Marquage fluorescent rétrograde Permet ciblée extracellulaire seule unité d'enregistrement de neurones identifiés In vivo

L’objectif global de cette procédure est d’enregistrer les réponses unitaires uniques in vivo d’une population identifiée de neurones dans un système modèle non génétique. Ceci est accompli en effectuant d’abord une craniotomie pour exposer la région cérébrale d’intérêt. La deuxième étape consiste à utiliser des fils de tungstène pour placer le colorant fluorescent dans la région vers laquelle les neurones cibles se projettent.

Ensuite, le colorant est transporté rétrogradement, ce qui entraîne un marquage sélectif des neurones de projection. La dernière étape consiste à enregistrer à partir de l’axone marqué du neurone de projection individuel. En fin de compte, des enregistrements extracellulaires unitaires sont utilisés pour montrer comment les neurones sensoriels centraux d’un circuit intact réagissent à la stimulation sensorielle in evo.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la façon dont les circuits neuronaux détectent les différences de moins d’une milliseconde dans la synchronisation des entrées synaptiques. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est la possibilité de cibler des neurones individuels ou même des axones et des systèmes non génétiquement accessibles. Les poissons électriques hebdomadaires utilisent des signaux électriques pour la communication et la navigation.

Ils distinguent les signaux de différents poissons en utilisant des différences de moins d’une milliseconde dans le timing des entrées synaptiques. Nous avons demandé comment les neurones comparateurs de temps présumés dans leur circuit électrosensoriel sont capables de détecter de si petites différences de temps. Mais cette technique peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que les voies sensorielles visuelles et auditives.

Il est particulièrement difficile de liquider à partir de ces cellules en raison de la petite taille dense de l’emboîtage dans les tissus environnants et des terminaisons présynaptiques qui recouvrent la majeure partie du ventre cellulaire Injection de colorant intracellulaire lors d’un enregistrement de cellule entière. Des étiquettes in vitro sur une seule cellule pour guider les enregistrements ciblés de cet axone. De même, le transport rétrograde après l’injection de colorant extracellulaire fournit un moyen de marquer sélectivement les neurones de projection dans les régions superficielles du cerveau.

Cela peut être utilisé pour fournir un guidage visuel pour les enregistrements unitaires in vivo. Pour préparer l’aiguille codée D, affûtez d’abord électrolytiquement un fil de tungstène de 160 micromètres de diamètre jusqu’au diamètre final de la pointe de l’aiguille de cinq à 50 micromètres. Puis, la nuit précédant l’expérience, codez la pointe de l’aiguille avec une solution de deux millimolaires de 10 000 dextran de poids moléculaire conjuguée au colorant de sol Alexa pour induire une anesthésie générale.

Placez le poisson dans l’eau du réservoir avec la solution MS 2 22 à 300 milligrammes par litre, immobilisez et réduisez électriquement le poisson au silence en injectant 100 microlitres de fléau à trois milligrammes par millilitre dans la musculature dorsale du corps. Ensuite, remplissez la chambre d’enregistrement avec de l’eau du réservoir et placez le poisson côté ventral vers le bas sur la plate-forme au centre de la chambre. Ensuite, délivrez la solution aérée MS 2 22 à 100 milligrammes par litre en un à deux millilitres par minute en plaçant une pointe de pipette dans sa bouche.

Ensuite, stabilisez le poisson avec des tiges fixes et de la cire des deux côtés du corps. Surveillez l’état de santé du poisson en vérifiant le flux sanguin continu dans les vaisseaux oculaires et une couleur corporelle normale. Faites ensuite pivoter la plate-forme le long de l’axe vertical.

Ajustez une extrémité de la plate-forme de sorte qu’un côté de la surface dorsale de la tête du poisson soit exposé au-dessus de l’eau tandis que le reste du corps du poisson reste immergé. Placez un petit morceau de lingette Kim sur toute partie non immergée de la peau pour éviter le dessèchement. Dans cette procédure, appliquez 0,4 % de lidocaïne sur la surface exposée de la tête à l’aide d’un coton-tige.

Ensuite, utilisez une lame de scalpel pour couper un morceau rectangulaire de tissu cutané d’environ trois millimètres sur cinq millimètres pour un poisson de 6,2 centimètres. Le bord latéral du rectangle doit s’aligner avec le centre de l’œil. Le bord antérieur du rectangle doit être juste en arrière de l’œil, et le bord médian du rectangle doit être juste latéral à la ligne médiane.

Par la suite, retirez le rectangle à l’aide d’une paire de pinces. Coupez un carré supplémentaire de 2,5 millimètres à l’avant pour exposer le crâne. Nettoyez complètement la surface exposée du crâne en grattant tout excès de tissu à l’aide de la lame du scalpel.

Ensuite, séchez complètement la surface avec une lingette Kim et de l’air pulsé. Ensuite, collez un poteau métallique sur la région médiale antérieure exposée du crâne avec de la super colle. Attendez que la colle soit complètement sèche.

Utilisez une perceuse dentaire avec une pointe en carbure de broyeur à boulets de 0,5 millimètre de diamètre pour dessiner un rectangle d’environ deux millimètres sur quatre millimètres sur le crâne pour un poisson de 6,2 centimètres. Après cela, coupez le périmètre du rectangle avec le scalpel et la pince. Ensuite, retirez le crâne.

Pour exposer le cerveau, coupez à la fois la dure-mère pigmentée et la pie-mère claire à l’aide d’une paire de ciseaux à ressort ou d’une aiguille. Retirez ensuite les parties coupées à l’aide d’une pince pour exposer le noyau extra latéral antérieur et le noyau extra latéral postérieur. Positionnez maintenant un manipulateur avec une aiguille recouverte d’un D préparée plus tôt au-dessus de la région cible contenant les axones d’intérêt.

Le noyau extra latéral postérieur dans notre cas insère rapidement l’aiguille à environ 25 micromètres dans le tissu. Une fois que le colorant s’est diffusé pendant 15 à 30 secondes, rétractez l’aiguille. Répétez l’opération avec des aiguilles neuves supplémentaires au besoin.

Placez chacun d’eux à un endroit différent afin que le colorant soit réparti dans toute la région cible. Rincez ensuite l’excès de colorant de la cavité avec la solution de sonnerie de Hickman et attendez au moins deux heures pour l’absorption et le transport du colorant. Pour visualiser les axones d’intérêt, placez la chambre d’enregistrement avec le poisson sous l’objectif d’un microscope à épifluorescence à platine fixe vertical.

Changez la solution de respiration pour de l’eau douce du réservoir et maintenez le même débit. Placez ensuite une extrémité du fil de terre dans la cavité cérébrale exposée et connectez l’autre extrémité au sol de la tête d’enregistrement. Ensuite, placez une paire d’électrodes d’enregistrement à côté de la base de la queue.

Connectez ensuite les électrodes à un amplificateur différentiel et à un appareil d’enregistrement. Afin de surveiller la commande de décharge d’organe électrique ou EODC, préparez un croquis à l’échelle de la région du cerveau observée à faible grossissement, y compris les principaux vaisseaux sanguins comme points de repère pour identifier l’emplacement exact des axones marqués. Pour confirmer d’abord le placement D, visualisez l’ensemble du tissu avec un éclairage en fond clair pour l’orientation.

Ensuite, visualisez-le avec un éclairage fluorescent. Le noyau extralatéral postérieur doit présenter un marquage diffus. Après cela, sous un grossissement élevé, localisez le noyau extralatéral antérieur avec les vaisseaux comme points de repère.

Éclairez-le avec une lumière fluorescente tout en recherchant un axone étiqueté près de la surface, en utilisant un diamètre extérieur d’un millimètre et un diamètre intérieur de 0,58 millimètre. Verre capillaire en silicate Bo avec filament. Tirez une électrode d’enregistrement avec une tige étroite de cinq millimètres de long et un diamètre de pointe d’environ un à 2,4 micromètres.

Remplissez l’électrode avec une solution de sonnerie de Hickman filtrée. La résistance finale de la pointe doit être comprise entre 16 et 155 méga ohms. Placez l’électrode dans un porte-électrode doté d’un orifice de pression.

Connectez-le à la scène de tête montée sur un manipulateur. Connectez ensuite l’étage de tête à un amplificateur. Un périphérique d’acquisition analogique-numérique non illustré connecte l’amplificateur à l’ordinateur.

Après cela, appliquez une pression positive de 30 millibars sur la ligne d’électrode. Avancez lentement l’électrode vers l’axone à partir de la surface du tissu. Comme l’électrode est proche de l’axone, la pression positive doit provoquer un mouvement léger mais perceptible de l’axone lorsque l’électrode est à côté de l’axone.

Enregistrez l’activité pendant la présentation des stimuli du test. Bien qu’un artefact électrique confirme l’enregistrement et la stimulation appropriés, il ne devrait pas y avoir de potentiels d’action. Relâchez la pression vers l’extérieur dans l’électrode et répétez la stimulation et l’enregistrement.

Ensuite, appliquez une légère aspiration qui fait passer l’axone dans l’électrode. Répétez la stimulation et l’enregistrement à nouveau. Maintenant, vous devriez voir des potentiels d’action en réponse aux stimulations.

Une fois que les potentiels d’action sont visibles, fermez la ligne de pression. Lorsque tous les enregistrements souhaités sont terminés, remettez l’eau du réservoir dans la solution de respiration avec MS 2 22 à cent milligrammes par litre pour vous assurer que le poisson est complètement anesthésié. Aucun EODC ne doit être détecté pendant au moins 10 minutes avant d’euthanasier le poisson.

Voici cinq exemples de traces montrant les potentiels d’action évoqués par un stimulus d’impulsion carrée transversale controlatérale controlatérale monophasique de 0,1 milliseconde à six millivolts par centimètre, et voici un graphique matriciel montrant les temps de pointe pendant 20 répétitions d’une fenêtre d’enregistrement de 75 millisecondes pour la même unité stimulée à des stimuli de fois zéro avec six millivolts par centimètre. La plage de durées est indiquée sur la droite. Voici une courbe d’accord de la durée d’un stimulus qui quantifie les réponses sous forme de pics par répétition de stimulus.

Une fois maîtrisés, l’intervention chirurgicale et l’injection de colorant montrées dans cette technique peuvent être effectuées en une heure si elles sont effectuées correctement, et les enregistrements peuvent être lancés deux à trois heures après l’injection de colorant. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de surveiller attentivement la santé de l’animal de laboratoire après cette procédure. D’autres méthodes, comme l’imagerie à deux photons, peuvent être effectuées afin d’enregistrer à partir de neurones dans des structures cérébrales encore plus profondes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étiqueter et d’enregistrer les réponses unitaires d’une population identifiée de neurones.