Name: Une méthode étape par étape pour la reconstitution dun transporteur ABC dans des particules lipidiques Nanodisc (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Apprenez à reconstituer le transporteur ABC MalFGK2 dans des nanodiscs lipidiques pour étudier les protéines membranaires en solution aqueuse. Cette méthode permet d'analyser la fonction et les interactions des transporteurs.

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Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut canadien de recherche en santé. SCC a été financé par une bourse de recherche postdoctorale en sciences naturelles et en génie du Canada. FD est une chaire de recherche du Canada.

<html> Processus de reconstitution globale Le processus de reconstitution commence par mélanger la protéine d&#39;échafaudage membranaire (MSP) avec le complexe purifié MalFGK 2 en présence d&#39;un détergent-solubilisées phospholipides. L&#39;étape est suivie de l&#39;élimination lente de la lessive par un matériau adsorbant en polystyrène appelé Bio-Beads ou Amberlite (figure 1). Le processus d&#39;auto-assemblage se produit probablement en raison des interactions entre les phospholipides apolaires hydrophobes, le 2 MalFGK complexes et la surface de la protéine MSP amphipathique. Le produit final est une particule discoïde composé de deux molécules d&#39;emballage MSP à travers le MalFGK complexe 2. Les particules sont séparées des produits d&#39;addition et d&#39;agrégats par ultra-centrifugation analytique et chromatographie d&#39;exclusion stérique. Les particules sont caractérisées par une électrophorèse sur gel natif et dynamique spectroscopie de diffusion de lumière. titre &quot;&gt; 1. Préparation de la membrane des protéines d&#39;échafaudage, MSP <ol><li> Le son MSP-marqué (version MSP1D1 1) est produit à partir du plasmide dans E. pMSP1D1 coli BL21 (DE3) induite à DO 600 ~ 0,5 avec 0,5 mM d&#39;isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside pendant 3 heures à 37 ° C. </li><li> Les cellules sont récoltées par centrifugation à 5000 xg pendant 10 min à 4 ° C et remises en suspension dans TSG10 tampon contenant 100 uM fluorure de phénylméthanesulfonyle. </li><li> Les cellules sont lysées avec une presse française (3x) à 8.000 livres par pouce carré et l&#39;insoluble est éliminé par centrifugation à 5000 xg pendant 10 min à 4 ° C. La fraction soluble contenant la MSP est isolé par ultracentrifugation à 125.000 g pendant 45 min. </li><li> Le MSP est purifié par chromatographie de chélation nickel en utilisant ~ 1,5 ml Ni Sepharose HP TSG10 tampon. Contaminants sont éliminés par lavage avec TSG10 tampon contenant 50 mM d&#39;imidazole. Le MSP est éluée avec un tampon contenant TSG10 600 mMimidazole. La protéine purifiée est dialysée dans un tampon TSG10 et stocké dans -70 ° C à une concentration en protéine de ~ 10-15 mg / ml. </li></ol> 2. Préparation de la MalFGK 2 Complexe <ol><li> Le 2 MalFGK complexe, sa-marquées à l&#39;extrémité C-terminale de MalK, est exprimée à partir du plasmide pBAD22-FGK dans E. coli BL21 (DE3) et induit à DO 600 ~ 0,5 avec 0,2% de L-arabinose pendant 3 heures à 37 ° C. </li><li> Suite à la lyse des cellules et centrifugation comme dans l&#39;étape 1,3, le culot est remis en suspension dans la membrane TSG20 tampon à une concentration finale de 5 mg / ml. Le matériau est solubilisé à 1% p / v de n-dodécyl-β-maltopyranoside (DDM) pendant 3 heures à 4 ° C sous agitation douce. </li><li> L&#39;insoluble est éliminé par ultra-centrifugation comme à l&#39;étape 1.3 et le surnageant contenant le solubilisée 2 MalFGK complexe est recueilli et purifié comme à l&#39;étape 1,4, mais sans dialyse. </li><li> Further purification est réalisée par chromatographie par filtration sur gel dans un tampon TSGD sur une colonne Superdex 200 HR 10/300 de colonne à un débit de 0,5 ml / min. </li></ol> 3. Préparation des phospholipides <ol><li> Un E. coli lipidique totale extraire dissous dans du chloroforme est séparée en 1.000 nmol aliquotes dans des tubes à centrifuger de vis d&#39;assemblage. Le solvant est évaporé sous un léger courant d&#39;azote et séché encore pendant une nuit dans un dessiccateur sous vide. </li><li> Le film lipidique est dissoute dans un tampon TS à une concentration de 5 nM final et vortexé vigoureusement et ultrasons. Les lipides dissous apparaîtra légèrement opaque en raison de leur insolubilité générale dans le tampon TS aqueuse, mais ils doivent rester en suspension. DDM est ajouté à une concentration finale de 0,5% (~ 10 mM), à laquelle la solution devient claire. </li><li> Le mélange de lipides est placé dans un bain d&#39;eau et d&#39;impulsions ultrasons pendant 5 heures à ~ 5 sec. Le mélange de lipides est stocké à 4 ° C pendant un maximum de 1 week. </li></ol> 4. Préparation de Bio-Beads <ol><li> Environ 10-15 ml (volume sec) Bio-Beads est placé dans un tube de 50 ml. </li><li> Les perles sont lavées successivement avec 50 ml de méthanol à 100%, éthanol à 95%, milliQ H 2 O, et enfin tampon TS (deux fois). </li><li> Les billes lavées sont conservés à 4 ° C dans 10 ml de tampon ~ TS. </li></ol> 5. Reconstitution Nanodisc <ol><li> Le MSP est dilué dans du tampon TSGD à la concentration finale d&#39;environ 7 mg / ml (~ 0,3 mM). </li><li> ~ 2 nmol de 2 purifié MalFGK complexe sont mélangés à une protéine: PVC: lipide rapport 1:3:60 ou dans un tampon TSGD 1:3:400. La concentration finale est de 6 uM MalFGK 2, 18 uM MSP et les lipides pM 360 (1:3:60) ou 2,4 mM de lipides (1:3:400). Le volume final est de 300 ul. La concentration finale est DDM 0,08% (~ 1,6 mM). La concentration finale en glycérol dépend de la quantité de lipide ajouté mais reste autour de 5-10% v / v </li&gt; <li> ~ 50 pi de Bio-perle suspension est ajouté dans le tube et le mélange est incubé pendant une nuit sur une table à bascule à 4 ° C. </li><li> Les billes sont sédimentées par gravité et la solution est introduit à la pipette à travers une pointe étroite à éviter autant Bio-Beads que possible. </li><li> Gros précipités sont éliminés par ultra-centrifugation à 100.000 xg pendant 20 min. Les disques sont purifiées par chromatographie par filtration sur gel comme à l&#39;étape de 2,4 TSG10 tampon. Les fractions contenant les disques sont mis en commun et une partie aliquote doit être réinjecté dans la colonne de filtration sur gel même de vérifier la stabilité de la préparation. </li><li> Les disques purifiés peuvent stocké à -70 ° C pendant une période de temps prolongée. Après le dégel de la glace, les disques doivent être soumis à l&#39;ultra-centrifugation comme à l&#39;étape 5.5 à retirer potentiel précipités. Une aliquote doit être analysé par chromatographie de filtration sur gel afin de s&#39;assurer que l&#39;agrégation ou une précipitation importante n&#39;a pas eu lieu lors de la décongélationprocessus. </li></ol> 6. Électrophorèse sur gel natif <ol><li> 1 uM de NANODISQUES (~ 0,2 mg / ml) sont analysés par PAGE native 6, 7 (Tris-HCl pH 8,8, 4-12%) pour évaluer la qualité de la reconstitution (figure 3A). </li><li> La liaison de l&#39;Homme (1 uM) à la 2-complexe MalFGK reconstitué dans NANODISQUES est également évalué en natif-PAGE (figure 3A). </li><li> Après électrophorèse, le gel est coloré au bleu de Coomassie pendant 10 min, et décolorés pendant ~ 1 heure. </li></ol> 7. Diffusion de la lumière dynamique (DLS) <ol><li> NANODISQUES sont purifiées par chromatographie par filtration sur gel comme dans l&#39;étape 2,4 à l&#39;aide d&#39;un tampon TSG10 Superdex 200 HR 10/300 de colonne à un débit de 0,1 ml / min. Les fractions contenant NANODISQUES sont réunies et concentrées à environ 10 mg / ml avec un filtre Amicon centrifuge. </li><li> L&#39;échantillon est filtré deux fois (0,22 um filtre) avant l&#39;analyse par DLS utilisantun DynaPro nanostar instrument (Wyatt Technology) dans un volume intérieur 1 pl cuvette en quartz. Les données s&#39;effectue à l&#39;aide du logiciel DYNAMIQUE (Wyatt Technology) pour estimer le diamètre et le poids moléculaire des particules. </li></ol> 8. Mesures ATPase <ol><li> L&#39;activité ATPase de MalFGK 2-reconstituées NANODISQUES est déterminée en utilisant un dosage colorimétrique 8. </li><li> 1 uM de disques purifiés et 1 mM d&#39;ATP sont mélangés avec des quantités croissantes de MalE et incubées à 37 ° C pendant 20 minutes. La libération de phosphate inorganique est mesurée à 660 nm. </li><li> La quantité de phosphate libéré est comparée à une courbe d&#39;étalonnage générée avec une solution standard de phosphore. </li></ol> 9. Les résultats représentatifs Les NANODISQUES sont purifiés par chromatographie de filtration sur gel (Figure 2A, à gauche). Le chromatogramme montre que la majorité de la reconstitution dCSI (trace noire) éluer forme d&#39;un pic unique, tandis que les disques à base de lipides en excès (rouge trace) éluent dans le volume de vide et comme une série de pics larges. La qualité des NANODISQUES est ensuite analysée par électrophorèse sur gel natif et dynamique spectroscopie diffusion de la lumière (DLS). Disques correctement reconstitué migrer comme une bande nette sur le gel alors que ceux reconstitué en présence d&#39;un excès de lipides comme un test de migration (figure 2A, à droite). Analyse par DLS montre que la population est homogène disque avec un diamètre moyen de 11,4 nm (Figure 2B). Les disques reconstituées ont un poids moléculaire apparent de 215 kDa sur la base de l&#39;approximation DLS. Les échantillons reconstitués en présence d&#39;excès de lipides affichage largement distribué rayons autour de 100 nm, ce qui est typique pour les échantillons non homogènes. La qualité de la MalFGK complexe 2 est évaluée par électrophorèse sur gel natif et son activité ATPase parmesures (figure 3). Le mâle protéine liant le maltose se lie avec une haute affinité pour le transporteur 2 MalFGK 9, 10. Utilisation non électrophorèse sur gel dénaturant, il est possible de détecter un complexe entre l&#39;homme et MalFGK 2 (figure 3A). La stimulation de l&#39;activité ATPase MalK 2 par mâle est montré sur la figure 3B. <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Organigramme type pour le protocole de reconstitution. <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Contrôle de la qualité de la préparation nanodisc. A. Analyse par filtration sur gel (Superdex 200 HR 10/300 colonnes) des NANODISQUES reconstitué à lipide faible (03/01/60; trace noire) ou le taux de lipides élevé (1/3/400; trace rouge). Électrophorèse sur gel natif de la préparation même disque. Molmarqueurs de poids ecular à kDa sont indiquées. B. Analyse dynamique diffusion de la lumière de la préparation même disque. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3910/3910fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. L&#39;analyse de la MalFGK 2-nanodisc particules. A. L&#39;analyse de retard sur gel de MalE incubés avec des quantités croissantes de MalFGK 2-nanodisc particules. B. ATPase de la MalFGK 2-nanodisc particules en fonction de la concentration de sexe masculin.

<ol><li>Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).</li>
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<li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochromes+P450+in+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytochromes P450 in Nanodiscs.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).</li>
<li>Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+and+SILAC-based+mass+spectrometry+to+identify+a+membrane+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome.</a> J. Proteome Res. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous décrivons une procédure simple pour la reconstitution du transporteur maltose en NANODISQUES. Le transporteur est ATPase active et l&#39;interaction avec le mâle partenaire de liaison soluble peut être recréé (figure 3). La reconstitution réussie du transporteur en NANODISQUES ouvrir la voie à l&#39;analyse biophysique et biochimique supplémentaire. D&#39;un intérêt particulier sera l&#39;analyse systématique de l&#39;ATPase MalK et de l&#39;activité de transport du maltose dans du détergent, des l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 50K filtre centrifuge </td><td> Millipore </td><td> UFC805008 </td><td> Suivre le protocole du fabricant pour une utilisation correcte </td></tr><tr><td> Bio-Beads SM-2 Adsorbant </td><td> Bio-Rad </td><td> 152-3920 </td><td></td></tr><tr><td> E. coli lipides totaux </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 100500C </td><td> Dissous dans du chloroforme, gérer comme il convient pour un solvant organique </td></tr><tr><td> Ni Sepharose HP résine </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5268-01 </td><td></td></tr><tr><td> Solution étalon de phosphore </td><td>Sigma-Aldrich </td><td> P3869 </td><td></td></tr><tr><td> pMSP1D1 </td><td> Addgene </td><td> 20061 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR 10/300 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau I. réactifs spécifiques. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Composition </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> DDM actions </td><td> 10% v / v DDM </td><td> Remettre en suspension dans l&#39;eau milliQ et conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> MalFGK 2 stock </td><td> 1-2 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 NaCl 100 mM 10% v / v de glycérol 0,03% p / v DDM </td><td> Conserver à -70 ° C après purification </td></tr><tr><td> MSP actions </td><td> 10-15 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 NaCl 100 mM 10% v / v de glycérol </td><td> Conserver à -70 ° C après purification en aliquotes de 1 ml et &lt;éviter de trop cycles gel / dégel </td></tr><tr><td> Actions phospholipides </td><td> 5 nM E. coli en lipides totaux 0,5% p / v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM de NaCl </td><td> Conserver à 4 ° C pendant 1 semaine </td></tr><tr><td> TS tampon </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM de NaCl </td><td> Stocker à 4 ° C </td></tr><tr><td> TSG10 tampon </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 NaCl 100 mM 10% v / v de glycérol </td><td> Stocker à 4 ° C </td></tr><tr><td> TSG20 tampon </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH8 NaCl 100 mM 20% v / v de glycérol </td><td> Stocker à 4 ° C </td></tr><tr><td> Tampon TSGD </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 NaCl 100 mM 10% v / v de glycérol 0,03% p / v DDM </td><td> Conserver à 4 ° C et ajouter DDM juste avant l&#39;utilisation </td></tr><tr><td colspan="3"> Tableau II. Solution recettes. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

une méthode étape par étape pour la reconstitution d&#39;un transporteur abc dans des particules lipidiques nanodisc

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Le nanodisc est une particule en forme de disque (~ 10-12 nm grande) que les protéines membranaires piège dans une petite parcelle de bicouche phospholipidique. Le nanodisc est une option particulièrement intéressante pour l&#39;étude des protéines membranaires, en particulier dans le contexte de interactions ligand-récepteur. Le procédé mis au point par Sligar et ses collaborateurs est basée sur les propriétés amphipathiques d&#39;une ingénierie très une hélice protéine extraite de l&#39;échafaudage apolipoprotéines A1. Les faces hydrophobes de la protéine d&#39;échafaudage interagir avec les acyles gras des chaînes latérales de la bicouche lipidique, alors que les régions polaires face à l&#39;environnement aqueux. L&#39;analyse des protéines membranaires ont NANODISQUES avantages significatifs par rapport liposome, car les particules sont petites, homogène et soluble dans l&#39;eau. En outre, les méthodes biochimiques et biophysiques normalement réservés à des protéines solubles peuvent être appliqués, et de part et d&#39;autre de la membrane. Dans ce protocole visuelle, nous présentons une reconstitution étape par étape, d&#39;un caractère bientérisée transporteur ABC bactérien, le mâle-MalFGK complexe 2. La formation du disque est un processus d&#39;auto-assemblage qui dépend des interactions hydrophobes qui ont lieu au cours de l&#39;élimination progressive du détergent. Nous décrivons les étapes essentielles et nous soulignons l&#39;importance de choisir un bon protéine-lipide rapport afin de limiter la formation d&#39;agrégats et les grands polydisperses liposomes comme des particules. Contrôle qualité simples telles que la chromatographie de filtration sur gel, l&#39;électrophorèse sur gel natif et dynamique spectroscopie de diffusion de lumière en sorte que les disques ont été correctement reconstitué.

NANODISQUES sont de petites particules discoïdes qui incorporent des protéines membranaires dans un petit lopin de bicouche phospholipidique. Nous fournir un protocole visuelle montre que l&#39;incorporation étape par étape du transporteur MalFGK2 dans un disque.

Une méthode étape par étape pour la reconstitution d&#39;un transporteur ABC dans des particules lipidiques Nanodisc

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

L'objectif général de cette procédure est d'incorporer un transporteur de type A, b, C. Dans ce cas précis, il s'agit du transporteur de maltose MalFGK₂ dans des particules nanodiscs membranaires solubles. Cette incorporation est réalisée en mélangeant d'abord la protéine d'échafaudage membranaire MSP avec le transporteur et la quantité appropriée de lipides dans des micelles de détergent.La deuxième étape consiste à ajouter des billes de polystyrène et à agiter doucement le mélange pendant toute une nuit; le détergent est progressivement absorbé sur les billes, permettant ainsi la formation des particules de nanodisques. Ensuite, les billes sont éliminées par sédimentation. La dernière étape consiste à séparer les disques correctement formés des agrégats et des protéines de structure non assemblées par chromatographie de filtration sur gel.Enfin, la qualité des disques est évaluée par électrophorèse sur gel natif ou par spectroscopie de diffusion de la lumière. Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes, comme les liposomes, est que les protéines membranaires et les disques sont parfaitement solubles en solution aqueuse. De plus, les domaines protéiqu

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Procédures pour les reconstitution complète d'un canal de de potassium tension-à déchenchements périodiques prototype dans des membranes de lipides sont décrits. Les canaux reconstitués sont adaptés à des dosages biochimiques, les enregistrements électriques, le dépistage du ligand et des études cristallographiques d'électrons. Ces méthodes peuvent avoir des applications générales aux études structurales et fonctionnelles d'autres protéines membranaires.

Reconstitution d&#39;un canal Kv dans les membranes lipidiques des études structurales et fonctionnelles

Bicouches lipidiques supportées et des particules de la membrane sont des systèmes physiques avantageuses qui peuvent rapprocher les propriétés des membranes des cellules et être incorporés dans une variété de stratégies d'analyse. Nous démontrons ici un procédé pour préparer des microréseaux composées de bicouches lipidiques supportées revêtu de SiO 2, des perles ou des particules des vésicules de phospholipides membranaires naturelles.

Formation de biomembrane puces à ADN avec une méthode Assemblée basée à raclette

De nombreuses protéines remplissent leur fonction lorsqu’elles sont attachées à des surfaces membranaires. La liaison des protéines extrinsèques sur les membranes des nanodisques peut être imagée indirectement par microscopie électronique à transmission. Nous montrons que l’empilement caractéristique (rouleau) des nanodisques induit par la coloration négative phosphotungstate de sodium est empêché par la liaison de protéines extrinsèques.

Méthode pour visualiser et analyser membrane protéines interagissant par microscopie électronique à transmission

Solide-soutenus, sans protéines, double membranes bicouches phospholipidiques (DALG) peuvent être transformés en réseaux de nanotube de lipides complexes et dynamiques et peuvent servir de modèles 2D de bas en haut du réticulum endoplasmique.

Formation spontanée et le réarrangement des réseaux de Nanotube lipidique artificielle comme un modèle de bas en haut pour le réticulum endoplasmique

La fusion mitochondriale est une réaction homéostatique importante sous-jacente à la dynamique mitochondriale. Décrit ici est un système de reconstitution in vitro pour étudier la fusion mitochondriale de membrane interne qui peut résoudre l’attachement de membrane, l’amarrage, l’hémifusion, et l’ouverture de pore. La polyvalence de cette approche dans l’exploration des systèmes de membrane cellulaire est discutée.

Une plate-forme membranaire modèle pour reconstituer la dynamique memitochondriale de membrane

Ce protocole décrit la formation de bicouches lipidiques soutenues et l’ajout de filaments cytosquelettiques et de protéines motrices pour étudier la dynamique de réseaux cytosquelettiques reconstitués et attachés à la membrane à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Reconstitution de cortex minimembranaires d’actine sur des bicouches lipidiques soutenues

Dans ce manuscrit, nous démontrons les techniques expérimentales pour encapsuler le cytosquelette F-actine dans des vésicules lipidiques unilamellaires géantes (également appelées liposomes), et la méthode pour former une couche de F-actine biomitant le cortex au niveau du feuillet interne de la membrane liposomique.

In vitro Reconstitution du cytosquelette d’actine à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes

La reconstitution sans cellules a été un outil clé pour comprendre l’assemblage du cytosquelette, et les travaux de la dernière décennie ont établi des approches pour étudier la dynamique des septines dans des systèmes minimaux. Voici trois méthodes complémentaires pour observer l’assemblage de septines dans différents contextes membranaires : les bicouches planes, les supports sphériques et les supports de tiges.

Reconstitution de l’assemblage de septines au niveau des membranes pour étudier les propriétés et les fonctions biophysiques

Ce protocole décrit une configuration pour la cristallisation du transporteur de stérols ABCG5/G8. ABCG5/G8 est reconstitué en bicelles pour la cristallisation en gouttes suspendues. Le protocole ne nécessite pas de matériaux ou de substrats spécialisés, ce qui le rend accessible et facile à adapter dans n’importe quel laboratoire pour déterminer la structure de la protéine par cristallographie aux rayons X.

Cristallisation ABCG5/G8 dans un environnement bicellaire lipidique pour la cristallographie aux rayons X

Nous présentons un protocole pour reconstituer les protéines membranaires et encapsuler des enzymes et d’autres composants solubles dans l’eau dans des vésicules lipidiques de taille submicrométrique et micrométrique.

Construction de réseaux métaboliques hors équilibre dans des vésicules de taille nanométrique et micrométrique

Cette étude décrit la procédure de reconstitution du canal K+ sensible aux acides lié à la protéine membranaire TWIK (Task2) en nanodisques. L’assemblage réussi a été confirmé par la cryomicroscopie électron à particule unique, qui a permis de fournir des moyennes de classe bidimensionnelles bien définies.

Une technique pour stabiliser les protéines membranaires dans les nanodisques

Apprenez à reconstituer le transporteur ABC MalFGK2 dans des nanodiscs lipidiques pour étudier les protéines membranaires en solution aqueuse. Cette méthode permet d'analyser la fonction et les interactions des transporteurs.

Une méthode étape par étape pour la reconstitution d'un transporteur ABC dans des particules lipidiques Nanodisc

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