Une méthode étape par étape pour la reconstitution d'un transporteur ABC dans des particules lipidiques Nanodisc

L’objectif global de cette procédure est d’incorporer un transporteur A, b, C. Dans ce cas, le transporteur de maltose malf GK deux en particules de nanodisque membranaire solubles. Ceci est accompli en mélangeant d’abord la protéine d’échafaudage membranaire MSP, avec le transporteur et la quantité correcte de lipides dans les mycellules détergentes.

La deuxième étape consiste à ajouter des billes de polystyrène et à secouer doucement le mélange pendant la nuit, le détergent est progressivement absorbé sur les billes, permettant la formation des particules du nano-disque. Ensuite, les billes sont éliminées par sédimentation. La dernière étape consiste à séparer les disques correctement formés des agrégats et des protéines d’échafaudage non assemblées par chromatographie par filtration sur gel.

Enfin, la qualité des disques est évaluée par électrophorèse sur gel natif ou spectroscopie de diffusion de la lumière. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes comme les liposomes, est que les protéines et les disques membranaires sont parfaitement solubles dans une solution aqueuse. De plus, les domaines protéiques sont maintenant accessibles des deux côtés.

En utilisant des protéines d’échafaudage membranaire de différentes longueurs, j’ai pu piéger et étudier les différents états ligamentaires des protéines membranaires. Plus important encore, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la protéomique membranaire, telles que l’identification de nouveaux partenaires de liaison des transporteurs a, b, C. En fait, les implications de cette technique s’étendent plus loin vers la thérapie, car elle peut aider à la découverte d’activateurs ou d’inhibiteurs de protéines et de récepteurs membranaires.

Bien que cette méthode semble simple, il faut être prudent lors du choix du bon rapport protéines-lipides. Généralement, les personnes novices dans cette méthode ont du mal à calculer le bon rapport de moulage ou à effectuer le bon contrôle qui garantit la qualité de la préparation. Par conséquent, une démonstration visuelle de cette méthode est très utile pour un nouvel étudiant afin d’apprendre les différentes étapes et les difficultés potentielles.

Pour commencer, la grohexa histidine a marqué MSP dans la souche BL 21 DE trois du plasmide P MSSP 1D un a induit la production de protéines lorsque la densité optique mesurée à 600 nanomètres est d’environ 0,5 pendant trois heures à 37 degrés Celsius, récoltez les cellules par centrifugation à 5 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Mettre à nouveau en suspension la pastille dans un tampon TSG 10 contenant 100 poux PMSF micromolaires les cellules avec une presse française trois fois à 8 000 PS. J’enlève la matière insoluble par centrifugation à 5 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Isoler ensuite la fraction soluble contenant le MSP par ultracentrifugation à 125 000 Gs pendant 45 minutes.

Purifier le MSP par chromatographie chélative du nickel en utilisant environ 1,5 millilitre de nickel seros haute performance dans le tampon TSG 10. Éliminez les contaminants avec un tampon T SG 10 contenant 50 millimolaires d’élué ILE. Le MSP avec tampon TSG 10 contenant 600 millimolaires I midaz après dialyse.

La protéine purifiée contenue dans le tampon TSG 10 MSP peut être stockée à moins 70 degrés Celsius et à une concentration en protéines d’environ 10 à 15 milligrammes par millilitre. Le complexe MALF GK deux, qu’il a marqué à l’extrémité C de MAL K, est exprimé à partir du plasmide. PED 22 FG K cultivé dans la souche e coli BL 21 DE trois induisent la production de protéines lorsque la densité optique mesurée à 600 nanomètres est d’environ 0,5 avec 0,2 % L d’Arabes pendant trois heures à 37 degrés Celsius après lyse cellulaire et centrifugation.

Comme précédemment, nous suspendons la pastille de membrane dans le tampon TSG 20 à une concentration finale de cinq milligrammes par millilitre. Ensuite, solubiliser le matériau avec 1 % de poids par volume de GDM pendant trois heures à quatre degrés Celsius en secouant doucement. Éliminer la matière insoluble par ultracentrifugation comme pour l’épuration du MAL FTK deux.

Ensuite, prélever le surnageant contenant le complexe solubilisé mal FTK two et purifier à nouveau avec la chromatographie chélatrice du nickel. Purifier davantage le complexe par chromatographie de filtration sur gel dans un tampon TSGD sur une colonne SUEx 200, HR dix trois cents à un débit de 0,5 millilitres par minute. Pour préparer les phospholipides, un extrait lipidique total d’E coli dissous dans du chloroforme est séparé en 1000 aliquotes anomales dans des tubes microfiches à bouchon à vis, évapore le solvant sous un léger courant d’azote et poursuit la nuit sous vide.

Desséchez ensuite, dissolvez le film lipidique dans le tampon TS à une concentration finale de cinq NMO et vortex vigoureusement, puis pulsez le sonicate cinq fois pendant environ cinq secondes. Les lipides dissous apparaîtront légèrement opaques en raison de leur insolubilité générale dans le tampon TS aqueux, mais ils doivent rester en suspension. Ajoutez du DDM à une concentration finale de 0,5 %À ce stade, la solution deviendra claire, placez le mélange lipidique dans un bain-marie et pulsez le sonicate cinq fois pendant environ cinq secondes.

Le mélange de lipides peut être stocké à quatre degrés Celsius pendant une semaine au maximum. Pour préparer les billes bio, placez environ 10 à 15 millilitres de billes bio dans un tube de 50 millilitres. Tout d’abord, lavez les billes avec 50 millilitres de 100 % méthanol.

Laissez les billes se déposer par gravité, puis versez doucement la solution. Répétez le processus une fois pour le méthanol, puis deux fois pour l’eau à 95 % d’éthanol, le milli Q et enfin le tampon TS. Commencer la constitution nano discrète en diluant le MSP dans le tampon TSGD à la concentration finale d’environ sept milligrammes par millilitre ou 0,3 millimolaire.

Pour garantir le succès de l’expérience, il est important de choisir les bons ratios de lipides et de protéines à mélanger. Mélangez environ deux M de complexe de malf GK two purifié à un rapport protéine/MS P/lipide de un à trois à 60 dans un tampon TSGD pour un volume final de 300 microlitres ici, un échantillon de lipide en excès dans un rapport de un à trois à 400 est également préparé comme témoin négatif à 50 microlitres de suspension de billes de bio dans le tube et incubez le mélange pendant la nuit sur un table à bascule à quatre degrés Celsius le lendemain, sédimentez les perles par gravité. Une fois que les billes se sont déposées, pipez-le vers la solution à travers une pointe étroite pour éviter autant de billes biologiques que possible.

Éliminer les gros précipités par ultracentrifugation à 100 000 GS pendant 20 minutes. Procédez à la purification des disques par chromatographie de filtration sur gel comme effectuée précédemment dans le tampon TSG 10. Ensuite, injectez un Eloqua sur la même colonne de filtration de gel pour tester la stabilité de la préparation.

Regroupez ensuite les fractions contenant les disques. La qualité de la préparation est évaluée par électrophorèse sur gel natif. Analyser une micromolaire de nanodisques pour évaluer la qualité de la reconstitution.

Evaluer également la liaison de mal E au complexe mal ftk deux reconstitué dans des nano disques. Après l’électrophorèse, colorez le gel avec du bleu kumasi pendant 10 minutes et maintenez-le pendant environ une heure. Pour effectuer une diffusion dynamique de la lumière ou DLS, purifiez d’abord les nanodisques par chromatographie de filtration sur gel comme auparavant, à l’aide d’une colonne SUEx 200 HR dix trois cents à un débit de 0,1 millilitre par minute.

Stockez des fractions contenant des nanodisques et concentrez-vous à environ 10 milligrammes par millilitre avec un filtre centrifuge AmCon. Filtrez ensuite l’échantillon deux fois. Effectuez une analyse par DLS à l’aide d’un instrument dynapro nano star dans un volume intérieur d’un microlitre.

À l’aide du logiciel dynamique pour estimer le diamètre et le poids moléculaire des particules, déterminez l’activité A TPA de deux nanodisques reconstitués à l’aide d’un test cholémétrique. Mélangez d’abord une micromolaire de disques purifiés et une millimolaire de TP avec des quantités croissantes de mal e. Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Mesurez ensuite la libération de phosphate inorganique à 660 nanomètres. Comparez la quantité de phosphate libérée à une courbe standard générée avec une solution étalon de phosphore. Les nanodisques sont purifiés par chromatographie par filtration sur gel.

Le chromatogramme montre que la majorité des disques reconstitués éluent en un seul pic, tandis que les disques constitués de lipides en excès éluent dans le volume vide, et comme une série de larges pics, la qualité de la préparation du disque est analysée plus en détail par des disques d’électrophorèse sur gel natif reconstitués avec une quantité limitée de lipides migrent comme une bande pointue sur le gel natif, tandis que celles reconstituées en présence d’un excès de lipides migrent sous forme de frottis. L’analyse par DLS montre que la population de disques est homogène avec un rayon moyen de 5,0 nanomètres. Sur la base de l’approximation DLS, les disques reconstitués ont un poids moléculaire apparent de 215 kilodaltons. Les échantillons reconstitués en présence de lipides en excès présentent des rayons largement distribués autour de 100 nanomètres, ce qui est typique des échantillons non homogènes.

L’activité du complexe MAL FTK two est évaluée en mesurant le taux d’hydrolyse d’un TP et l’affinité pour les partenaires en interaction tels que la protéine de liaison au maltose, le MAL E, la protéine de liaison au maltose. MAL E se lie avec une grande affinité au transporteur MAL FTK two en utilisant l’électrophorèse sur gel non dénaturante. Il est possible de détecter un complexe entre MAL E et MAL ftk deux, la stimulation de l’activité MAL KA TPA par MAL E est montrée ici en fonction de la concentration en MAL e.

La fabrication du nano disque est relativement simple, pourtant de petits écarts par rapport aux conditions optimales peuvent conduire à une agrégation irréversible des protéines Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de deux jours. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler l’importance de choisir un rapport lipidique protéique correct, car une quantité excessive de lipides entraînera la production de grandes particules ressemblant à des liposomes polydispersés. Il est crucial d’analyser soigneusement la qualité de la matière reconstituée à l’aide d’autres techniques que la filtration sur gel, telles que la spectroscopie de diffusion de la lumière, l’ultracentrifugation analytique, ou plus simplement l’électrophorèse sur gel natif.

N’oubliez pas que le type de phospholipide incorporant le disque ainsi que la protéine d’échafaudage membranaire peut contribuer à l’efficacité de la reconstitution. Après avoir regardé cette vidéo, nous espérons que vous avez bien compris comment générer des nanodisques solubles et homogènes contenant la protéine membranaire de votre choix. Bonne chance dans vos expériences.