis chauffer à 80 ° C pendant 12 heures. </li><li> Chauffer les films de supprimer su organiquerfactant en élevant la température de 1 ° C par minute à 425 ° C, puis cuire au four pendant 5 heures. </li><li> Pré-traiter la surface de la silice mésoporeuse puce (MPS) avec l&#39;oxygène de plasma incinération (Plasma Asher - Mars Plasma System). (Taux de O Flow 2: 80 sccm, puissance: 300 W, temps: 10 minutes). </li><li> Facultatif modification chimique de surface: puces silanate dans organosilane 3% dans un mélange méthanol: eau DI (19:1) solution pendant 72 heures à température ambiante dans un mélange N 2 boîte à gants. Rincer successivement avec du méthanol et de l&#39;eau DI. Cure puces à 110 ° C pendant 15 minutes dans un four à chaleur tournante à commande. </li></ol> 2. Exemple de pré-traitement <ol><li> Ajouter TFA et ACN à chaque échantillon de sérum de telle sorte que les concentrations finales sont TFA 0,01% et 5% ACN. Vortex pour mélanger. </li><li> Agiter ces échantillons sur une table de vortex agitateur à température ambiante pendant 30 minutes. </li></ol> 3. Fractionnement du sérum <ol><li> Pré-cuire puces pendant la nuit dans un four à 160 ° C. Alternativement, le stockagee les jetons dans un dessiccateur jusqu&#39;au moment de servir pour éviter l&#39;hydratation de la surface de l&#39;eau dans l&#39;air ambiant. </li><li> Utilisation de l&#39;air comprimé à dépoussiérer les particules pouvant se trouver sur la surface de la puce. </li><li> Couper préfabriqué, acheté CultureWell chambré lamelle d&#39;inclure le nombre souhaité de puits. Lamelle propre avec de l&#39;éthanol à 100%, puis les placer sur la surface de la puce MPS. Appuyez sur le bas lamelle avec une pince pour assurer une étanchéité complète à puce. </li><li> Introduire à la pipette 10 uL d&#39;échantillon de sérum dans chaque puits 3 mm. Incuber pendant 30 minutes dans une chambre humide à température ambiante. </li><li> Introduire à la pipette de sérum jusqu&#39;à de puits et de les jeter. Introduire à la pipette 10 uL d&#39;eau déminéralisée à chaque puits pour se laver de plus grosses protéines. Répétez 4 fois. </li><li> Prélever 5 pi de tampon d&#39;élution (0,1% de TFA + 50% ACN) à chaque échantillon. Pipeter de haut en bas de 30 fois tout en se déplaçant autour de la pointe de pipette dans le puits pour mélanger le tampon d&#39;élution. (À appliquer uniquement tampon d&#39;élution à 1-2 échantillons à la fois pour prévenir tampon d&#39;élutionde s&#39;évaporer aussi rapidement). </li><li> Après le mélange, pipeter tout le tampon d&#39;élution et placer dans un microtube avant d&#39;être prêt à effectuer l&#39;analyse MALDI-TOF. </li><li> Afin d&#39;imiter la complexité d&#39;un échantillon biologique et d&#39;évaluer l&#39;effet d&#39;enrichissement dans la récolte espèces de faible poids moléculaire avec notre système de fractionnement sur puce, nous avons choisi et assemblé un mélange standard de protéines et de peptides de comptage vingt-six espèces différentes avec un large gamme de poids moléculaires (900-66 500 Da) et IP (4.0 à 10.2) et des concentrations de 0,5 à 8 (pmol / ul) (voir la liste des protéines dans le tableau 1). </li></ol> 4. MALDI-TOF analyse des peptides <ol><li> Spot de 0,5 ul de l&#39;échantillon à la plaque cible MALDI et laisser sécher. </li><li> Spot 0,5 matrice pi (α-cyano-4-hydroxycinnamique (ACSSD), 5 g / L) ou une solution saturée d&#39;acide trans-3 ,5-diméthoxy-4-hydroxycinnamique (SA) dans de l&#39;acétonitrile contenant 50% et du TFA 0,1% permettent de co-cristallisation. &lt;/ Li&gt; <li> Spot de 0,5 pi de solution d&#39;étalonnage à chaque tache d&#39;étalonnage et laisser sécher. </li><li> Insérez la plaque cible en spectromètre de masse MALDI-TOF. La machine doit être configurée en mode réflecteur positive avec une intensité laser de 4200 et 3000 coups par échantillon. La gamme de masse choisie devrait être de 800 à 5000 Da avec une masse de la cible de 2000 Da. </li><li> Effectuer la même analyse MALDI-TOF en mode linéaire, mais changer la gamme de masse de 900 à 10.000 Da ou 3000 à 70.000 Da et une masse de la cible de 5000 Da. </li></ol> 5. Analyse des données <ol><li> Les spectres brut ont été traitées avec le logiciel ConvertPeakList et les données ont été exportées vers un logiciel de prétraitement SpecAlign. Tous les spectres ont été alignées en utilisant la méthode de corrélation PAFFT et les intensités ont été normalisées à courant ionique total (CIT) dans chaque spectre correspondant. Tous les spectres ont été lissés et débruitées avec un facteur de 4 et 0,5, respectivement. Les pics ont été détectés avec une base de référence de 0,5 fenêtre de masse, du 21 et la hauteurratio de 1,5, les valeurs négatives ont été retirés avant l&#39;analyse. </li><li> Classification hiérarchique a été réalisée en utilisant Cluster 3.0 et visualisées avec le logiciel Mapletree. Spectrométrie de masse MALDI données (m / z intensités des pics) est une transformation logarithmique, normalisée, et centré médiane. Corrélation de Pearson a été utilisée pour calculer la distance entre les échantillons, et le regroupement de liaison complète a été effectuée. </li><li> Un étudiant indépendant t-test a été utilisé pour la comparaison entre les groupes (n = 2 groupes) pour chaque pic détecté MS avant l&#39;analyse classification non supervisée hiérarchique. Une P-value de 0,02 ou moins est considérée comme significative pour sélectionner des peptides et des protéines différentiellement récoltés parmi les différentes puces protéomiques mésoporeux (grands pores vs petits pores). </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Comme le montre la figure 1, dans cette étude, nous avons fabriqué une série de films minces de silice mésoporeuse avec une variété de nanotextures et exhaustive exploré lautilisation sélective dans ir figure capture et l&#39;enrichissement de peptides et de protéines LMW à partir de sérum humain. 2a et b représentent les spectres MS de l&#39;échantillon non traité sérum pour des peptides dans la plage de 900 à 10 000 Da et pour des protéines dans la gamme de 3000 ~ 70000 Da, respectivement . Ces spectres illustrer la suppression du signal dans la région LMW en raison de la présence de puits ionisé, hautement abondante, de poids moléculaire élevé (HMW) des protéines telles que l&#39;albumine. Figure 2c et d représentent les spectres MS de l&#39;échantillon de sérum après fractionnement par le L121 MPS (taille de pores, 6 nm). La majorité des grosses molécules ont été épuisés, ce qui entraîne un enrichissement significatif des composants LMW. Comme un contrôle, le même échantillon de sérum a été appliqué sur une surface non poreuse de la silice pure à évaluer la spécificité des films minces MPS pour la récupération LMWP. Comme on peut le voir dans la figure 2e et f, il n&#39;y avait pas de récolte importante de pepmarées ou des protéines de la silice non poreuse. Ainsi, il peut être conclu que c&#39;était l&#39;architecture mésoporeux et non l&#39;affinité surface de la silice, qui constitue le facteur prédominant dans l&#39;enrichissement de LMWP. Des variations contrôlées avec précision dans la taille des pores peut être obtenue par l&#39;utilisation de copolymères avec différentes longueurs de bloc hydrophobes. En utilisant les protéines et conçus mélange des peptides, l&#39;effet de la taille des pores sur le peptide LMW et l&#39;efficacité de récupération des protéines a été étudié à l&#39;aide MPS films minces préparées à partir de quatre agents tensioactifs Pluronic (F127, P123, L121, L121 et plus l&#39;agent de gonflement) avec différents rapports de volumes des composants hydrophiles et hydrophobes pour former des tailles de pores de 3,7 nm, 5.2, 7.4 nm nm, et de 9,0 nm, respectivement. Cette gamme de tailles de pores conduit à la reprise d&#39;un répertoire différent des peptides et des protéines à partir du même échantillon de sérum par la taille et l&#39;exclusion forme (figure 3). Les spectres de protéines à haut poids moléculaire demonstrate l&#39;échelle moléculaire de coupure de chaque type de puce. En plus de la déplétion dépendant de la taille des protéines HMW, le fractionnement sur puce de la solution normes affiche un différentiel et l&#39;enrichissement sélectif d&#39;espèces LMW associés à des tailles de pores. Le regroupement dans les deux sens hiérarchique présenté dans la figure 3b montre le motif d&#39;enrichissement LMW normes obtenu avec le MSC différent. Même si tous les peptides sont en dessous de la moléculaire de coupure des puces, il existe une corrélation positive entre la taille des pores et le poids moléculaire des espèces piégées. Le MSC avec des pores dilatés, jusqu&#39;à 9 nm, de préférence récolter plus grands peptides, tandis que les petits peptides sont récupérés de manière plus efficace par les puces avec des pores plus petits. La transformation structurelle de l&#39;arrangement mésoporeux a été réalisée en ajustant la concentration du polymère modèle. Augmentation de la concentration du polymère matrice permet une courbure réduite interfaciale entre les phasesde l&#39;eau, le copolymère, et le silicate de, par conséquent l&#39;ouverture de la progression d&#39;un interdépendants sphérique à une structure cylindrique. Pluronic F127, avec son poids moléculaire élevé, possède ce degré élevé de la périodicité structurelle. En augmentant la concentration de F127 dans la solution de départ, différents nanostructures MPS couches minces périodiques peuvent être obtenus auprès de nanostructure 3D à nanostructure 2D. Les cubes en 3D et en nid d&#39;abeille nanostructures hexagonales, possédant l&#39;interconnectivité nanopore plus désirable et la morphologie nanopore plus accessible, présentent des performances supérieures dans sélectivement enrichir peptides LMW que la structure hexagonale 2D, même si elles partagent les mêmes distributions de taille des pores et l&#39;moléculaires même seuil pour le sérum fractionnement (figure 4). Nous avons également rationalisé la conjugaison de composés organo-silane sur des puces MPS en introduisant un plasma d&#39;oxygène incinération de prétraiter la surface de la puce. Pour étudier l&#39;effet qualitatif électrostatique sur selective sur puce d&#39;enrichissement, nous utilisons les protéines et les peptides mélange. L&#39;analyse de la solution MS protéomique normes fractionné sur des puces MPS préparés avec L121 et conjuguée avec les groupes chimiques fonctionnels est présenté dans la Figure 5. Le chargé positivement et négativement chargé des peptides et des protéines LMW sont capturés sur le anionique et les puces cationiques respectivement. La comparaison quantitative des puces MPS multiples pour récupérer les peptides avec une charge nette positive est affiché sur la figure 5a. Les puces avec une charge négative et les puces sans aucune modification (avec une charge négative mineure à l&#39;origine) présentent un enrichissement significativement plus élevé pour ces peptides que les puces modifiées avec APTES (-NH 2). A l&#39;inverse, les puces chargées positivement MPS possèdent une capacité exceptionnelle pour récupérer ces peptides avec une charge nette négative, comme l&#39;a démontré sur la figure 5b. Alors α-endorphine ne montre pas un changement significatif due à son PI autour de 6. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig1.jpg" /> Figure 1. Principe de MPS puces fractionnement et l&#39;enrichissement LMW. Après l&#39;échantillon de taches sur la surface, des protéines et des peptides LMW sont piégés dans les pores tout en les espèces plus grandes reste en dehors des pores et sont enlevés au cours des étapes de lavage. Les fractions enrichies sont ensuite élués et analysés par MALDI. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig2.jpg" /> Figure 2. L&#39;enrichissement Peptide utilisant les puces de silice mésoporeux à couches minces. MALDI profils MS à la fois dans la gamme de faible masse (900 à 10 000 Da) et la plage de masse élevée (3000 à 70 000 Da) avant (a, b) et après (c, d) le traitement du sérum sur des films minces de silice mésoporeuses ( L121, 6 nm). La reprise moléculaire est significativement réduite lors de l&#39;utilisation des surfaces de silice vierges non poreuses (e, f). <img alt="Figure 3" src=&quot;/ Files/ftp_upload/3876/3876fig3.jpg&quot; /&gt; Figure 3. Moléculaire enrichissement de coupure et dépendant de la taille des copeaux MPS. (A) vue agrandie des spectres MALDI démontrer la caractéristique moléculaire de coupure de chaque puces MPS en corrélation avec la taille des pores. (B) le regroupement de deux de manière hiérarchique des fonctions de mixage peptidiques entre les différentes puces. L&#39;intensité de la couleur rouge ou jaune indique la concentration en peptide parent. Pores plus grands renforcée la récolte des grandes peptides (3600 à 8500 Da), tandis que les petits peptides (de 900 à 3500 Da) sont préférentiellement récupéré à partir des puces avec des pores plus petits. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig4.jpg" /> Figure 4. Caractérisations physiques de films minces MPS et la récupération sélective avec différentes nanostructures. Modèles XRD a, b, c), TEM (encart a, b, c), le Pluronic F127 à des concentrations différentes dans la solution de précurseur: 4,0 ×10 -3 M (a), 6,0 × 10 -3 M (b), et 8,0 × 10 -2 M (c). Graphique à barres (d) de l&#39;intensité de la détection illustrant la récupération sélective des peptides sur 3D et 3D cubes hexagonaux F127 puces protéomiques (CUB et Hex, respectivement). Les différentes modifications structurelles présenter un enrichissement sélectif. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3876/3876fig5_lg.jpg"><img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig5.jpg" /></a> Figure 5. Charge spécifique de récupération pour les puces avec des fonctions de surface différentes. Graphique à barres de l&#39;intensité de la sclérose en plaques de détection de peptides sélectivement capturés sur les puces fonctionnalisés. En fonction de leur point isoélectrique, les peptides sont chargés positivement ou négativement à un pH de 7,0. (A) peptides positifs ((1) des-Arg1-bradykinine, (2) bradykinine, (3) la substance P-amide, (4) Neurotensin, (5) ACTH (1-17), (6) ACTH (7 - 38)) sont spécifiquement enrichi sur la charge négative survisages. (B) peptides négatifs ((7) Glu1-fibrinopeptide B, 8) α-endorphine, (9) d&#39;insuline ACTH (18-39), (10), (11) EGF, (12) analogue à l&#39;insuline GFII) sont spécifiquement enrichi sur les surfaces chargées positivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3876/3876fig6_lg.jpg"><img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig6.jpg" /></a> Figure 6. Sur puce de stabilisation de sérum fractionné. (A) représentant profils MALDI des peptides et des protéines éluées LMW immédiatement après fractionnement du sérum (en haut) ou après 3 semaines de sur-puce de stockage à température ambiante (en bas). (B) De haut en bas: une analyse de régression linéaire des intensités moyennes de pics détectés MS dans chaque répétition par rapport à 1 pour répliquer fraîchement fractionné le sérum et le sérum après fractionnée puces MPS de stockage à température ambiante 3wk. L&#39;équation, CV et le coefficient de détermination (R 2) sont indiqués.

<ol><li>Wulfkuhle, J. D., Liotta, L. A., Petricoin, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+applications+for+the+early+detection+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Proteomic applications for the early detection of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 267-275 (2003).</li>
<li>Etzioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+case+for+early+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The case for early detection.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 243-252 (2003).</li>
<li>Hanash, S. M., Pitteri, S. J., Faca, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+plasma+proteome+for+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mining the plasma proteome for cancer biomarkers.</a> Nature. 452, 571-579 (2008).</li>
<li>Liotta, L. A., Ferrari, M., Petricoin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+proteomics%3A+written+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clinical proteomics: written in blood.</a> Nature. 425, 905-905 (2003).</li>
<li>Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood+peptidome%3A+a+higher+dimension+of+information+content+for+cancer+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 961-967 (2006).</li>
<li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+plasma+proteome%3A+history%2C+character%2C+and+diagnostic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell Proteomics. 1, 845-867 (2002).</li>
<li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).</li>
<li>Liu, H., Sadygov, R. G., Yates, J. R., 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+random+sampling+and+estimation+of+relative+protein+abundance+in+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A model for random sampling and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics.</a> Anal. Chem. 76, 4193-4201 (2004).</li>
<li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+gel+electrophoresis+in+proteomics%3A+old%2C+old+fashioned%2C+but+it+still+climbs+up+the+mountains%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains.</a> Proteomics. 2, 3-10 (2002).</li>
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<li>Bouamrani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoporous+silica+chips+for+selective+enrichment+and+stabilization+of+low+molecular+weight+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mesoporous silica chips for selective enrichment and stabilization of low molecular weight proteome.</a> Proteomics. 10, 496-505 (2010).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Les preuves s&#39;accumulent que le faible poids moléculaire région du protéome circulatoire est une riche source de biomarqueurs diagnostiques pour la détection précoce de la maladie. Dans cette technologie, nous avons présenté une série de puces de silice mésoporeux avec des tailles de pores différentes, les structures des pores et des modifications de manière sélective enrichir les peptides et les protéines de faible poids moléculaire. Pour évaluer la stabilité des protéines, les puces MPS ont été incubées avec du sérum humain, séché après le lavage, et stockés pour 3wk à température ambiante. Les patrons de protéines / peptides obtenus sont comparables à ceux de sérum fraîchement fractionné (Figure 6a), tel que confirmé par les résultats de l&#39;analyse statistique a montré à la figure 6b. La variabilité des signaux de pointe mesurés par le CV moyen a été estimé à 12,7% pour le sérum brut et à 14,2% pour les échantillons fractionnés. Les variations marginales pourrait être due à la variabilité interne de l&#39;instrument MALDI et a suggéré que l&#39;on-chip de prétraitement et de stockage n&#39;a pas induit de toute modification significative des profils protéiques MS. La même expérience a été réalisée sur silicium poreux non. Le sérum séché récupéré après un stockage sur une surface de silicium a été fractionné sur les puces MPS avant l&#39;analyse MALDI. Le profil des pauvres MS obtenus ont démontré l&#39;avantage de stabilisation de la surface mésoporeux. En analogie avec les mécanismes déjà postulés, nous émettons l&#39;hypothèse que les espèces LMW piégés à l&#39;intérieur des nanopores ont été préservés de la dégradation par l&#39;exclusion de taille de protéases, ou par inhibition stérique de leur activité protéolytique dans l&#39;espace confiné des nanopores. La méthode basée sur la puce MPS pourrait être un outil puissant dans le peptide et le profilage des protéines du complexe LMW étude des fluides biologiques. Les puces sont MPS peu coûteux à fabriquer et de permettre à la production de grande échelle pour atteindre le traitement simultané d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons, fournissant des fonctionnalités avantageuses pour le dépistage et exploratoire biola découverte de marqueurs.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Tetraethoxysilane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 131903 </td><td> 98% </td></tr><tr><td> Tournette </td><td> Brewer Science </td><td> Cee 200X </td><td></td></tr><tr><td> Plasma Asher </td><td> Nordson Mars </td><td> AP-600 </td><td></td></tr><tr><td> Ellipsomètre spectroscopique </td><td> JA Woollam Co. </td><td> M-2000DI </td><td></td></tr><tr><td> MALDI-TOF </td><td> Applied Biosystems </td><td> Voyager-DE-STR </td><td></td></tr><tr><td> α-cyano-4-hydroxycinnamique </td><td> Sigma-Aldrich Co. </td><td> C8982 </td><td> Matrice pour MALDI-TOF </td></tr><tr><td> trans-3 ,5-diméthoxy-4-hydroxyl&#39;acide cinnamique </td><td> Sigma-Aldrich Co. </td><td> 85429 </td><td> Matrice pour MALDI-TOF </td></tr><tr><td> Incorporer la plaque chaude </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11-475-30Q </td><td></td></tr><tr><td> CultureWell chambré lamelle </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> GBL103350 </td><td> 3 mm de diamètre. × profondeur de 1 mm, 3-10 ul, stérile </td></tr><tr><td> Pluronic F 127 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 106-70-PPO PEO 106 </td></tr><tr><td> Pluronic L121 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 5-PPO 70-PEO 5 </td></tr><tr><td> Pluronic P123 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 20-PPO 70-PEO 20 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Propriétés physico-chimiques et les concentrations conçus (poids moléculaire et Iso-Électrique point) du peptide sélectionné et normes protéines.

faible enrichissement moléculaire des protéines de poids sur les films minces de silice mésoporeuse de recherche de biomarqueurs

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

L&#39;identification de biomarqueurs circulants détient un grand potentiel pour des approches non invasives dans le diagnostic précoce et le pronostic, ainsi que pour la surveillance de l&#39;efficacité thérapeutique. 1-3 Le protéome circulant de bas poids moléculaire (LMWP) composé de petites protéines versées à partir de tissus et de cellules ou de fragments peptidiques issus de la dégradation protéolytique de grandes protéines, a été associée à l&#39;état pathologique chez les patients et reflète probablement l&#39;état de la maladie. 4,5 dépit de ces applications cliniques potentielles, l&#39;utilisation de la spectrométrie de masse (MS) pour profiler l&#39;LMWP de les fluides biologiques s&#39;est avérée très difficile en raison de la grande plage dynamique des concentrations des protéines et des peptides dans le sérum. 6 Sans prétraitement de l&#39;échantillon, une partie des protéines plus très abondants masquer la détection de faible abondance des espèces dans le sérum / plasma. Actuelles protéomique des approches fondées sur, comme deux dimensions sur gel de polyacrylamide-elméthodes ectrophoresis (2D-PAGE) et de la protéomique fusil de chasse sont de main-d&#39;œuvre, à faible débit et de l&#39;adéquation offre limitée pour des applications cliniques. 7-9 Par conséquent, une stratégie plus efficace est nécessaire pour isoler LMWP à partir de sang et de permettre le dépistage à haut débit d&#39;échantillons cliniques . Ici, nous présentons un moyen rapide, efficace et fiable multi-fractionnement système basé sur des puces de silice mésoporeuse de cibler spécifiquement et enrichir LMWP. 10,11 mésoporeux de silice (MPS) de couches minces avec des caractéristiques ajustables à l&#39;échelle nanométrique ont été fabriqués en utilisant la voie modèle copolymère tribloc . Utilisation des modèles différents de polymère et la concentration de polymère dans la solution de précurseur, les différentes distributions de tailles de pores, les pores, les structures de connexion et les propriétés de surface ont été déterminée et appliquée pour la récupération sélective des protéines de faible masse. L&#39;analyse syntaxique sélective des peptides enrichis en sous-classes différentes en fonction de leurs propriétés physico-chimiques enHance l&#39;efficacité de la récupération et la détection des espèces de faible abondance. En combinaison avec la spectrométrie de masse et l&#39;analyse statistique, nous avons démontré la corrélation entre les caractéristiques nanophase des films minces de silice mésoporeuse et la spécificité et l&#39;efficacité de la récolte de masse protéome faible. Les résultats présentés ici révèlent le potentiel de la technologie à base de nanotechnologie pour offrir une alternative puissante aux méthodes conventionnelles pour la récolte de LMWP liquides biologiques complexes. En raison de la capacité de régler les propriétés des matériaux, la capacité de production à faible coût, la simplicité et la rapidité de la collecte de l&#39;échantillon, et les exigences relatives aux échantillons très réduits pour l&#39;analyse, cette nanotechnologie roman une incidence considérable sur le domaine de la recherche sur les biomarqueurs protéomiques et protéomique clinique l&#39;évaluation.

Nous avons développé une technologie basée sur le film de silice mésoporeuse mince pour la récupération sélective des protéines de faible poids moléculaire et des peptides à partir de sérum humain. Les propriétés physico-chimiques de nos puces mésoporeux ont été finement réglé pour fournir un contrôle substantiel dans l&#39;enrichissement peptide et par conséquent le profil du protéome sérique à des fins diagnostiques.

Faible enrichissement moléculaire des protéines de poids sur les films minces de silice mésoporeuse de recherche de biomarqueurs

L'identification de biomarqueurs circulants offre un grand potentiel pour les approches non invasives de diagnostic précoce et de pronostic, ainsi que pour le...

L'objectif général de cette procédure est de développer une technologie fondée sur un film mince de silice mésoporeuse pour la récupération sélective de protéines et de peptides de faible masse moléculaire à partir de sérum humain. Cela est réalisé en premier lieu en fabriquant des puces en film mince de silice mésoporeuse et en les prétraitant par incinération au plasma d'oxygène. La deuxième étape consiste à effectuer un prétraitement simple du sérum, puis à enrichir les protéines et les peptides de faible masse moléculaire à partir du sérum par fractionnement sur puce.Après l'élution des protéines et peptides de bas poids moléculaire à partir de la puce, les molécules sont analysées par spectrométrie de masse à désorption/ionisation par laser assistée par matrice et temps de vol. La dernière étape consiste à utiliser un logiciel professionnel pour effectuer l'analyse des données. En définitive, les spectres de masse et les résultats de l'analyse statistique révèlent la spécificité et l'efficacité de la récupération du protéome de bas poids moléculaire.Le principal avantage de ces techniques ou des technologies existantes telles que la 2D page Western blood réside dans leur capacité puissante à enrichir les protéines et peptides de faible poids moléculaire et faiblement abondants dans le sérum, ainsi que dans leur haut débit, leur efficacité temporelle, la réduction des besoins en échantillons sériques et leur faible coût. L'un des aspects les plus difficiles de cette procédure consiste à contrôler la morphologie du réseau de nanopores, notamment la distribution de la taille des pores, la forme des pores et la faible interconnexion. En effet, ces caractéristiques déterminent la sensibilité et la spécificité du profilage de la signature sanguine ciblée.Pour garantir l'exercice, nous cherchons à contrôler soigneusement le rapport du matériau de départ et à suivre précisément les instructions afin de préparer la solution de revêtement pour la puce. Commencez par préparer la solution précurseur de silicate hydrolysé. Mélangez 14 millilitres de TEOS avec 17 millilitres d'éthanol à 200 degrés, 6,5 millilitres d'eau déionisée et 0,5 millilitre d'acide chlorhydrique à six molaire sous forte agitation.Poursuivre l'agitation vigoureuse et chauffer la solution obtenue à 80 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, préparer la solution de copolymère tri-bloc en ajoutant la solution de polymère choisie à 10 millilitres d'éthanol à température ambiante sous agitation vigoureuse. Dans cette démonstration, le copolymère F127 est utilisé.Compléter le mélange en ajoutant la solution de silicate à ce copolymère tri-bloc, suivi de deux heures d'agitation vigoureuse à température ambiante. Appliquer un millilitre de la solution de revêtement obtenue sur une plaquette de silicium de quatre pouces par dépôt centrifugé à une vitesse de 1 500 tr/min pendant 20 secondes. Ensuite, chauffer la plaquette à 80 degrés Celsius pendant 12 heures.Ensuite, augmentez la température d'un degré Celsius par minute jusqu'à atteindre 425 degrés Celsius, puis faites cuire à cette température pendant cinq heures. Ensuite, prétraitez la surface de la puce en silice mésoporeuse ou MPS obtenue par gravure au plasma d'oxygène. Puis mesurez l'épaisseur du film et la porosité à l'aide d'un oxymètre.Entre-temps, ajoutez de l'acide trifluoroacétique à chaque échantillon de sérum jusqu'à une concentration finale de 0,01 % et de l'acétonitrile jusqu'à une concentration finale de 5 %. Agitez ensuite ces échantillons sur un vortex à température ambiante pendant 30 minutes, après avoir préalablement cuit les puces toute une nuit dans une étuve à 160 degrés Celsius. Utilisez de l'air comprimé pour éliminer toute particule pouvant se trouver à la surface de la puce. Nettoyez la lame couvre-objet avec de l'éthanol à 100 % et placez-la sur la surface de la puce NPS, créant ainsi des puits d'échantillons.Appuyez sur la lamelle avec des pinces pour assurer un scellement complet avec la puce. Ensuite, pipetez 10 microlitres d'échantillon de sérum dans chaque puits. Incubez pendant 30 minutes dans une chambre humide à température ambiante afin de permettre aux protéines de faible masse moléculaire d'entrer dans les pores. Après l'incubation, aspirez le sérum des puits et jetez-le.Ensuite, pipetez 10 microlitres d'eau déionisée dans chaque puits pour éliminer les protéines plus grandes. Répétez ce lavage quatre fois en travaillant uniquement un à deux puits à la fois. Pour éviter l'évaporation, ajoutez rapidement 5 microlitres de tampon d'élution à chaque échantillon.Pipeter soigneusement 30 fois vers le haut et vers le bas tout en déplaçant la pointe de la pipette dans le puits pour bien mélanger. Après le mélange, aspirer tout le tampon d'élution et le transférer dans un tube microcentrifuge jusqu'au moment de réaliser l'analyse par désorption/ionisation par laser assistée par matrice en spectrométrie de masse à temps de vol. Déposer 0,5 microlitre de l'échantillon sur la plaque cible MALDI et laisser sécher, puis ajouter 0,5 microlitre de matrice dans un mélange d'acétonitrile à 50 % contenant 0,1 % d'acide trifluoroacétique (TFA) et laisser co-cristalliser. Ensuite, déposer 0,5 microlitre de solution d'étalonnage sur la zone d'étalonnage. Une fois sec, insérer la plaque cible dans le spectromètre de masse MALDI-TOF.La machine doit être mise en mode réflecteur positif avec une intensité laser de 4, 203, 000 tirs par échantillon. Effectuez d'abord l'analyse avec une plage de masse sélectionnée de 800 à 5, 000 daltons et une masse cible de 2000 daltons. Ensuite, effectuez la même analyse MALDI en mode linéaire, mais modifiez la plage de masse à 900 à 10, 000 daltons ou à 3000 à 70, 000 daltons, avec une masse cible de 5, 000 daltons.Après le processus d'analyse multi-top, traiter les spectres bruts à l'aide du logiciel de conversion de la liste des pics, puis exporter vers SpecAlign. Utiliser le logiciel d'alignement pour prétraiter et aligner tous les spectres à l'aide de la méthode d'alignement des pics par transformée de Fourier rapide ou corrélation P-A-F-F-T, et normaliser les intensités au courant ionique total. Effectuer la détection des pics avec un rapport de hauteur de deux et une fenêtre de masse de 0,3 %.Corrigez la ligne de base et supprimez les valeurs négatives avant l'analyse. L'importation des fichiers T 2D dans la vue marqueur constitue la première étape du traitement supervisé des données maldi de différents groupes. Commencez par ouvrir le logiciel de vue marqueur, puis importez les fichiers T 2D.Sélectionnez le dossier contenant les fichiers T 2D et configurez les paramètres pour le traitement des spectres. Ensuite, ouvrez le tableau des échantillons. Mettez en surbrillance les échantillons appartenant au même groupe, puis créez une étiquette de groupe.Normalisez les échantillons en utilisant les sommes totales des aires. Ensuite, ouvrez la fenêtre des options. Configurez une couleur et un symbole uniques pour chaque groupe.Ensuite, effectuez une analyse en composantes principales et un test T pour les échantillons de données actifs, divisés en différents groupes selon les scores de la composante principale 1 et de la composante principale 2. Les candidats biomarqueurs seront identifiés en fonction des graphiques de pondération des composantes principales, qui montrent un résumé du profil d'intensité du biomarqueur sélectionné, en cliquant sur « plot profiles » pour les pics sélectionnés. Les points présentant des valeurs plus élevées permettent de distinguer les différents groupes.Après avoir comparé les groupes à l'aide d'un test T, triez le tableau par valeurs de P croissantes afin de déterminer les pics capables de distinguer les différents groupes. Les spectres de masse présentés ici correspondent à l'échantillon de sérum pour les peptides dans la gamme de 900 à 10 000 Daltons, et pour les protéines dans la gamme de 3000 à 70 000 Daltons. Les spectres des échantillons non traités illustrent la suppression du signal dans la région des faibles masses moléculaires, due à la présence de protéines à haute masse moléculaire, fortement ionisées et très abondantes, telles que l'albumine. Après fractionnement par les films minces MPS, la majorité des grandes molécules ont été éliminées, entraînant un enrichissement significatif des composants de faible masse moléculaire. À titre de contrôle, le même échantillon de sérum a été appliqué sur une surface de silice pure non poreuse.Pour évaluer la spécificité des films minces de MPS dans la récupération du protéome de bas poids moléculaire, aucun prélèvement significatif de peptides ou de protéines n'a été observé à partir de la silice non poreuse. Ainsi, on peut conclure que c'est l'architecture mésoporeuse et non l'affinité de la surface de silice qui constitue le facteur prédominant dans l'enrichissement en PBPM. Des variations précisément contrôlées de la taille des pores peuvent être obtenues grâce à l'utilisation de copolymères présentant des longueurs différentes de blocs hydrophobes.L'effet de la taille des pores sur l'efficacité de récupération des peptides et protéines de bas poids moléculaire a été étudié à l'aide de films minces de MPS préparés à partir de quatre tensioactifs ioniques ayant différents rapports volumétriques entre les composants hydrophobes et hydrophiles. On observe ici une vue agrandie des spectres MALDI illustrant la coupure moléculaire caractéristique de chaque puce MPS, corrélée à la taille des pores. La gamme de tailles de pores a permis la récupération d'un répertoire différent de peptides et de protéines à partir du même échantillon de sérum, selon l'exclusion par taille et forme.Cela peut également être observé dans le regroupement hiérarchique à double sens des caractéristiques du mélange de peptides parmi les différentes puces. L'intensité de la couleur rouge ou jaune indique la concentration relative du peptide. Des pores plus larges ont amélioré la récolte des peptides plus gros, tandis que les petits peptides ont été récupérés de façon privilégiée à partir des puces présentant des pores plus petits.Différentes nanostructures périodiques de films minces MPS formées à l'aide de copolymères tri-blocs à haut poids moléculaire, tels que le F127 ionique avec des distributions de taille de pores similaires, peuvent être obtenues en ajustant la composition du polymère dans la solution précurseur. Les nanostructures cubiques tridimensionnelles et hexagonales en nid d'abeille possèdent une interconnexion nanoporeuse plus souhaitable et une morphologie de nanopores plus accessible. En conséquence, elles présentent des performances supérieures dans l'enrichissement sélectif des peptides de bas poids moléculaire, par rapport à la structure hexagonale bidimensionnelle.Ceci est vrai même si elles partagent des distributions de taille de pores similaires et la même limite moléculaire de coupure pour la fractionnation du sérum. La conjugaison d'Organy lane sur les puces MPS a été simplifiée par l'introduction d'un nettoyage au plasma d'oxygène afin de prétraiter la surface de la puce. Cette figure illustre la récupération spécifique aux charges pour les puces présentant différentes fonctions de surface, à l'aide d'un graphique en barres représentant l'intensité de détection par spectrométrie de masse des peptides capturés sélectivement sur les puces fonctionnalisées.En fonction de leur point isoélectrique, les peptides sont chargés positivement ou négativement à pH 7,0, en plus de l'élimination des protéines de haut poids moléculaire. Les résultats montrent que la conception structurale et la fonctionnalisation chimique des NPS ont encore accru la spécificité de l'enrichissement en peptides. Grâce à ce développement.Nous nous attendons à ce que cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la protéomique pour explorer de nouveaux biomarqueurs permettant un diagnostic précoce ou une évaluation thérapeutique dans les fluides corporels provenant de modèles humains et animaux. Par conséquent, elle favorisera un traitement personnalisé amélioré des maladies majeures.

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