Aspiration par micropipette des cellules au substrat joints pour estimer la rigidité cellulaire

L'objectif de l'expérience suivante est d'analyser les propriétés viscoélastiques cellulaires dans différentes conditions physiologiques et pathologiques. Ceci est réalisé en appliquant une pression négative à la membrane cellulaire au moyen d'une micropipette aass reliée à un transducteur de pression, construit à partir de capillaires en verre à l'aide d'un tireur de micropipettes. La micropipette est fixée sur un micro-manipulateur fin positionné sur la platine d'un microscope inversé, et l'extrémité de la micropipette est approchée très près d'une cellule.

Ensuite, un scellement est créé entre l'extrémité de la pipette et la membrane cellulaire ; la déformation de la membrane dans la pipette est alors mesurée en réponse à un palier de pression négative appliqué. Les résultats obtenus montrent les effets de différents traitements sur les propriétés biomécaniques cellulaires, selon le degré de déformation membranaire en réponse à une force bien définie. L'objectif de notre laboratoire est d'étudier l'impact de la dyslipidémie sur les propriétés biophysiques et biomécaniques des cellules endothéliales vasculaires, et nous allons vous présenter aujourd'hui une méthode appelée aspiration par micropipette, que nous utilisons pour mesurer la rigidité cellulaire.

Les implications de cette technique s'étendent à la compréhension fondamentale de la biomécanique cellulaire dans divers mécanismes tels que l'angiogenèse, la détection mécanique et la migration, entre autres. Bien que cette méthode permette d'obtenir des informations sur la biomécanique cellulaire, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme les membranes modèles, les organites intracellulaires ou les tissus. Afin de visualiser la membrane cellulaire et d'observer le prolongement membranaire dans la pipette, les membranes cellulaires endothéliales vasculaires sont marquées à l'aide d'un colorant fluorescent lipophile.

Pour commencer, diluez le colorant stock à une concentration de travail à l’aide d’une solution de PBS réchauffée, puis soniquez le mélange pendant cinq minutes afin de dégrader les agrégats D. Après une centrifugation de cinq minutes dans la microcentrifugeuse, retirez le surnageant, puis lavez les cellules endothéliales vasculaires en ajoutant 0,5 millilitre de PBS. Au bout de cinq minutes, aspirez la solution et procédez à deux autres lavages.

Ensuite, ajoutez la solution de colorant aux cellules et incubez pendant 30 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Après l'incubation, lavez à nouveau les cellules avec du PBS comme précédemment. Les micropipettes sont tirées en chauffant un capillaire en verre au milieu.

Lorsque le verre commence à fondre, les deux moitiés du capillaire sont tirées pour produire deux micropipettes. Les extrémités des pipettes utilisées dans ces expériences ont généralement un diamètre compris entre deux et six micromètres. En fonction de la taille de la cellule, le diamètre extérieur, la forme de l'extrémité doit ressembler à un tube cylindrique avant d'insérer le capillaire en verre dans l'étireur de pipettes.

Dans cette démonstration, l'embout de pipette horizontale Suter P 97 est utilisée avec un programme optimisé. Ce tireur offre plusieurs options programmables permettant de modifier la vitesse et d'autres paramètres de l'étirement. Passez à l'activation du programme de tirage.

Après avoir tiré chaque micropipette, vérifiez la forme de l'extrémité sous le microscope. Après le polissage thermique de l'extrémité, remplissez la micropipette avec une solution saline physiologique telle que le PBS ou un milieu de culture non fluorescent. Il est important que la solution soit enrichie avec 30 % de sérum, ce qui permettra à la membrane cellulaire de pénétrer en douceur dans la micropipette. Dans cette démonstration, un microscope inversé à fluorescence doté de capacités de déconvolution 3D est utilisé, couplé à une caméra vidéo reliée à un ordinateur, un transducteur de pression, une station anti-vibration et un micromanipulateur, afin de commencer à monter les cellules dans une chambre d'aspiration micrométrique en soulevant les cellules de leur substrat et en les transférant à l’aide d’une micropipette dans une chambre longitudinale peu profonde fixée sur le microscope inversé à fluorescence.

Le recours à une chambre longitudinale peu profonde vise à permettre à une micropipette de s'approcher des cellules selon un angle très faible, aussi proche que possible de l'horizontale. Cela permet de visualiser sur un seul plan de mise au point la membrane aspirée dans la micropipette. Placez une micropipette remplie dans un support de pipette relié à un transducteur de pression par un tube souple, dont le diamètre est adapté au raccord du support de pipette afin d'assurer un ajustement étanche.

Au début de chaque expérience, la pression dans la pipette est équilibrée avec la pression atmosphérique. Monter la pipette sur un micromanipulateur permettant un contrôle précis des déplacements de la pipette dans l'échelle du micron. Positionner la pipette selon un angle faible par rapport au fond de la chambre et amener l'extrémité de la pipette au centre du champ visuel. Le fût de la pipette, qui correspond à la partie cylindrique de l'embout dans laquelle la membrane est aspirée, doit être aligné horizontalement par rapport au plan focal.

Pour atteindre cette première position, placez la pipette selon l'angle le plus faible possible, puis fléchissez la tige de la pipette contre le fond de la chambre. Étant donné que la tige est très fine, elle est suffisamment flexible pour glisser sur le fond de la chambre tout en s'approchant d'une cellule. Abaissez lentement la micropipette sur le côté d'une cellule unique à l’aide du manipulateur grossier, jusqu’à ce qu’elle soit proche du plan de focalisation de la cellule.

Ensuite, à l’aide du micromanipulateur fin, déplacez la micropipette vers le bord de la cellule jusqu’à ce que la pointe de la pipette touche délicatement la membrane. Prenez une image pour observer la position de la pipette. De bons scellements sont obtenus lorsque toute la pointe de la pipette est en contact complet avec la surface de la cellule et que ce contact est stable.

Ensuite, appliquez une étape de pression négative à l’aide du transducteur et maintenez-la jusqu’à ce que la projection membranaire soit stabilisée. La quantité de pression nécessaire pour aspirer la membrane dans la pipette varie selon le type cellulaire et les conditions expérimentales spécifiques. Une déformation initiale est généralement observée lorsqu’on applique une pression comprise entre moins deux et moins 15 millimètres de mercure.

Lorsque la pression est appliquée, la membrane se déforme progressivement dans la pipette jusqu'à ce qu'elle se stabilise à une certaine longueur. Ce processus prend généralement deux à trois minutes ; durant ce temps, des images de la déformation de la membrane doivent être prises toutes les 30 secondes afin de suivre l'avancement de la membrane aspirée dans la pipette. Enfin, augmentez la pression au niveau suivant par paliers de deux à cinq millimètres de mercure.

Répétez l'ensemble de la procédure jusqu'à ce que la projection membranaire se détache de la cellule et pénètre dans la pipette, moment auquel l'expérience est arrêtée. Pour quantifier le degré de déformation de la membrane, la longueur aspirée est mesurée depuis l'extrémité de la pipette jusqu'au sommet de la circonférence de la projection membranaire. Une pipette plus grande exercera une force plus importante sur la membrane cellulaire au même niveau de pression, afin de tenir compte des variations entre les diamètres des pipettes.

La longueur aspirée est normalisée par rapport au diamètre de la pipette mesuré pour chaque expérience afin de valider l'utilisation de la technique de microaspiration pour les cellules attachées au substrat. Elle a été testée avec une perturbation de l'actine F, ce qui entraîne une diminution de la rigidité des cellules endothéliales aortiques de bovin, comme estimé par cette approche. Ici, une série typique d'images fluorescentes d'une membrane endothéliale subissant une déformation progressive en réponse à une pression négative appliquée par une micropipette est présentée, comme attendu. La membrane est progressivement aspirée dans la pipette et la longueur aspirée augmente en fonction de la pression appliquée. Les courbes temporelles de la déformation montrent que la perturbation de l'actine F augmente significativement les longueurs aspirées des prolongements sous toutes les conditions de pression.

Grâce à cette approche, il a été découvert que la rigidité cellulaire augmente lorsque les membranes cellulaires sont appauvries en cholestérol, tandis qu'un enrichissement en cholestérol n'avait aucun effet. Ici, une cellule enrichie en cholestérol, une cellule témoin et une cellule appauvrie en cholestérol sont présentées après avoir atteint des longueurs maximales d'aspiration de moins 15 millimètres de mercure. Les projections commençaient généralement à se développer à moins 10 millimètres de mercure, et les courbes temporelles de déformation de la membrane pouvaient être mesurées pour des pressions négatives de 10, 15 et 20 millimètres de mercure.

Ici, les longueurs maximales aspirées sont représentées en fonction de la pression appliquée. La longueur maximale normalisée dans les cellules appauvries était significativement inférieure à celle des cellules témoins pour des pressions de moins 15 millimètres de mercure et de moins 20 millimètres de mercure. L'application de pressions négatives supérieures à 25 millimètres de mercure a entraîné le détachement de la projection aspirée, formant un sle distinct.

Le niveau de pression ayant entraîné le détachement de la membrane était similaire dans différentes conditions de cholestérol, une observation inattendue. Comme le montrent des études antérieures, une augmentation du cholestérol membranaire renforce la rigidité des bicouches lipidiques membranaires. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures si elle est effectuée correctement. Lors de la mise en œuvre de cette technique, il est important de se rappeler que cette expérience est réalisée sur des cellules individuelles.

Par conséquent, trois à cinq cellules doivent être analysées par condition et par expérience, pour un total de trois expériences indépendantes.