Marquage fluorescent rétrograde Permet ciblée extracellulaire seule unité d'enregistrement de neurones identifiés

L'objectif général de cette procédure est d'enregistrer in vivo les réponses unitaires individuelles provenant d'une population de neurones identifiée dans un système modèle non génétique. Cela est réalisé en réalisant d'abord une craniotomie afin d'exposer la région cérébrale d'intérêt. La deuxième étape consiste à utiliser des fils de tungstène pour déposer le colorant fluorescent dans la région vers laquelle projettent les neurones ciblés.

Ensuite, le colorant est transporté de façon rétrograde, entraînant une marquage sélectif des neurones projeteurs. La dernière étape consiste à enregistrer l'activité à partir de l'axone marqué du neurone projeteur individuel. En définitive, des enregistrements extracellulaires unitaires sont utilisés pour montrer comment les neurones sensoriels centraux, dans un circuit intact, répondent à une stimulation sensorielle in vivo.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la manière dont les circuits neurologiques détectent des différences de l'ordre du sous-millisecond entre les signaux synaptiques. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans sa capacité à cibler des neurones individuels, voire des axones, ainsi que des systèmes non accessibles par des approches génétiques. Les poissons électriques utilisent des signaux électriques pour communiquer et naviguer.

Ils distinguent les signaux provenant de différents poissons en utilisant des différences de l'ordre du sous-milliseconde dans le moment d'arrivée des entrées synaptiques. Nous nous sommes demandé comment les neurones comparateurs de temps présumés dans leur circuit électrosensoriel parviennent à détecter de si faibles différences temporelles. Toutefois, cette technique peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les voies sensorielles visuelles et auditives.

Il est particulièrement difficile de prélever du liquide à partir de ces cellules en raison de leur petite taille, du tissu environnant dense et des terminaisons présynaptiques qui recouvrent la majeure partie du corps cellulaire. L'injection intracellulaire de colorant pendant un enregistrement en mode tout-ouvert marque une cellule unique afin de guider des enregistrements ciblés à partir de cet axone. De même, le transport rétrograde après injection extracellulaire de colorant offre un moyen d'étiqueter sélectivement les neurones projeteurs situés dans les régions superficielles du cerveau.

Cela peut être utilisé pour fournir une aide visuelle lors d'enregistrements unitaires in vivo. Pour préparer l'aiguille codée D, aiguisez d'abord électrolytiquement un fil de tungstène de 160 micromètres de diamètre jusqu'à un diamètre final de l'extrémité de l'aiguille compris entre cinq et 50 micromètres. Ensuite, la nuit précédant l'expérience, marquez l'extrémité de l'aiguille avec une solution deux millimolaire de dextrane de poids moléculaire 10 000 conjugué à un colorant Alexa floor afin d'induire une anesthésie générale.

Placer le poisson dans l'eau du réservoir contenant une solution de MS 222 à 300 milligrammes par litre afin d'immobiliser et de silencer électriquement le poisson en injectant 100 microlitres de flail à trois milligrammes par millilitre dans la musculature dorsale. Ensuite, remplir la chambre d'enregistrement avec de l'eau du réservoir et placer le poisson sur le côté ventral vers le bas sur la plateforme située au centre de la chambre. Puis délivrer la solution de MS 222 aérée à 100 milligrammes par litre à raison d'un à deux millilitres par minute en insérant une pointe de pipette dans sa bouche.

Ensuite, stabiliser le poisson à l'aide de tiges fixées et de cire des deux côtés du corps. Surveiller l'état de santé du poisson en vérifiant la circulation sanguine continue dans les vaisseaux oculaires et la couleur normale du corps. Puis faire pivoter la plateforme autour de l'axe vertical.

Réglez une extrémité de la plateforme de manière à ce qu'un côté de la surface dorsale de la tête du poisson soit exposé au-dessus de l'eau, tandis que le reste du corps du poisson reste immergé. Placez un petit morceau de papier absorbant Kim sur toute partie de la peau non immergée afin d'éviter le dessèchement. Au cours de cette procédure, appliquez de la lidocaïne à 0,4 % sur la surface exposée de la tête à l'aide d'un coton-tige.

Ensuite, utilisez une lame de scalpel pour découper un morceau de tissu cutané de forme rectangulaire d’environ trois millimètres sur cinq millimètres pour un poisson de 6,2 centimètres. Le bord latéral du rectangle doit s’aligner sur le centre de l’œil. Le bord antérieur du rectangle doit se situer juste en arrière de l’œil, et le bord médial du rectangle doit être légèrement latéral par rapport à la ligne médiane.

Ensuite, retirez le rectangle à l'aide d'une pince. Découpez un carré supplémentaire de 2,5 millimètres à l'avant pour exposer le crâne. Nettoyez complètement la surface exposée du crâne en grattant tout tissu excédentaire à l'aide de la lame de scalpel.

Ensuite, séchez complètement la surface avec un essuie-tout Kim et de l'air forcé. Puis, collez un poteau métallique sur la région antérieure médiale du crâne exposée à l'aide de colle cyanoacrylate. Attendez jusqu'à ce que la colle soit complètement sèche.

Utilisez une fraise dentaire avec une pointe en carbure de forme sphérique de 0,5 millimètre de diamètre pour tracer un rectangle d’environ deux millimètres sur quatre millimètres sur le crâne d’un poisson de 6,2 centimètres. Ensuite, découpez le périmètre du rectangle à l’aide du scalpel et de la pince. Puis retirez délicatement le crâne.

Pour exposer le cerveau, sectionez à la fois la dure-mère pigmentée et la pie-mère transparente à l’aide d’une paire de ciseaux à ressort ou d’une aiguille. Ensuite, retirez les parties coupées à l’aide d’une pince pour exposer le noyau extra-latéral antérieur et le noyau extra-latéral postérieur. Placez maintenant un manipulateur muni d’une aiguille revêtue de D, préparée précédemment, au-dessus de la région cible contenant les axones d’intérêt.

Dans notre cas, le noyau postérieur externe latéral insère rapidement l'aiguille d'environ 25 micromètres dans le tissu. Après que le colorant a diffusé pendant 15 à 30 secondes, retirez l'aiguille. Répétez l'opération avec des aiguilles fraîches supplémentaires si nécessaire.

Placer chacun à un endroit différent afin que le colorant soit réparti dans toute la région ciblée. Rincer ensuite l'excès de colorant de la cavité à l'aide de la solution de Ringer de Hickman et attendre au moins deux heures pour l'absorption et le transport du colorant. Pour visualiser les axones d'intérêt, placer la chambre d'enregistrement contenant le poisson sous l'objectif d'un microscope à fluorescence épiscopique doté d'une platine fixe verticale.

Remplacer la solution de respiration par de l'eau de réservoir fraîche et maintenir le même débit. Ensuite, placer une extrémité du fil de masse dans la cavité cérébrale exposée et relier l'autre extrémité à la masse du support d'enregistrement. Puis, placer une paire d'électrodes d'enregistrement à côté de la base de la queue.

Ensuite, connectez les électrodes à un amplificateur différentiel et à un dispositif d'enregistrement. Afin de surveiller la commande de décharge de l'organe électrique (EODC), préparez un croquis à l'échelle de la région cérébrale observée en faible grossissement, incluant les principaux vaisseaux sanguins comme repères pour identifier l'emplacement exact des axones marqués. Pour confirmer d'abord le placement de D, observez tout le tissu en éclairage en champ clair afin de vous orienter.

Ensuite, observez-le en illumination fluorescente. Le noyau extra-latéral postérieur doit présenter une coloration diffuse. Puis, en fort grossissement, localisez le noyau extra-latéral antérieur en utilisant les vaisseaux comme repères.

Éclairez-le avec une lumière fluorescente tout en recherchant un axone marqué à proximité de la surface, en utilisant une pipette en verre capillaire en borosilicate d'un diamètre extérieur de un millimètre et d'un diamètre intérieur de 0,58 millimètre, avec filament. Tirez une électrode d'enregistrement présentant une tige étroite de cinq millimètres de longueur et un diamètre de pointe d'environ un à 2,4 micromètres.

Remplissez l'électrode avec une solution de Ringer filtrée de Hickman. La résistance finale de la pointe doit se situer entre 16 et 155 mégohms. Placez l'électrode dans un porte-électrode muni d'un orifice de pression.

Le connecter à la tête montée sur un manipulateur. Ensuite, relier la tête à un amplificateur. Un dispositif d'acquisition analogique-numérique, non représenté, relie l'amplificateur à l'ordinateur.

Ensuite, appliquez une pression positive de 30 millibars sur la ligne de l'électrode. Avancez lentement l'électrode vers l'axone à partir de la surface du tissu. Lorsque l'électrode est proche de l'axone, la pression positive doit provoquer un mouvement léger mais perceptible de l'axone tandis que l'électrode se trouve à côté de celui-ci.

Enregistrez l'activité pendant la présentation des stimuli de test. Bien qu'un artefact électrique confirme un enregistrement et une stimulation corrects, il ne devrait pas y avoir de potentiels d'action. Relâchez la pression vers l'extérieur exercée sur l'électrode et répétez la stimulation et l'enregistrement.

Appliquez ensuite une légère aspiration provoquant le déplacement de l'axone dans l'électrode. Répétez la stimulation et l'enregistrement. Vous devriez maintenant observer quelques potentiels d'action en réponse aux stimulations.

Une fois que les potentiels d'action sont visibles, fermez la ligne de pression. Lorsque tous les enregistrements souhaités sont terminés, remplacez l'eau du réservoir par la solution de respiration contenant MS 222 à une concentration de cent milligrammes par litre afin de garantir une anesthésie complète du poisson. Aucun EODC ne doit être détecté pendant au moins 10 minutes avant l'euthanasie du poisson.

Voici cinq tracés représentatifs montrant les potentiels d'action provoqués par un stimulus carré transverse monophasique, positif et controlatéral, d'une durée de 0,1 milliseconde et d'une intensité de six millivolts par centimètre, ainsi qu'une représentation en raster des temps de décharge observés lors de 20 répétitions d'une fenêtre d'enregistrement de 75 millisecondes pour la même unité stimulée aux instants zéro par des stimuli de six millivolts par centimètre. La gamme des durées est indiquée à droite. On observe ici une courbe de réglage de la durée du stimulus qui quantifie les réponses en nombre de décharges par répétition du stimulus.

Une fois maîtrisées, la chirurgie et l'injection de colorant présentées dans cette technique peuvent être réalisées en une heure si elles sont effectuées correctement, et les enregistrements peuvent commencer deux à trois heures après l'injection du colorant. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de surveiller attentivement l'état de santé de l'animal expérimental après cette intervention. D'autres méthodes, comme l'imagerie à deux photons, peuvent être réalisées afin d'enregistrer l'activité de neurones situés dans des structures cérébrales encore plus profondes.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étiqueter et d'enregistrer les réponses unitaires individuelles provenant d'une population identifiée de neurones.