Name: Mélangeurs microfluidiques pour étudier repliement des protéines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Découvrez la fabrication de mélangeurs microfluidiques pour étudier le repliement des protéines en quelques microsecondes. Cette méthode utilise la spectroscopie de fluorescence et le FRET pour analyser les réactions biochimiques rapides.

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Ce travail est soutenu par la National Science Fibr Foundation (NSF EF-0623664) et IDBR (NSF DBI-0754570). Ce travail a été partiellement financé par des fonds de la National Science Foundation Grant Fibr 0623664 administré par le Centre pour la biophotonique, une science NSF et de la technologie Center, géré par l&#39;Université de Californie, Davis, en vertu de l&#39;accord de coopération PHY 0120999. La recherche de Lisa Lapidus, Ph.D. est soutenu en partie par une bourse de carrière à l&#39;interface scientifique du Fonds Burroughs Welcome.

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<li>Chan, C. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submillisecond+protein+folding+kinetics+studied+by+ultrarapid+mixing%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Submillisecond protein folding kinetics studied by ultrarapid mixing.</a> PNAS. 94, 1779-1784 (1997).</li>
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<li>Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+cytochrome+c+initiated+by+submillisecond+mixing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Folding of cytochrome c initiated by submillisecond mixing.</a> Nature Structural Molecular Biology. 4, 44-50 (1997).</li>
<li>Knight, J. B., Vishwanath, A., Brody, J. P., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+focusing+on+a+silicon+chip%3A+Mixing+nanoliters+in+microseconds%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic focusing on a silicon chip: Mixing nanoliters in microseconds.</a> Physical Review Letters. 80, 3863-3866 (1998).</li>
<li>DeCamp, S. J., Naganathan, A. N., Waldauer, S. A., Bakajin, O., Lapidus, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Observation+of+Downhill+Folding+of+lambda-Repressor+in+a+Microfluidic+Mixer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Direct Observation of Downhill Folding of lambda-Repressor in a Microfluidic Mixer.</a> Biophysical Journal. 97, 1772-1777 (2009).</li>
<li>Waldauer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruggedness+in+the+folding+landscape+of+protein+L%5BTitle%5D)+AND+%22Hfsp+Journal%22%5BJournal%5D)">Ruggedness in the folding landscape of protein L.</a> Hfsp Journal. 2, 388-395 (2008).</li>
<li>Shastry, M. C. R., Roder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+barrier-limited+protein+folding+kinetics+on+the+microsecond+time+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence for barrier-limited protein folding kinetics on the microsecond time scale.</a> Nature Structural Biology. 5, 385-392 (1998).</li>
<li>Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapse+and+search+dynamics+of+apomyoglobin+folding+revealed+by+submillisecond+observations+of+alpha-helical+content+and+compactness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Collapse and search dynamics of apomyoglobin folding revealed by submillisecond observations of alpha-helical content and compactness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1171-1176 (2004).</li>
<li>Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+Multiple+Folding+Pathways+for+the+Villin+Headpiece+Subdomain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Evidence of Multiple Folding Pathways for the Villin Headpiece Subdomain.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 115, 12632-12637 (2011).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Mélange rapide a été un objectif de développement pour le champ du repliement des protéines pour de nombreuses années, car il est reconnu depuis longtemps que les processus moléculaires de biomolécules se produire sur des échelles de temps allant de picosecondes à quelques secondes. Classiques stopped-flow mélangeurs ont des temps morts de 1-5 ms, ce qui est principalement limitée par les turbulences. Turbulent mélangeurs à flux continu avec un temps de mélange de 30-300 ms ont été développés au cours des 15 dernières années par un petit nombre de groupes mais exigent généralement des débits élevés pour atteindre ces temps de mélange et donc d&#39;utiliser un grand nombre de l&#39;échantillon 6-8. Ce protocole décrit l&#39;utilisation de puces microfluidiques mélange pour obtenir une dilution rapide dans le régime d&#39;écoulement laminaire. Il ya de multiples avantages à travailler au sein de ce régime, mais un primaire est la possibilité de simuler l&#39;ensemble du processus de mélange avec une grande précision qui permet de modifier la réponse de mélange. T-mélangeurs développés par d&#39;autres groupes avec de simples geometries ont démontré un temps de mélange de 100-200 ms qui ont été principalement limités par la taille des canaux 9-10. Mettant à l&#39;échelle de la taille des canaux à 10 um chevalier de réduire le temps de mélange d&#39;environ 10 ms 11. Yao et Bakajin a montré que de petits changements dans la géométrie pourrait conduire à des améliorations significatives dans le temps de mélange 4. Toutefois, ce travail a montré que l&#39;accélération du mélange peut aussi conduire à un ralentissement des phases ainsi. La conception utilisée dans ce travail 12-13 est un compromis entre les deux meilleures designs de référence de 4 à minimiser le plus lent de décroissance exponentielle de la concentration en dénaturant et aussi pour rendre la fonction plus reproductible dans gravure DRIE. Il a eu une certaine controverse dans le domaine de la ultrarapide mélange sur la définition du temps de mélange. Il est important de reconnaître la différence entre &quot;temps de mélange» et «temps mort». Le temps mort est définie dans un mélangeur turbulente que le temps pendant lequel une MESUREt ne peut être faite et peut en fait être beaucoup plus long que le temps réel de mélange. Il est généralement déterminée en faisant plusieurs mesures d&#39;une réaction pseudo-premier ordre bimoléculaire (tels que trempe de fluorescence du tryptophane par N bromosuccinate) à différentes concentrations. Des caries observées exponentielles sont montés à converger à une valeur unique supposé être t = 0 s et le temps entre ce point et le premier point de mesure est le temps mort. Pour les mélangeurs à flux laminaire, des mesures peuvent être prises durant le processus de mélange de sorte qu&#39;il n&#39;ya pas de temps mort, seulement un temps de mélange. Le temps de mélange est tout simplement le temps de combiner deux solutions jusqu&#39;à ce que l&#39;uniformité suffisant est atteint. Nous avons défini précédemment le temps de mélange d&#39;un temps de 90/10, le temps de la concentration de dénaturant pour diminuer de 90% à 10% de la valeur sans mélange. Toutefois, la forme de la courbe de mélange n&#39;est pas parfaitement symétrique avec la queue de la désintégration ayant un petit composant exponentielle. En outre, le repliement des protéines a unefortement non-linéaire de dépendance sur la concentration de dénaturant de telle sorte que pliage peut souvent commencer même si le dénaturant est seulement réduit par deux fois. C&#39;est pourquoi nous avons plus récemment défini le temps de mélange que le temps de réduire la concentration de dénaturant de 80%. Certes, d&#39;autres définitions peuvent être utilisées en fonction des exigences de l&#39;expérience. L&#39;utilisation de cette table de mixage pour étudier le repliement des protéines a toujours révélé des résultats surprenants. Pliage de cytochrome c et apomyoglobine ont longtemps été étudiée pour avoir de multiples étapes de pliage et les premiers résultats avec des mélangeurs à flux continu ont montré l&#39;effondrement de se produire sur l&#39;échelle de temps ~ 100 ms 10,14-15. Nos mesures ont montré avec cette table de mixage qu&#39;il y ait au moins 2 étapes sur cette échelle de temps, un très rapide, probablement non spécifique, l&#39;effondrement (tel que mesuré par fluorescence Trp décalage spectral) dans le temps de mélange du mélangeur suivie par une phase plus lente (comme mesurée par la trempe du total des émissions de Trp) qui est probablement le fla formation de la structure native IRST 5. Nous avons également observé un processus 50 ms dans le domaine B1 de la protéine L, renversant l&#39;interprétation conventionnelle que cette protéine est un dossier 2-Etat 13. Un avantage de cette table de mixage rapide, c&#39;est qu&#39;il permet de sonder le repliement de protéines les plus rapides pliantes qui ont habituellement seulement été mesurable par ordre de la nanoseconde T-saut instruments. T-saut nécessite généralement l&#39;observation de pliage / dépliage détente à proximité de la température de fusion de la protéine et donc ne suit jamais le pliage de la population dans son ensemble. Avec cette table de mixage, nous avons examiné le pliage de la γ-répresseur (λ 6-86) à la fois les émissions totales Trp et décalage spectral et ont trouvé des preuves que la protéine n&#39;a pas de barrière à plier sous de fortes conditions de pliage qui n&#39;étaient pas accessibles à T précédentes -sauter des mesures 12. Enfin, nous avons mesuré le repliement de la coiffe villine HP-35, l&#39;un des til le plus rapide des dossiers encore mesuré et a constaté que le taux de pliage mesuré après le mélange est de ~ 5 fois plus lent que mesurée par T-bond dans les mêmes conditions 16. Ceci suggère que la cinétique de pliage dépend des conditions de départ, le renversement d&#39;une hypothèse majeure dans le domaine.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> AZ P4110 Photoresist </td><td> AZ Electronic Materials </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AZ 400 K Developer </td><td> AZ Electronic Materials </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PRS Baker, 2000 décapant résine photosensible </td><td> Performance Materials Avantor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AquaBond </td><td> Technologies AquaBond </td><td> AquaBond 55 </td><td></td></tr><tr><td> 500 plaquette de recouvrement pm </td><td> CAPTEUR services de préparation </td><td></td><td> Ø: 100 mm ± 0,5 mm Épaisseur: 0,5 mm ± 0,025 mm Tolérances standard (sauf indication contraire) Finition de la surface: SI: 4-8a; SII: 8-12A Appartements: Une primaire SEMI-STD; un scribe Propre et poli, des deux côtés </td></tr><tr><td> 170 plaquette de recouvrement pm </td><td> CAPTEUR services de préparation </td><td> 7980 Gaufrettes 2G </td><td> Ø: 100 mm ± 0,5 mm Epaisseur: 0,17 mm ± 0,025 mm Tolérances standard (sauf indication contraire) Finition de la surface: SI: 4-8a; SII: 8-12A Appartements: Une primaire SEMI-STD; un scribe Propre et poli, des deux côtés </td></tr><tr><td> Profonde graveur ionique réactive pour les oxydes </td><td> ULVAC </td><td> ULVAC NL-6000 </td><td></td></tr><tr><td> Laser à ions argon </td><td> Cambridge Laboratories laser </td><td> Lexel 95-SHG </td><td> X = 258 nm </td></tr><tr><td> Laser à ions argon </td><td> Melles Griot </td><td></td><td> X = 488 nm </td></tr><tr><td> Microscope </td><td> Olympe </td><td> IX-51</td><td></td></tr><tr><td> Objectif de microscope </td><td> Thor Labs </td><td> OFR LMU-40X-UVB 0,5 NA </td><td> X = 258 nm </td></tr><tr><td> Objectif de microscope </td><td> Olympe </td><td> UPLSAPO 60XW 1,2 NA </td><td> X = 488 nm </td></tr><tr><td> Nanopositioner </td><td> Mad Labs Ville </td><td> Nano-LP100 </td><td></td></tr><tr><td> Stade Traduction motorisé </td><td> Semprex Corp </td><td> KL-Série 12-6436 </td><td></td></tr><tr><td> GaAsP Photon contre </td><td> Hamamatsu </td><td> H7421-40 </td><td></td></tr><tr><td> Monochromateur </td><td> Horiba Instruments Inc </td><td> MicroHR </td><td></td></tr><tr><td> La caméra CCD </td><td> Andor Technology </td><td> idus 420A-BU </td><td></td></tr><tr><td> Chlorhydrate de guanidine (GuHCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td&gt; G4505 </td><td></td></tr></tbody></table>

mélangeurs microfluidiques pour étudier repliement des protéines

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Le processus par lequel une protéine se replie dans sa conformation native est très pertinente pour la biologie et la santé humaine mais encore mal compris. Une raison à cela est que le pliage a lieu sur une large gamme d&#39;échelles temporelles, de la nanoseconde à quelques secondes ou plus, en fonction de la protéine 1. Classiques stopped-flow mélangeurs ont permis de mesurer la cinétique de pliage à partir d&#39;environ 1 ms. Nous avons récemment développé un mélangeur microfluidique qui dilue dénaturant ~ 100 fois dans ~ 8 ms 2. La différence d&#39;un mélangeur de flux arrêté, ce mélangeur fonctionne dans le régime d&#39;écoulement laminaire dans lequel la turbulence ne se produit pas. L&#39;absence de turbulence permet la simulation numérique précise de tous les flux au sein de la table de mixage avec un excellent accord pour expérimenter 3-4. À flux laminaire est atteint pour des nombres de Reynolds Re ≤ 100. Pour les solutions aqueuses, ce qui nécessite des géométries échelle du micron. Nous utilisons un substrat dur, tel que le silicium ou fusionnés siliconeca, pour faire um canaux 5-10 de large et 10 um de profondeur (voir figure 1). Les plus petites dimensions, à l&#39;entrée de la zone de mélange, sont de l&#39;ordre de 1 pm à la taille. La puce est scellé avec une lamelle de verre mince ou en silice fondue pour l&#39;accès optique. Typiques au total des débits linéaires sont ~ 1 m / s, Re cédant ~ 10, mais la consommation de protéines est seulement ~ 0,5 nL / s ou 1,8 pi / h. La concentration en protéines dépend de la méthode de détection: Pour fluorescence du tryptophane la concentration typique est de 100 um (pour 1 Trp / protéine) et pour FRET de la concentration typique est de ~ 100 nM. Le processus de pliage est initiée par dilution rapide de dénaturant de 6 M à 0,06 M de chlorhydrate de guanidine. La protéine en dénaturant haute coule un canal central et est remplie de chaque côté à la zone de mélange par le tampon, sans dénaturant le déplacement ~ 100 fois plus rapide (voir Figure 2). Cette géométrie provoque la constriction rapide de l&#39;écoulement des protéines dans une étroitejet ~ 100 nm de large. Diffusion des molécules légères dénaturant est très rapide, tandis que la diffusion des molécules de protéines lourds est beaucoup plus lente, la diffusion inférieure à 1 um à 1 ms. La différence de constante de diffusion de l&#39;agent de dénaturation des protéines et des résultats de dilution rapide de l&#39;agent de dénaturation des protéines à partir du flux, la réduction de la concentration efficace de l&#39;agent de dénaturation autour de la protéine. Le jet protéine s&#39;écoule à une vitesse constante dans le canal d&#39;observation et de la fluorescence de la protéine pendant le pliage peut être observé à l&#39;aide d&#39;un microscope à balayage confocal 5.

Dans ce travail nous expliquer la fabrication et l&#39;utilisation d&#39;un mélangeur microfluidique capable de mélanger deux solutions dans ~ 8 ms. Nous démontrons également l&#39;utilisation de ces mélangeurs avec détection spectroscopique utilisant la fluorescence UV et de fluorescence de transfert d&#39;énergie par résonance (FRET).

Mélangeurs microfluidiques pour étudier repliement des protéines

Le processus par lequel une protéine se replie pour adopter sa conformation native est extrêmement pertinent pour la biologie et la santé humaine, tout en restant encore mal compris. L'une des raisons...

L'objectif général de cette procédure est de mélanger rapidement deux solutions afin d'initier une réaction biochimique à l'échelle du microsecond. Cela est réalisé en fabriquant tout d'abord un mélangeur microfluidique. La deuxième étape consiste à lier une puce à un verre de couverture afin d'étanchéifier les canaux.Ensuite, la puce est fixée sur un collecteur contenant les réservoirs de solution. La dernière étape consiste à imager la solution mixte par microscopie de fluorescence confocale. En définitive, la réaction biochimique est capturée à l'échelle de temps de la microseconde en convertissant la distance le long du canal de sortie en temps.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le mélange stop-flow est que le mélange n'est pas limité par la turbulence et se produit en quelques microsecondes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du repliement des protéines, comme par exemple à quel moment se produit l'effondrement hydrophobe ? Ling Woo, postdoctorante dans mon laboratoire, démontrera la procédure pour commencer la fabrication de puces microfluidiques de mélange.Nettoyez d'abord quatre plaquettes de silice FU de quatre pouces avec une solution de piranha fraîche, comme décrit dans le protocole écrit accompagnant cette vidéo. Ensuite, utilisez un four de dépôt chimique en phase vapeur sous pression réduite pour appliquer un revêtement de polysilicium d'environ un micron d'épaisseur pour chaque 10 micromètres de profondeur souhaitée des canaux microfluidiques finaux. Après un traitement supplémentaire des plaquettes tel que décrit dans le texte, appliquez par centrifugation une couche de 900 nanomètres d'épaisseur de résine photosensible Z 52 14, puis effectuez une pré-cuisson à 90 degrés Celsius directement sur un bloc chauffant pendant une minute ou dans un four à 110 degrés Celsius pendant 30 minutes.Après avoir aligné un masque photolithographique, établissez un contact dur sous vide en exposant d'abord la résine photosensible à une lumière UV pendant plusieurs secondes. Ensuite, révélez le motif dans la résine photosensible conformément au protocole écrit. Examinez les motifs sur la tranche à l’aide d’un microscope et effectuez une cuisson dure à 115 degrés Celsius directement sur un bloc chauffant pendant deux minutes.Ensuite, décharger les plaquettes avec un plasma Asher ou à l'oxygène pendant 2,5 minutes à une puissance RF de 100 watts. À l’aide d’un graveur ionique réactif profond, graver la couche de poly-silice jusqu’au silicium fondu sous-jacent. Retirer le photo-résistant restant et traiter les plaquettes conformément aux instructions du texte.Mesurez la profondeur de gravure pour vous assurer qu'elle traverse entièrement le revêtement en poly. À l'aide d'un graveur ionique réactif profond capable d'attaquer l'oxyde, gravez la silice fondue sur une profondeur d'environ 10 micromètres par micromètre d'épaisseur du revêtement en poly. Nettoyez la plaquette avec l'appareil de matricage pendant quatre minutes, à une puissance RF de 100 watts, puis éliminez le polysilicium à l'aide d'un graveur au difluorure de xénon avant de percer des trous dans la plaquette. Appliquez ensuite par spin-coating une nouvelle couche de photo-résine d'un micromètre d'épaisseur afin de protéger les canaux lors des manipulations ultérieures.Ensuite, fixez la tranche côté composants vers le bas sur une plaque de verre sacrificielle à l’aide de l’Aqua Bond 55. Veillez à maintenir le bonder exempt de bulles à l’aide d’un foret à pointe de diamant commandé par ordinateur et refroidi, ainsi qu’une solution de nettoyage micro 90. Cela empêche de petits fragments de verre de s’agglomérer aux canaux, ce qui provoquerait un colmatage de la puce lors de son utilisation.Passez à la réalisation des trous d'entrée et de sortie sur chaque puce. Rincez la plaquette avec de l'eau déionisée en utilisant une seringue pour injecter de l'eau dans chaque trou. Ensuite, faites-la tremper dans de l'eau savonneuse pendant une heure après avoir retiré la photo.Résist et collage tels que décrits dans le texte. Rincer la plaquette avec de l'eau déionisée et de l'eau tiède savonneuse. Rincer à nouveau chaque trou à l’aide d’une seringue, en évitant les motifs gravés après avoir fait passer de l’azote sur la plaquette.Poursuivre le séchage dans une étuve sous vide réglée à 120 degrés Celsius. Inspecter les trous pour s'assurer qu'ils sont exempts de saleté et répéter les étapes de nettoyage si nécessaire. Les étapes suivantes doivent être effectuées en salle blanche.Mesurez la profondeur des canaux à l’aide d’un profilomètre de surface optique ou mécanique. Nettoyez la plaquette ainsi qu’un couvre-objet en silice fondue comme décrit dans le texte, en salle blanche. Séchez soigneusement la plaquette avec de l’azote gazeux pendant au moins cinq minutes.Placez ensuite la tranche côté composants vers le haut sur une pile de trois à quatre lingettes de salle propre placées sur une surface plane et dure, comme un petit morceau de verre. Répétez l'opération avec le couvre-objet. Saisissez le couvre-objet par le bord et retournez-le de manière à ce que la face polie soit orientée vers le bas, au-dessus de la tranche.Alignez soigneusement les bords plats, laissez tomber délicatement la lame de couverture sur la tranche et laissez-la se positionner ; ajustez uniquement par un léger déplacement horizontal. Appuyez avec un doigt au centre de la tranche. On doit voir un front d'adhérence commencer à se propager vers l'extérieur.Si nécessaire, appliquer une pression supplémentaire sur d'autres positions autour de la tranche pour faire progresser le front de collage. Après avoir placé les tranches scellées dans un four à haute température programmé selon le profil de température indiqué dans le texte, découper la tranche à l’aide d’une scie à trancher les tranches afin d’obtenir des puces individuelles. Le bloc collecteur destiné à contenir la puce de mélange et les solutions peut être fabriqué en plastique tel que du lexan ou du plexiglas, ou en aluminium.Pour le contrôle de la température, fixez la puce au collecteur à l’aide de petits joints toriques et maintenez-la en place avec un anneau de retenue qui permet une vue optique claire du centre de la puce. Les rainures pour joints toriques doivent être plus peu profondes que la normale afin d’assurer un bon ajustement sans appliquer une pression excessive sur la puce. Une fois la puce montée, ajoutez des solutions dans les réservoirs central et latéraux, en veillant à libérer toutes les bulles éventuellement piégées au fond des puits.Placer le collecteur sur un microscope inversé et examiner la zone de mélange à l’aide de l’oculaire ou de la sortie caméra. Une lampe torche à incandescence placée sur le dessus du collecteur fournira un éclairage suffisant. Utiliser un colorant ou une solution à indice de réfraction élevé dans le canal central pour visualiser le jet.Étant donné que les volumes utilisés dans ce mélangeur sont très faibles, l'écoulement peut être contrôlé par une pression d'air appliquée au-dessus des puits de solution. Pour visualiser le jet, commencez avec une pression nulle dans le canal latéral (en livres par pouce carré) puis augmentez progressivement jusqu'à atteindre une pression égale à celle du canal central. Si l'un des canaux latéraux est obstrué, le jet sera dévié contre l'une des parois du canal de sortie.Si un colmatage visible apparaît, il peut être désengagé en appliquant une pression ou un vide sur le canal de sortie à l’aide d’une seringue. Si des protéines ou d’autres matériaux organiques obstruent la puce, celle-ci peut être nettoyée par une immersion dans une solution piranha, en laissant agir toute la nuit. Introduisez un faisceau laser revêtu dans un microscope de recherche en utilisant un miroir dichroïque placé soit à l’intérieur, soit juste à l’extérieur du microscope.Alignez le laser de manière à ce que le point focal soit visible dans l’oculaire ou sur la caméra, approximativement près de la zone de mélange. La fluorescence provenant de la protéine dans le mélangeur est collectée par l’objectif et dirigée à travers un miroir dichroïque, focalisée par une lentille sur un diaphragme et projetée sur un compteur de photons. Balayez la puce à l’aide d’un scanner piézoélectrique selon les axes x et y afin d’imager la zone de mélange.Choisissez une position sur le jet et effectuez une analyse en X et Y pour trouver le point de focalisation au centre du canal dans la direction verticale. La profondeur de champ du microscope est beaucoup plus faible que la profondeur du canal, et le débit est uniforme dans le canal sauf à moins d'un micron des parois. Par conséquent, la résolution temporelle de la fluorescence observée est déterminée principalement par la taille du spot confocal.Balayer horizontalement dans le canal de sortie par incréments de 100 microns le long du jet, en observant environ une milliseconde par position. Déplacer la platine du microscope de 80 à 90 microns le long du jet afin de capturer des instants ultérieurs. Alternativement, la lumière peut être détectée par un spectrographe et un CCD après le miroir dichroïque, à l’aide d’une lentille permettant de focaliser la lumière sur la fente d’entrée.Étant donné que la collecte de données est plus lente qu'avec le compteur de photons, on image généralement d'abord le jet avec le compteur de photons, puis on mesure des points le long du jet à l'aide du spectrographe. Les données provenant du compteur de photons sont analysées en additionnant trois à cinq pixels autour du jet à chaque position, afin de créer un graphique de l'intensité en fonction de la distance. Le temps est calculé à partir de la distance en utilisant une vitesse calculée basée sur les pressions appliquées.Comme étape finale, analyser les données du spectrographe à l'aide de l'une des méthodes décrites dans le texte. On voit ici une carte de contour de l'intensité dans la zone de mélange mesurée par le compteur de photons. Le fond dans le canal de sortie en dehors du jet devrait être proche du niveau de bruit du détecteur et n'est généralement pas soustrait.Un fond plus élevé peut indiquer un mauvais alignement ou le fait que la protéine adhère aux parois du canal. Inversement, un jet qui semble courbé ou tordu, particulièrement près de la zone de mélange, indique une gravure insuffisante des buses. Un spectre résolu en temps est présenté pour la protéine ACell, la protéine de liaison au coenzyme A ou A CBP, marquée avec Alexa 4 88 et Alexa 6 47.Les rectangles vert et rouge indiquent respectivement les longueurs d'onde désignées comme canaux donneur et accepteur. Ces données ont été soustraites du fond pour éliminer la charge sombre et le signal laser. Le signal de fond a été mesuré avec une pression au canal central équivalente à zéro livre par pouce carré.Le temps de mélange peut être mesuré en suivant une réaction rapide beaucoup plus rapide que le mélange, comme la fluorescence du tryptophane inhibée par l'iodure de potassium. Étant donné que le jet est plus petit que la résolution optique du microscope, une forte diminution de l'intensité est observée dans la zone de mélange. Lors de la formation du jet, cette réponse de l'appareil peut être corrigée en effectuant une mesure de contrôle dans laquelle aucune condition de la solution ne change.Le rapport entre les expériences de mélange et de non-mélange de la fluorescence de l'amide de N-acétyltryptophane est affiché sur cette figure. La ligne indique la concentration prédite d'iodure de potassium issue de la modélisation et des simulations multiphysiques par console. Le temps de mélange, mesuré comme étant le temps nécessaire pour que la concentration diminue de 80 %, est de huit microsecondes.Ce graphique montre les variations du FRET dans la protéine A CBP après dilution du dénaturant, passant de six à 0,06 molaire. Ces données ne nécessitent pas d'expérience contrôle. Étant donné que le FRET est déjà un rapport et que la réponse de l'appareil a déjà été soustraite, le saut rapide vers T égal à zéro représente un changement rapide du signal de FRET durant le temps de mélange.Après ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du repliement des protéines pour explorer les premières étapes de la formation de la structure des protéines.

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