Name: La récolte macrophages alvéolaires murins et lévaluation dactivation cellulaire induite par des nanoparticules polyanhydride (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Découvrez comment récolter des macrophages alvéolaires murins et évaluer leur activation par des nanoparticules polyanhydride. Cette méthode combine lavage bronchoalvéolaire et cytométrie en flux pour étudier les réponses immunitaires pulmonaires.

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Les auteurs tiennent à remercier le US Army Medical Research et du matériel de commande (Numéros de subvention W81XWH-09-1-0386 et W81XWH-10-1-0806) pour un soutien financier et le Dr Shawn Rigby de la Facilité Iowa State University cytométrie en flux pour son assistance technique spécialisée.

1. La récolte macrophages alvéolaires (AMɸ) à partir de la souris en utilisant lavage du poumon <ol><li> Porter un équipement de protection individuelle (EPI) comme un sarrau de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection. </li><li> Préparer complète AMɸ (cAMɸ) moyenne avant le début de la récolte. Ajouter 2,5 mL de pénicilline / streptomycine (pénicilline / streptomycine) solution, 250 pi de β-mercaptoéthanol (2-mercaptoéthanol), et 25 ml de la chaleur sérum inactivé de veau fœtal (FBS) à 222,25 mL de milieu de Dulbelcco Eagle modifié (DMEM). Filtre-stériliser moyennes cAMɸ l&#39;aide d&#39;un filtre à pores de 0,2 um top taille de la bouteille sous vide. </li><li> Euthanasier une souris en bonne santé en CO 2 asphyxie dans une chambre euthanasie. Bien qu&#39;une souris C57BL / 6 (6-8 semaines) a été utilisé pour les fins de ce projet, cette technique de lavage du poumon peut être effectuée sur n&#39;importe quelle souche de souris. En utilisant une bouteille de gaz comprimé, laissez écoulement du gaz dans la chambre pendant 1 min avant de placer la souris dans la chambre pour assurer que la chambre est entièrement chargé en CO 2. Placez la souris dans la chambre pour au moins une minute pour euthanasier la souris. En outre, être exsangue chaque souris par ponction cardiaque comme une méthode physique pour confirmer la mort de la souris, comme décrit en 1.4. </li><li> Lay la souris sur le dos (côté dorsal), de pulvérisation avec de l&#39;éthanol 70%, localiser le sternum et, à un angle de 30 degrés de l&#39;abdomen, insérer une aiguille de calibre 23 (attachée à une seringue de 1 ml) d&#39;environ 50 mm dans la cavité thoracique . Avec un placement correct de l&#39;aiguille, il devrait être possible de recueillir entre 0,4 et 1 ml de sang en fonction de la taille de la souris. Examiner l&#39;animal à l&#39;arrêt des signes vitaux. </li><li> Placer la souris sur le banc de laboratoire de sorte qu&#39;il est couché sur le ventre (face ventrale). La souris de pulvérisation avec de l&#39;éthanol à 70% pour stériliser l&#39;environnement de travail. Pincez la peau vers le milieu de la colonne vertébrale de la souris. Avec des ciseaux de dissection qui ont été stérilisés avec de l&#39;éthanol 70%, faire une petite incision à travers la peau. &lt;/ Li&gt; <li> Saisir la peau des deux côtés de l&#39;incision et tirer la peau dans des directions opposées le long de l&#39;axe crânio-caudale de la souris. Une fois fait correctement, la peau sera retiré de la carcasse sous-jacente. </li><li> Le cou de la souris devrait maintenant afficher les muscles exposés et des glandes. Découpez soigneusement que le tissu et tirez-le vers la partie antérieure de la souris en utilisant une pince, exposant ainsi le larynx, la trachée et l&#39;œsophage de la souris. Évitez de couper la veine jugulaire ou la carotide. </li><li> La trachée est maintenant visible et peut être identifiée comme le tissu avec des anneaux cartilagineux qui l&#39;entourent. Délicatement maintenir la trachée à la pince et lentement soulever et séparer la trachée de l&#39;oesophage, qui est situé sur le côté dorsal. </li><li> Faire une petite incision antérieure à l&#39;endroit où l&#39;on tient la trachée, mais postérieure du larynx. L&#39;incision doit être faite à environ un angle de 45 °. En outre, ne pas complètement transect de la trachée, car cela va l&#39;empêcher de se rétracter enla cavité du corps. </li><li> Remplir une seringue 1 cc muni d&#39;un cathéter de chat Tom avec PBS stérile en vue d&#39;insérer le cathéter dans la lumière de la trachée. Maintenez la trachée aide de pinces et avec votre main maintenir le cathéter à proximité de la pointe pour augmenter le contrôle et doucement l&#39;insérer dans le site de l&#39;incision trachéale. Sans forcer, insérez un cathéter dans la trachée d&#39;environ 20 mm. Saisir la trachée qui est autour du tube de cathéter, ce qui libère l&#39;autre côté. </li><li> En utilisant une seringue de 1 ml équipé du cathéter, doucement infuser 0,75 ml de la température ambiante, du PBS stérile dans les poumons, puis aspirer délicatement le dos du PBS dans la seringue. Répétez ce processus à trois reprises tout en massant l&#39;extérieur de la poitrine. Déconnecter la seringue du cathéter et de distribuer le liquide de lavage dans un tube à centrifuger de 15 ml. Après remplissage de la seringue avec 0,75 ml de PBS frais et rebrancher la seringue au cathéter, répétez les étapes 1,9 et 1,10 fois pour chaque souris. De récupération des fluides peut être partielle, en obtenant moins que la volume infusé. Si la collecte de cellules provenant de plus d&#39;une souris, placez le tube de 15 ml avec les cellules récoltées sur la glace jusqu&#39;à ce que tous les lavages pulmonaires ont été réalisées. </li></ol> 2. Traitement des lavage pulmonaire AMɸ récolte <ol><li> Centrifuger liquide de lavage pulmonaire à 250 x g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Utilisant une technique stérile, surnageant décanter dans un récipient approprié l&#39;intérieur d&#39;une enceinte de sécurité biologique. Remettre en suspension le culot cellulaire en faisant délicatement ratisser le tube de la centrifugeuse dans la partie supérieure d&#39;un tube à essai en rack. Ajouter 1 mL de milieu cAMɸ pour remettre en suspension les cellules. </li><li> Énumérer les cellules en utilisant une particule Coulter Counter Z1 par pipetage 20 pl de cellules dans 10 mL de diluant dans Isoton II Coulter flacon compteur. Ajouter 3 à 4 gouttes de Zap-oglobin II réactif lytique dans le flacon, retourner doucement 3 à 4 fois, puis charger le flacon d&#39;échantillon sur le comptoir pour obtenir une concentration cellulaire. Assurez-vous de programmer le compteur avec un facteur de dilution de 2 x 10 4 pour afficher lala concentration des cellules comme le nombre de cellules par ml. </li><li> Diluer cellules à 2,5 x 10 5 par ml utilisant un milieu cAMɸ. </li><li> Distribuer 2 ml de 2,5 x 10 5 cellules / ml dans chaque puits d&#39;un plat de 6 puits de culture de tissu. </li><li> Pour enrichir pour AMɸ, des boîtes de culture incuber l&#39;intérieur d&#39;un 37 ° C incubateur humidifié avec une atmosphère de CO 2 5% pendant 6 h pour permettre aux cellules d&#39;adhérer au fond du puits. Aspirer doucement le surnageant de ne pas perturber les cellules adhérentes. </li><li> Rincer les puits à l&#39;aide du PBS stérile (calcium et de magnésium libre) pour enlever les cellules non adhérentes et les débris. Ajouter 2 mL de milieu cAMɸ à chaque puits. </li><li> Incuber les cellules avec nuitées dans un 37 ° C incubateur humidifié avec une atmosphère de CO 2 5% avant l&#39;addition de stimulants. Après cette étape d&#39;enrichissement, d&#39;environ 87% des cellules sont positives pour les marqueurs des macrophages du CD11b et F4/80 (figure 2c). </li></ol> 3. Ajout de PolyanhydridLes nanoparticules e et traitements de contrôle <ol><li> Fabriquer des nanoparticules via polyanhydride anti-solvant nanoencapsulation 15. Dans ce procédé, le polymère est dissous dans du chlorure de méthylène (4 ° C à une concentration de 25 mg / ml) et précipité dans le pentane (-20 ° C à une ratio de 1:200 chlorure de méthylène: pentane). </li><li> Peser des nanoparticules à l&#39;aide polyanhydride stérilisés peser le papier sur un équilibre qui peut mesurer avec précision les montants microgrammes. Ajouter particules à un microtube de 1,5 mL. </li><li> Remettre en suspension des nanoparticules dans la glace froide cAMɸ. Calculs sont effectués de telle sorte que pas plus de 0,3 ml de milieu est ajoutée à chaque puits pour obtenir la concentration désirée de nanoparticules. Maintenir les particules remises en suspension sur la glace jusqu&#39;à ce que les nanoparticules sont ajoutées à la culture ainsi. </li><li> Avant d&#39;ajouter des nanoparticules à des cultures AMɸ, sonication particules en utilisant un sonicateur paillasse avec une micropointe. Stériliser micropointe par pulvérisation avec de l&#39;éthanol 70% et wiping avec une Kimwipe stérile avant sonication. Soniquer à 10-20 joules de 30 à 45 s tout en gardant le tube sur la glace. Observez suspension de nanoparticules macroscopiquement. Si particules ne sont pas suffisamment dispersée, permettre la suspension de fixer la glace pendant 1 à 2 min pour que les nanoparticules sont en dessous de la température de transition vitreuse du polymère avant sonication supplémentaire pour 30 à 45 secondes. L&#39;objet de la présente étape de sonication est de manière adéquate disperser les nanoparticules, selon le CPTEG 50:50: nanoparticules ont tendance à s&#39;agréger CPH lorsqu&#39;il est exposé à un environnement aqueux. Toutefois, certains petits agrégats de nanoparticules peuvent demeurer dans la suspension. </li><li> Suspension de nanoparticules (de manière adéquate dispersée) devrait être conservé dans la glace et être utilisée immédiatement pour empêcher l&#39;érosion prématurée de surface ou l&#39;agrégation. </li><li> Retirer les boîtes de culture contenant le AMɸ de l&#39;incubateur et le lieu dans le cabinet de biosécurité. Plaque inclinable à environ un angle de 45 degrés et la pipette au large de la quantité de médecineum qui sera ajoutée à la suspension de nanoparticules (il ne devrait pas dépasser 0,3 ml). Ne dérangez pas les cellules adhérentes lors du retrait du milieu. </li><li> Vortex la suspension de nanoparticules polyanhydride brièvement avant de les ajouter dans les puits appropriés. Introduire à la pipette la quantité de suspension de nanoparticules (pas plus de 0,3 mL) dans le puits spécifique (s), mais ne pas pipeter de haut en bas pour mélanger. Cette action pourrait se détacher de l&#39;adhérent AMɸ du puits. Les particules se déposent au fond du puits et de contacter les cellules. Pour les études présentées dans ce rapport, la concentration finale de nanoparticules co-cultivées avec le AMɸ était de 125 pg / ml. Procéder à des puits et des groupes de traitement suivants souhaités. Inclure les groupes témoins positifs et négatifs, tels que seul moyen et de 200 ng / mL de lipopolysaccharide (LPS) pour les puits désignés. </li><li> Retour des boîtes de culture à la 37 ° C incubateur humidifié avec une atmosphère de CO 2 5% pendant 48 h. Des études cinétiques dans notre laboratory ont montré 48 heures pour être la période de culture optimal pour évaluer à la fois l&#39;expression du marqueur de surface cellulaire et la sécrétion de cytokine, car elle permet un temps suffisant pour la transcription et la synthèse des protéines de se produire. Bien que des niveaux plus élevés de cytokines s&#39;accumulent au cours d&#39;une période de culture prolongée (c.-à-72 h), l&#39;évaluation de l&#39;expression du marqueur de surface cellulaire, à ce point dans le temps peut être confondu par la contribution des niveaux élevés de cytokines. Les changements dans l&#39;expression des marqueurs de surface observées peuvent ne pas être directement attribuables à la stimulation avec les nanoparticules elles-mêmes. </li></ol> 4. Évaluation d&#39;activation AMɸ par cytométrie en flux <ol><li> Préparer le tri de cellules activées par fluorescence (FACS) tampon (0,1% d&#39;azoture de sodium et 0,1% de sérumalbumine bovine (BSA)) dans 0,1 M de phosphate saline tamponnée (pH 7,4) avant la récolte des macrophages plaqués qui ont été co-cultivées avec des nanoparticules ostimulants r. </li><li> Préparer les solutions de travail de la mémoire tampon de blocage et les anticorps monoclonaux. Pour préparer le tampon de blocage, diluer IgG de rat (Sigma) et anti-CD16/32 (eBioscience) à 1 mg / ml et 10 pg / mL, respectivement, dans un tampon FACS. Diluer panel d&#39;anticorps de surface de marqueur dans le tampon FACS soit la concentration recommandée par le fabricant ou la concentration utilisateur optimisée. Pour les résultats présentés dans ce travail, le panel de marqueurs de surface se compose d&#39;anticorps contre MHC II, CD86, CD40 et CIRE (CD209). Anti-souris des anticorps contre les marqueurs des macrophages F4/80 et CD11b sont également inclus dans le panneau pour identifier le phénotype des macrophages lors de l&#39;analyse des données. Des précautions doivent être prises lors de la sélection des anticorps contre des molécules du CMH II, comme souches de souris consanguines diffèrent souvent dans leurs haplotypes du CMH II. Les anticorps sélectionnés doivent réagir avec les alloantigènes spécifiques du CMH exprimées par votre souche de souris d&#39;intérêt. </li><li> Après 48 h d&#39;incubation avec des nanoparticules et / oules stimulants, les plats lieu de culture de cellules sur la glace pendant 20 min. Pour supprimer les macrophages adhérents des plaques, grattez délicatement les puits avec un grattoir à cellules 24 cm. </li><li> En utilisant une pipette sérologique de 5 ml, aspirer délicatement les cellules et le milieu haut et en bas à cinq reprises pour générer une seule suspension cellulaire. Introduire à la pipette le contenu des puits individuels dans des tubes de polystyrène séparées 5 mL afin de ne pas mélanger les cellules de différents traitements expérimentaux. </li><li> Ajouter 2 ml de tampon FACS à chaque tube. </li><li> Centrifuger les tubes de cellules à 250 x g à 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Décanter le surnageant cellulaire et doucement Resuspendre le culot dans le liquide résiduel en ratissant les tubes dans la partie supérieure d&#39;un tube à essai en rack. </li><li> Afin de prévenir la non-spécifiques de liaison des anticorps monoclonaux, ajouter 10 ul de tampon de blocage (préparé en 4.2) à chaque tube de cellules. Tubes vortex et incuber sur de la glace pendant 30 min. </li><li> Ajouter le volume approprié de dilution des anticorps monoclonaux à chaque tube et Incubmangé dans le noir sur la glace pendant 15 min. Tubes contenant des échantillons à analyser doivent recevoir la combinaison d&#39;anticorps du panneau polycromatic (optimisation de la précédente combinaison d&#39;anticorps doit être effectué par les laboratoires individuels). Groupes de contrôle supplémentaires doivent être inclus pour définir correctement les paramètres d&#39;acquisition sur le cytomètre en flux, y compris un tube de cellules qui n&#39;ont pas été marqués, et les tubes de rémunération qui correspondent à des cellules marquées à l&#39;aide de chaque couleur unique séparément. Pour définir correctement les portes pour l&#39;analyse par cytométrie en flux, la fluorescence Minus One (FMO) contrôles doivent être inclus lors de l&#39;acquisition. Contrôles FMO sont des cellules marquées avec tous les anticorps conjugués au fluorochrome qui sont utilisés sur le panneau, sauf celui qui est remplacé par son contrôle isotype respectif. Populations positifs et négatifs (c.-à-aliquotes séparées de cellules traitées avec un stimulant contrôle positif et le milieu seul) devrait également être inclus dans le FMO et des tubes de commande de compensation. </li><li&gt; Ajouter 2 mL de tampon FACS à chaque tube, vortex et centrifuger à 250 x g à 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Décanter surnageant et remettre en suspension dans le liquide culot cellulaire résiduelle par râteleuse les tubes dans la partie supérieure d&#39;un portoir de tubes à essai. </li><li> Si le panneau d&#39;anticorps comprend un anticorps pas directement conjugué à un fluorochrome, mais est au contraire conjugué à la biotine, la streptavidine conjugué à un fluorochrome est nécessaire pour visualiser le marqueur de surface. Dans cette étape, ajoutez un volume approprié de l&#39;dilué conjugué à un fluorochrome streptavidine et incuber dans l&#39;obscurité pendant 15 min sur la glace. Comme au point 4.2, la streptavidine sera diluée à une concentration recommandée par le fabricant ou à l&#39;un optimisé par l&#39;utilisateur. Cette étape est nécessaire uniquement pour les panneaux contenant des anticorps primaires biotinylés. </li><li> Effectuez une étape de lavage tel que décrit en 4.10. </li><li> Diluer un volume adéquat de BD stabiliser 01:03 fixatif dans l&#39;eau déminéralisée. Ajouter 100 ul de fixateur dilué dans chaque tube tout en douceur vortexing pour empêcher l&#39;agglutination des cellules. Les cellules marquées et fixé peut être stocké de façon stable dans l&#39;obscurité à 4 ° C pendant environ une semaine avant l&#39;acquisition d&#39;un cytomètre en flux. </li></ol> 5. Les données représentatives Nanoparticules fabriquées à l&#39;étape 3.1 avaient un diamètre moyen de 163 ± 24 nm et une morphologie compatible avec celle obtenue dans des études antérieures 5,16. Les nanoparticules en solution avant et après sonication sont présentés dans la figure 1 pour démontrer la nécessité de sonication pour assurer la dispersion adéquate des particules. L&#39;analyse par cytométrie en flux de AMɸs récoltés obtenus par lavage pulmonaire est montré dans la figure 2. Marquage des cellules avec une combinaison d&#39;anticorps anti-souris CD11b et anti-souris F4/80 anticorps ainsi que les commandes correspondantes FMO permet d&#39;établir l&#39;étiquetage de fond, l&#39;identification et AMɸs déclenchement pour une analyse ultérieure. Traitement des macrophages alvéolaires avec polyanhydridenanoparticules augmente l&#39;activation comme indiqué par l&#39;intensité accrue de fluorescence moyenne des molécules du CMH II, CD40, CD86, et CIRE (Figure 3). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig1.jpg" /> . Figure 1 50:50 CPTEG: CPH nanoparticules avant (A) et après (B) de 30 s de sonication. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig2.jpg" /> Figure 2. Analyse par cytométrie en flux de la récolte des macrophages alvéolaires marqués avec (A) Alexa Fluor 700 anti-CD11b et le PE-Cy7 FMO contrôle, (B) Alexa Fluor 700 FMO contrôle et la anti-F4/80 PE-Cy7 et (C ) Alexa Fluor 700 anti-CD11b et PE-Cy7 anti-F4/80. Le nombre dans le coin en haut à droite représente le pourcentage de cellules positives double. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig3.jpg" /> Figure 3. Histogrammes montrant une augmentation de la fluorescence intentionsité pour l&#39;expression de surface des molécules du CMH II (A), CD40 (B), CD86 (C) et CIRE (D) après avoir co-culture de macrophages alvéolaires avec CPTEG 50:50: polyanhydride CPH nanoparticules pendant 48 h. Histogrammes dépeignent résultats pour AMɸ étiquetés en tant que contrôles FMO ( <img alt="Ligne graphique 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883line1.jpg" /> ), Non traitée AMɸ marquées avec des anticorps contre tous les marqueurs de surface cellulaire ( <img alt="Ligne graphique 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883line3.jpg" /> ) Et AMɸ cultivées avec des nanoparticules et étiquetés avec des anticorps contre tous les marqueurs de surface cellulaire ( <img alt="Ligne graphique 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883line2.jpg" /> ).

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</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Plates-formes de nanoparticules polyanhydride vaccins ont montré une efficacité lorsqu&#39;il est administré par voie intranasale à des posologies à dose unique 5. Mesure de l&#39;activation des cellules phagocytaires populations résidentes dans les poumons induites par cette plate-forme d&#39;administration des vaccins permettant l&#39;évaluation de sa capacité potentielle à terme, de promouvoir des réponses immunitaires adaptatives. Plus précisément, la récolte des macrophages a...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Le numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> CAM médias </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> 50 mM de 2-mercaptoéthanol </td><td> Sigma </td><td> M3148-25ML </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine 10000 ug / ml Solution </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> FACS tampon </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Le chlorure de sodium </td><td> Fisher Scientific </td><td> S671-500 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate de sodium </td><td> Fisher Scientific </td><td> MK7868500 </td><td></td></tr><tr><td> Le chlorure de potassium </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217500 </td><td></td></tr><tr><td> Le phosphate de potassium </td><td> Fisher Scientific </td><td> P288-200 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (Bovine Serum Albumin) </td><td> Sigma </td><td> A7888 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;azoture de sodium </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rat IgG </td><td> Sigma </td><td> I4341 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mme CD16/32 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0161 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mme CMH II haplotype IA / IE, clone M5/114.15.2, conjugué à l&#39;isothiocyanate de fluorescéine (FITC) </td><td> EBIOScience </td><td> 11-5321 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris CD86, clone GL-1, conjugué à l&#39;allophycocyanine (APC)-Cy7 </td><td> Biolegend </td><td> 105030 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris CD40, clone 1C10, conjugué à l&#39;APC </td><td> eBioscience </td><td> 17-0401 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris CD209, clone 5h10, conjugués à la biotine </td><td> eBioscience </td><td> 13-2091 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris CD11b, clone M1/70, conjugué à Alexa Fluor 700 </td><td> eBioscience </td><td> 56-0112 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris F4/80, clone BM8, conjugué à la phycoérythrine (PE)-Cy7 </td><td> eBioscience </td><td> 25-4801 </td><td></td></tr><tr><td> PE-rouge Texas streptavidine conjuguée </td><td> BD Biosciences </td><td> 551487 </td><td></td></tr><tr><td> Autres fournitures et réactifs </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> L&#39;éthanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A405-20 </td><td> Utilisé comme 70% (v / v) </td></tr><tr><td> Comprimé CO 2 </td><td> Linweld </td><td> 16000060 </td><td></td></tr><tr><td> Seringue de 1 ml </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Souverain 3 ½ &quot;Père Tom Catcatheter </td><td> Kendall </td><td> 703021 </td><td></td></tr><tr><td> Prévention des risques biotechnologiques du Cabinet </td><td> NuAire </td><td> Série 22 </td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux de dissection </td><td> Pêcheur </td><td> 138082 </td><td></td></tr><tr><td> Forceps </td><td> Roboz </td><td> RS-8254 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 1X, sans calcium et de magnésium </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CM </td><td></td></tr><tr><td> 15 Tubes à centrifuger mL avec bouchon à vis </td><td> VWR International </td><td> 21008-216 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue Culture Six-bien traités Plaques </td><td> Costar </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> Portoirs pour tubes en plastique </td><td> Nalgene </td><td> 5970 </td><td></td></tr><tr><td> Grattoir à cellules 24 cm </td><td> PPT </td><td> 99002 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml en polystyrène à fond rond Tube </td><td> Faucon </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet-Aid XL </td><td> Drummond </td><td> 4-000-105 </td><td></td></tr><tr><td> 10, 5, et 2 mL Pipettes </td><td> Pêcheur </td><td> 13-675 </td><td></td></tr><tr><td> 200 et 10 ul micropipettes </td><td> Gilson Pipetman </td><td> F123601 </td><td></td></tr><tr><td> 200 et 10 embouts de pipette ul </td><td> Pêcheur </td><td> 02-707 </td><td></td></tr><tr><td> BD stabilisationFixateur </td><td> BD Biosciences </td><td> 338036 </td><td></td></tr><tr><td> Isoton II Diluant </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 8546719 </td><td></td></tr><tr><td> Zap-oglobin II lytique réactif </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 7546138 </td><td></td></tr><tr><td> Flacons Coulter polystyrène compteur </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 14310-684 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes à essai </td><td> BD Biosciences </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Équipement </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse réfrigérée </td><td> Labnet </td><td> 50075040 </td><td></td></tr><tr><td> Incubateur humidifié CO 2 </td><td> Nuaire </td><td> Autoflow Modèle 8500 </td><td></td></tr><tr><td> Cytomètre en flux FACSCanto </td><td> BD Biosciences </td><td> 338960 </td><td></td></tr><tr><td> Compteur de particules Coulter Z1 </td><td> Beckman-Coulter </td><td> WS-Z1DUALPC </td><td></td></tr><tr><td> Équipement de traitement Sonicator liquide avec Microtip </td><td> Misonix </td><td> Modèle n ° S-4000 </td><td></td></tr></tbody></table>

la récolte macrophages alvéolaires murins et l&#39;évaluation d&#39;activation cellulaire induite par des nanoparticules polyanhydride

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Nanoparticules biodégradables ont émergé comme une plate-forme polyvalente pour la conception et la mise en œuvre de nouveaux vaccins par voie intranasale contre les maladies respiratoires infectieuses. En particulier, polyanhydride nanoparticules composé de l&#39;acide sébacique aliphatique (SA), l&#39;aromatique 1,6-bis (p-carboxyphénoxy) hexane (CPH), ou l&#39;amphiphile 1,8-bis (p-carboxyphénoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) afficher en vrac unique et cinétique d&#39;érosion de surface 1,2 et peut être exploitée afin de libérer lentement biomolécules fonctionnelles (par exemple, les antigènes protéiques, des immunoglobulines, etc) in vivo 3,4,5. Ces nanoparticules possèdent également une activité adjuvante intrinsèque, ce qui les rend un excellent choix pour une plate-forme d&#39;administration des vaccins 6,7,8. Afin d&#39;élucider les mécanismes qui régissent l&#39;activation de l&#39;immunité innée après la vaccination muqueuse nasale, il faut évaluer les réponses moléculaires et cellulaires de la p antigènecellules sentant (APC) responsables pour initier des réponses immunitaires. Les cellules dendritiques sont des APC principaux trouvés dans des voies aériennes, tandis que les macrophages alvéolaires (AMɸ) prédominent dans le parenchyme pulmonaire 9,10,11. AMɸ sont très efficaces dans l&#39;élimination des poumons de pathogènes microbiens et 12,13 débris cellulaires. En outre, ce type de cellule joue un rôle important dans le transport d&#39;antigènes microbiens vers les ganglions lymphatiques drainant, ce qui est une première étape importante dans l&#39;initiation d&#39;une réponse immunitaire adaptative 9. AMɸ également exprimer des niveaux élevés de reconnaissance de formes innée et récepteurs éboueurs, sécrètent des médiateurs pro-inflammatoires, et les lymphocytes T 12,14. Une population relativement pure de AMɸ (par exemple, supérieure à 80%) peut être facilement obtenu par un lavage du poumon à l&#39;étude dans le laboratoire. Resident AMɸ récoltées à partir de immunitaires des animaux compétentes de fournir un phénotype représentant des macrophages qui encounter le vaccin à base de particules in vivo. Ici, nous décrivons les protocoles utilisés pour la récolte et la culture AMɸ de souris et d&#39;examiner le phénotype d&#39;activation des macrophages après le traitement avec des nanoparticules polyanhydride in vitro.

Ici, nous décrivons les protocoles pour la récolte des macrophages alvéolaires murins, qui sont des résidents cellules immunitaires innées dans le poumon, et en examinant leur activation en réponse à la co-culture avec des nanoparticules polyanhydride.

La récolte macrophages alvéolaires murins et l&#39;évaluation d&#39;activation cellulaire induite par des nanoparticules polyanhydride

Les nanoparticules biodégradables sont devenues une plateforme polyvalente pour la conception et la mise en œuvre de nouveaux vaccins intranasaux contre les infections respiratoires...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la capacité des nanoparticules de polyanhydride à activer des macrophages alvéolaires purifiés. Tout d'abord, la trachée de la souris est exposée chirurgicalement et un lavage broncho-alvéolaire est effectué pour recueillir des cellules du tractus respiratoire. Les macrophages alvéolaires sont ensuite centrifugés pour les isoler et mis en culture pendant une nuit.Une suspension de nanoparticules de polyanhydride est ensuite préparée et ajoutée aux macrophages alvéolaires. Les macrophages sont incubés afin de permettre leur activation après 48 heures. L'expression des marqueurs de surface cellulaire est analysée par cytométrie en flux.L'analyse des données permet d'identifier des formulations de nanoparticules de Polly Anhydride capables d'activer des macrophages alvéolaires miroirs. Ce métal peut aider à répondre à des questions dans les domaines des biomatériaux et de l'immunologie. Plus précisément, nous pouvons identifier des biomatériaux dotés d'une activité adjuvante intrinsèque, comme en témoigne leur capacité à activer les cellules présentatrices d'antigènes, notamment les macrophages alvéolaires.Nous avons eu pour la premi

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Une méthode pour évaluer la capacité des macrophages alvéolaires isolés de la souris pour contrôler la croissance des spores d'Aspergillus phagocytées par microscopie confocale.

Évaluation de l&#39;activité anti-fongique isolé macrophages alvéolaires par microscopie confocale

Les cellules de moelle osseuse cultivées avec le facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytes (GM-CSF) génèrent une culture hétérogène contenant des macrophages et des cellules dendritiques (DC). Cette méthode met en évidence l’utilisation de la liaison au MHCII et à l’hyaluronane (HA) pour différencier les macrophages des CD dans la culture GM-CSF. Les macrophages de cette culture présentent de nombreuses similitudes avec les macrophages alvéolaires.

Génération et identification de GM-CSF dérivé alvéolaires comme Macrophages et cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

Nous décrivons ici le modèle et l’approche pour étudier les fonctions des macrophages alvéolaires pulmonaires dans les métastases cancéreuses. Pour démontrer le rôle de ces cellules dans les métastases, le modèle syngénique (4T1) du cancer du sein en conjonction avec la déplétion du macrophage alvéolaire avec des liposomes clodronates a été utilisé.

L&#39;étude du rôle des macrophages alvéolaires dans le cancer du sein métastase

L'état de santé du poumon se reflète dans le type et le nombre de cellules immunitaires présentes dans les bronchioles du poumon. Nous décrivons une technique de lavage broncho-alvéolaire qui permet l'isolement et l'étude de cellules non adhérentes et des facteurs solubles des voies respiratoires inférieures des souris.

Lavage bronchoalvéaire des poumons murins pour analyser l&#39;infiltration cellulaire inflammatoire

Cette communication décrit les méthodes d’isolement et culture des macrophages alvéolaires, des humains et des modèles murins à des fins expérimentales.

Isolement et la Culture In Vitro de Macrophages alvéolaires murines et humaines

Nous rapportons ici les méthodes courantes pour analyser la fonction phagocytaire des macrophages alvéolaires murines et clairance bactérienne du poumon. Ces méthodes d’étudient de la phagocytose des perles de l’isothiocyanate de fluorescéine in vitro et in vivo phagocytose de Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. On décrit également une méthode de dégagement de P. aeruginosa chez la souris.

Phagocytose des macrophages alvéolaires et dégagement de bactéries chez la souris

Nous décrivons une méthode pour traiter le liquide de lavage bronchoalveolar et le sang périphérique assorti des individus chroniquement HIV-infectés sur la thérapie antirétrovirale pour évaluer les réservoirs pulmonaires de HIV. Ces méthodes ont comme conséquence l'acquisition des cellules T cD4 très pures et des macrophages alvéolaires qui peuvent plus tard être employés pour l'immunophénotypage et les quantifications d'ADN/ARN de HIV par réaction en chaîne ultrasensible de polymérase.

Traitement du liquide de lavage bronchoalvéolaire et du sang apparié pour le macrophage alvéolaire et le CD4- Immunophénotypage à cellules T et évaluation du réservoir du VIH

Ce manuscrit décrit un protocole pour déterminer si l'exposition à l'ozone, un polluant atmosphérique de critères, altère l'efferocytose de macrophage alvéolaire in vivo. Ce protocole utilise des réactifs et des techniques couramment utilisés et peut être adapté à plusieurs modèles de lésions pulmonaires pour déterminer les effets sur l'efférocytose macrophage alvéolaire.

Évaluation in vivo de l'efférocytose du macrophage alvéolif après l'exposition à l'ozone

Ce protocole fournit aux chercheurs une méthode rapide et indirecte de mesure de l'activité du facteur de transcription NF-B/AP-1, dépendante de TLR, dans une lignée de cellules macrophages murines en réponse à une variété de surfaces polymères et de couches protéiques adsorbées qui modélisent le microenvironnement de l'implant biomatériau.

A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces

Présenté ici est un protocole pour l’isolement primaire de monocyte de sang humain aussi bien que leur différenciation dans les macrophages et les cellules dendritiques et l’assemblage avec des cellules épithéliales dans un modèle humain multicellulaire de poumon. Les réponses biologiques des cocultures composées de cellules immunitaires différenciées des monocytes fraîchement isolés ou décongelés, lors de l’exposition à des stimuli proinflammatoires, sont comparées.

Modèle alvéolaire humain multicellulaire composé de cellules épithéliales et de cellules immunitaires primaires pour l’évaluation des risques

Découvrez comment récolter des macrophages alvéolaires murins et évaluer leur activation par des nanoparticules polyanhydride. Cette méthode combine lavage bronchoalvéolaire et cytométrie en flux pour étudier les réponses immunitaires pulmonaires.

La récolte macrophages alvéolaires murins et l'évaluation d'activation cellulaire induite par des nanoparticules polyanhydride

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