Mise en place de cultures microbiennes eucaryotes à partir d'un enrichissement chimique stratifié lac Antarctique et de l'évaluation du potentiel de fixation du carbone

L'objectif général de cette procédure est de produire des cultures enrichies en protistes à partir du lac Bonnie en Antarctique et de mesurer la fixation du carbone comme indicateur initial de la diversité métabolique. Pour ce faire, on prélève d'abord des échantillons d'eau à des profondeurs du lac Bonnie correspondant à des pics connus de protistes et de phytoplancton. Les échantillons d'eau du lac sont ensuite inoculés dans divers milieux de culture et incubés dans une chambre de croissance équipée d'un régulateur de température et de sources lumineuses pendant quatre à six semaines.

Les cultures peuvent être transportées selon les besoins à quatre degrés Celsius. L'étape suivante consiste à extraire des lysats cellulaires bruts à partir des cultures d'enrichissement. La dernière étape de cette procédure est d'évaluer le potentiel de fixation du carbone dans le lysat cellulaire à l'aide d'un dosage par radioisotope de la ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase, oxygénase, ou activité RubisCO.

En fin de compte, les cultures enrichies en pro montrent une variation du potentiel de fixation du carbone au sein de la communauté naturelle de protistes. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés concernant l'écologie microbienne des lacs, par exemple au sujet du rôle des eucaryotes microbiens dans le cycle du carbone à divers stades dans les lacs antarctiques stratifiés.

Bien que l'échantillonnage de la colonne d'eau en vue de générations successives de cultures d'enrichissement soit une technique fréquemment utilisée, cette méthode comporte des modifications permettant son fonctionnement dans un environnement extrêmement froid où des complications imprévues peuvent survenir. J'ai eu cette idée pour la première fois en réfléchissant à des moyens de tester le test Redisco sur des échantillons naturels de lacs. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d'échantillonnage sont difficiles à imaginer étant donné que les sites d'échantillonnage se trouvent dans un environnement étranger à bon nombre de chercheurs.

Les échantillons sont prélevés dans le lac Bonnie, l'un des nombreux lacs recouverts en permanence de glace situés dans les vallées sèches de McMurdo en Antarctique. Un jour avant de prélever la colonne d'eau, choisissez et préparez le site d'échantillonnage. Cela permettra aux couches stratifiées de la colonne d'eau de se reformer après la perturbation causée par le forage et la fonte du trou dans la glace. Identifiez l'emplacement du site de forage par GPS afin d'accéder à la colonne d'eau.

Commencez par percer un trou dans la glace à l’aide d’un Jiffy Ice aga fixé à une rallonge hélicoïdale de quatre pouces et d’un foret coupeur afin d’éviter le gel du foret dans le trou. Essayez d’éviter de percer dans l’eau liquide en arrêtant le forage à environ quatre à six pouces au-dessus du sommet de la colonne d’eau. Le trou de forage doit être élargi d’un diamètre de six pouces à deux pieds pour l’échantillonnage.

Cela est réalisé à l’aide d’un appareil de fonte de trou basé sur un modèle de mer chaude, qui fait circuler du polyéthylène glycol chauffé à l’intérieur d’un trou percé dans un tuyau en cuivre. La fonte prend généralement jusqu’à 18 heures, le jour précédant l’échantillonnage de la colonne d’eau. Veillez à ce que tous les équipements nécessaires ainsi que les récipients de stockage des échantillons soient rassemblés sur le site d’échantillonnage.

Les matériaux d'échantillonnage comprennent une bouteille NICU d'une capacité de cinq à dix litres, un treuil muni d'un câble étalonné en profondeur, un nombre suffisant de flacons d'échantillonnage pour chaque profondeur, un messager et des glacières pour le transport des échantillons. Commencer l'échantillonnage tôt dans la journée, vers 5h00 du matin, car la filtration de l'eau du lac doit être terminée le jour même de l'échantillonnage. Utiliser un échantillonneur kin fixé à un treuil manuel étalonné.

Prélèvez des échantillons d'eau d'un à cinq litres aux profondeurs souhaitées pour cette étude. Les profondeurs d'échantillonnage sont de six mètres, 15 mètres et 18 mètres mesurées à partir du niveau d'eau symétrique du PI dans le trou de glace. Conservez les échantillons de lac dans des glacières et transportez-les du site de prélèvement jusqu'au laboratoire sur le terrain.

À l'aide d'un traîneau fixé à un A TV, les échantillons doivent être traités ou stabilisés dans le laboratoire sur le terrain. Immédiatement après l'échantillonnage, la culture de milieux enrichis doit commencer une fois les échantillons transportés au laboratoire de terrain. Concentrer 0,5 à un litre d'eau de lac sur un filtre de 47 millimètres de diamètre et de 0,45 micron de taille de pore.

Filtrez délicatement à l’aide de filtres en sulfone de polyéther. Si l’on souhaite préserver la diversité de la communauté naturelle, filtrez un deuxième échantillon sur un filtre de 47 millimètres de diamètre et de 0,45 micron de taille de pore.

Les filtres en sulfone de polyéthers sont congelés instantanément dans de l'azote liquide. Transférez chaque filtre dans un tube stérile Falcon de 50 millilitres contenant environ 20 millilitres d'eau de lac filtrée, prélevée à la même profondeur d'échantillonnage que le filtre.

Transférez la suspension cellulaire dans un flacon stérile de culture cellulaire de 25 centimètres carrés pour des enrichissements sur différents milieux de culture. Préparez plusieurs réplicats pour chaque profondeur d'échantillonnage. Complétez chaque flacon de culture avec 50 x des solutions stériles des milieux de culture suivants, bold basil, milieu, BG 11 et F deux.

Si la culture d'un mélange d'organismes atróphiques est requise, préparez deux récipients F deux supplémentés et ajoutez deux à trois grains de riz stérile à l'un des flacons de culture. Incubez les cultures à basse température et sous faible rayonnement lumineux dans un incubateur de croissance thermostaté pendant au moins quatre semaines avant l'expédition au laboratoire des États-Unis. Transférez les cultures enrichies dans des tubes Falcon stériles de 50 millilitres. Indiquez sur la demande d'expédition les instructions suivantes : ne pas congeler et maintenir au frais. Après réception aux États-Unis, transférez cinq millilitres de chaque culture enrichie dans 45 millilitres de milieu de croissance approprié dans un flacon de 125 millilitres.

Flacon Erlenmeyer stérile muni d’un bouchon en éponge stérile. Maintenir les cultures d’enrichissement sous forme de cultures statiques dans une enceinte de croissance contrôlée en température à quatre degrés Celsius, et transférer par transfert à faible rayonnement des cultures dans des milieux frais tous les 30 jours. Pour commencer la procédure d’extraction du lysat cellulaire, filtrer cinq litres de culture d’enrichissement sur un filtre Watman GFF de 25 millimètres à l’aide d’un vide doux.

Ensuite, découpez le filtre en quatre à cinq sections à l’aide de ciseaux en acier stériles. Puis utilisez une pince stérile pour transférer les morceaux dans un tube vissable de deux millilitres rempli au cinquième avec des billes de 0,1 millimètre de diamètre.

Billes de zircone et silice. Ajouter 1,25 millilitre de tampon d'extraction filtré dans le tube, puis lyser les cellules à l'aide d'un broyeur à billes miniaturisé pendant 30 secondes à une vitesse de 48, puis placer sur glace pendant une minute. Répéter cette opération de broyage par billes deux fois supplémentaires, en intercalant des incubations d'une minute sur glace entre chaque cycle, afin d'éviter tout échauffement de l'échantillon lors de la centrifugation.

Filtrez la suspension pendant deux minutes à 3000 × g à quatre degrés Celsius. Pour former un pelotis lâche de fibres de filtre GFF et de débris pariétaux. Prélevez un aliquot de 200 microlitres du surnageant et immergez-le dans 800 microlitres d'acétone à 90 % glacée.

Transférez le surnageant restant dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Mesurez la chlorophylle A extractible dans un spectrophotomètre aux longueurs d'onde de 664 nanomètres et de 647 nanomètres. Centrifugez le surnageant restant pendant deux minutes à 15 000 ×g à quatre degrés Celsius.

Transférez le S dans un tube propre de centrifugation micro de 1,5 millilitre en évitant le culot de membranes cellulaires insolubles et les fibres résiduelles du filtre GFF. Ce lysat cellulaire soluble peut maintenant être utilisé dans le dosage de l'activité de la rubis-carboxylase, qui sera démontré ci-après. Pour commencer ce dosage, transférez 125 microlitres de chaque lysat soluble dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL à bouchon vissable préalablement refroidi sur de la glace.

Pour les échantillons de contrôle négatif, ajouter 125 microlitres de lysat soluble dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre à bouchon vissé, mais ne pas ajouter de substrat. Préparer ultérieurement des réactions en double pour tous les échantillons et les contrôles négatifs. Préparer 10 millilitres de tampon de dosage, frais et refroidi sur glace.

Prélevez suffisamment de tampon de dosage pour tous les échantillons et les contrôles négatifs dans un tube de cinq millilitres. À partir de ce moment, toutes les étapes doivent être réalisées sous une hotte chimique. Ajoutez du bicarbonate de sodium marqué au C14 au tampon alloué et maintenez le tampon sur glace.

Prélvez 10 microlitres du tampon d'essai contenant du C 14 et diluez-le dans un millilitre de tampon d'essai en inversant le tube. Pour homogénéiser, ajoutez 100 microlitres du mélange dilué à trois millilitres de cocktail de comptage scintillateur Bios Safe Two dans un flacon de scintillation, puis inversez pour mélanger. Mesurez les désintégrations du C 14 à l'aide d'un compteur scintillation Beckman LS 6,500 ; les comptes doivent être supérieurs à 18 000 par minute avant de poursuivre l'essai.

Lorsque suffisamment de bicarbonate de sodium marqué au C14 a été ajouté au tampon de dosage, transférez les tubes à réaction dans un bain sec préchauffé à 25 degrés Celsius et incubez pendant trois à cinq minutes. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon de dosage aux lysats et incubez à 25 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après cinq minutes, ajoutez du ribulose bisphosphate à chaque échantillon et laissez la réaction se dérouler pendant cinq à dix minutes à 25 degrés Celsius.

Pour arrêter la réaction, ajouter 100 microlitres d'acide probiotique à 100 %, centrifuger pendant une heure à 2000 ×g pour éliminer le C14 non incorporé. Enfin, transférer le volume total des échantillons dans des vials de scintillation contenant trois millilitres de bios. Conserver un cocktail de comptage de scintillation pour déterminer les impulsions par minute de la fraction stable à l'acide.

Produits finaux par comptage scintillation. Une culture d'enrichissement a été utilisée pour isoler de nouveaux protistes phototrophes et mixotrophes adaptés au froid provenant du lac antarctique Bonnie à trois profondeurs différentes. Divers types de milieux de croissance ont été utilisés afin de sélectionner une plus grande diversité d'organismes : le milieu Bold’s Basal ou BBMF, le milieu marin deux si, et le milieu BG 11.

La concentration en nutriments et le rayonnement actif pour la photosynthèse, ou PAR, indiqués dans ce tableau représentent les conditions au moment du prélèvement des échantillons. L'inspection visuelle des cultures enrichies par microscopie optique a révélé que celles-ci étaient dominées par des protistes phototrophes, comme en témoigne la présence de pigment chlorophyllien dans la plupart des cellules. Les cultures abritaient également une variété de morphologies cellulaires, selon la profondeur d'échantillonnage d'où l'inoculum avait été prélevé et selon le type de milieu utilisé pour la culture.

Les taux maximaux d'activité de carboxylase catalysée par l'enzyme rubis ont été mesurés dans les cultures enrichies comme indicateur de fixation du carbone. L'abondance potentielle de chlorophylle A a également été surveillée comme estimation de la biomasse des protistes phototrophes, comme illustré ici.

Bien que toutes les cultures aient été cultivées à la même température, le potentiel de fixation du carbone et la biomasse phototrophique varient considérablement entre les cultures enrichies. Une activité maximale de rubis O a été observée dans les cultures enrichies quatre et six, cultivées en milieu BBM, ainsi que dans les cultures enrichies 13 et 14, cultivées en milieu BG 11. En revanche, les cultures 1921 et 23, enrichies en milieu de croissance F deux, ont présenté des activités carboxylasiques maximales inférieures de quatre à 34 fois.

Ces différences n'étaient pas dues à des niveaux inférieurs de biomasse dans les cultures F deux, l'activité de la carboxylase ayant été exprimée sur la base de la chlorophylle a. De plus, une analyse de corrélation de Pearson a révélé que l'activité de la rubisco ne corrélait pas avec la concentration en chlorophylle a. Les cultures en BBM ont été ensemencées avec de l'eau de lac provenant de six mètres et de 15 mètres.

Le forum cinq de l'enrichissement présentait les concentrations les plus élevées en chlorophylle a, tandis que toutes les autres cultures montraient une chlorophylle a relativement faible, indépendamment de l'activité de l'enzyme rubis. Une fois maîtrisées, les techniques d'échantillonnage du lac prennent environ deux heures à être réalisées. Selon le nombre d'échantillons prélevés, le dosage de la carboxylase prend également deux heures lorsqu'il est effectué correctement. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que le dosage de l'activité enzymatique hétérotrophe, peuvent être utilisées pour répondre à d'autres questions, comme la profondeur à laquelle se produit l'hétérotrophe. Bon, après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de prélever des échantillons dans un lac, de les enrichir pour produire et de doser l'activité de la carboxylase rubis.