Utilisation d'un robot pour haut-débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques

Bonjour et bienvenue au Groupe de Biologie Structurale et Fonctionnelle des Membranes. Je m’appelle Martin Caffery. Ceci est un autre d’une série d’articles sur la cristallisation des protéines membranaires pour la détermination structurée à l’aide de la méthode en phase cubique in meso ou lipic.

Dans le premier article, JoVE 1 7 1 2, nous avons montré comment la phase cubique chargée de protéines est préparée et comment la phase misa visqueuse et collante est distribuée manuellement dans des plaques sandwich en verre pour les essais de cristallisation. Cet article vidéo décrit les méthodes d’utilisation d’un robot de cristallisation en mésocristallisation. Un robot offre les avantages de la vitesse, de la précision, de la miniaturisation de précision et de la capacité de travailler pendant de longues périodes dans des conditions inconfortables telles que dans l’obscurité ou à basse température.

Les robots, lorsqu’ils sont utilisés correctement, peuvent améliorer considérablement la productivité de la recherche sur la structure et la fonction des protéines membranaires. Dans cet article vidéo, nous démontrons l’utilisation de trois robots disponibles dans le commerce. Le premier robot a été développé dans le groupe de biologie structurale et fonctionnelle des membranes, et est décrit en détail dans la première référence.

Les deux autres viennent tout juste d’être disponibles et sont inclus ici par souci d’exhaustivité. La préparation de la plaque de cristallisation pour effectuer un essai de cristallisation robotisée commence par la préparation de la plaque de base de la plaque de cristallisation sandwich en verre, décrite en détail en référence à la plaque de base, doit d’abord être siloisée et l’entretoise perforée à double bâton qui crée les puits doit être appliquée sur la plaque. Les matériaux nécessaires à cet effet sont présentés ici.

Ils comprennent une plaque de base de cristallisation du verre, une solution d’espacement à double bâton perforée, un rouleau ou des mouchoirs en papier brayer et un bécher d’eau UE. L’assiette est placée sur une serviette en papier sur un paillasse. Quelques gouttes de solution silencieuse sont appliquées, puis réparties uniformément sur la surface de la plaque à l’aide d’un mouchoir en papier.

La plaque est lavée de l’excès de solution en l’immergeant complètement dans un bécher d’eau. La plaque est retirée du bécher et posée sur une serviette en papier sèche. Le côté siloisé vers le haut et sa surface exposée sont séchés en essuyant légèrement avec des serviettes en papier.

Ensuite, le couvercle de protection de l’entretoise à double bâton perforé est retiré et l’entretoise est appliquée sur la surface siloisée de la plaque de verre. Il est important que l’entretoise soit correctement positionnée sur la plaque de base, le coin supérieur gauche et les deux côtés adjacents de l’entretoise et de la plaque coïncidant. Un rouleau ou un brayer est utilisé pour aplatir l’entretoise sur la plaque de base et pour créer un joint étanche entre elles.

Entre parenthèses, nous notons que les plaques silotisées complètes avec des entretoises perforées sont disponibles dans le commerce, comme décrit dans la section de référence. Après avoir préparé la plaque de base de cristallisation, nous passons maintenant à la configuration et à l’utilisation du robot in meso. Comme indiqué dans ce qui suit, nous démontrons l’utilisation de trois chez les robots méso.

Dans tous les cas montrés, les robots sont installés et utilisés dans une pièce à température contrôlée réglée à 20 degrés Celsius dans le premier robot méso, le premier robot méso à être démontré dans cette vidéo. L’article a été élaboré dans le laboratoire du chercheur principal et est maintenant disponible dans le commerce. Tous les détails peuvent être trouvés dans la section référence.

Les matériaux et l’équipement nécessaires à la mise en place d’un essai de cristallisation robotisé sont présentés ici. Il s’agit d’un cahier de laboratoire, d’une malade chargée de protéines, fraîchement préparée comme décrit à la section Jo de l’article 1 7 1 2 et logée dans une seringue Hamilton. Plaques de base siloisées avec entretoises et verre de protection assortis, bouteille d’eau et mouchoirs, et le robot en miso.

La première vue est celle du robot avec son pont dégagé. La vue suivante est celle du robot complet avec station de parc d’humidificateur, plaque de base de cristallisation et bloc de puits profond contenant des solutions de précipitation. Nous commençons la configuration en plaçant la plaque de base sur le pont du robot.

Il dispose de sa propre plate-forme, clairement indiquée avec des positions de puits à des fins d’alignement de la plaque de base. La plaque doit être clairement étiquetée à des fins d’identification. Le bloc de 96 puits contenant les solutions précipitantes est sécurisé sur sa propre plate-forme sur le pont du robot à côté de la plaque de cristallisation.

Le bloc s’ouvre en décollant soigneusement son capuchon de plafond en plastique. Le flux d’humidité de l’humidificateur est dirigé vers s’écouler sur et à travers la plaque de base sur le pont du robot Installation du robot. Le robot est initialisé en suivant les instructions du fabricant.

Nous ne le démontrerons pas en détail ici, car les protocoles exacts changeront au fil du temps. Essentiellement, ce qui se passe lors de l’initialisation, c’est que le bras de distribution de mease sur le robot est pourvu de positions de référence dans trois directions orthogonales, x, Y et Z.Ensuite, la phase meza chargée de protéines dans une seringue Hamilton complète avec aiguille de distribution est attachée au bras l’un des robots tous les détails sur la façon de préparer la phase meza et la seringue sont décrits dans Jo de l’article 1 7 1 2 et dans la référence un, La pointe de l’aiguille de la seringue de distribution doit maintenant être alignée avec le bas et le centre du puits le plus haut dans le coin gauche de la plaque de cristallisation. Cela correspond à l’identificateur de puits A aligné avec le fond du puits A un comme premier ordre du jour.

Pour ce faire, j’ajuste la hauteur ou la coordonnée Z après avoir distribué le bras tout en observant à quel point la pointe de l’aiguille se rapproche du fond du puits. On peut juger que la pointe touche juste le fond du puits en déplaçant la plaque à la main d’un côté à l’autre sur la plate-forme tout en ajustant légèrement la hauteur du bras de distribution, la coordonnée Z du bras de distribution où la pointe entre en contact avec la plaque est entrée dans l’ordinateur La distribution est programmée pour avoir lieu avec la pointe de l’aiguille à plusieurs micromètres de cette position Z de référence, qui correspond à la surface de la plaque de base. Le robot est ensuite activé pour passer par une série d’étapes demandées par l’utilisateur pour positionner la pointe de l’aiguille au centre du puits A.

La coordonnée XY de référence du bras de distribution où la pointe est centrée est stockée dans l’ordinateur contrôlant le robot. Il sert à définir le centre des puits restants sur la plaque. Après avoir défini ces coordonnées de référence dans l’ordinateur, le bras de distribution de mease reçoit l’ordre de revenir à sa position de départ, en amorçant la seringue.

La seringue de distribution doit maintenant être amorcée. Ceci est fait pour s’assurer que la muse fraîche remplit l’aiguille de distribution et que le premier puits sur l’assiette reçoit son complément complet de mease. Il y a une commande d’amorçage dans le programme qui exécute l’activation du robot.

Il fait avancer le piston de la seringue par étapes sous le contrôle de l’utilisateur. Pendant ce temps, la pointe de l’aiguille est examinée à la recherche de méchanceté, la phase meza extrudée est retirée avec un tissu. Cela termine le processus d’amorçage du robot.

Le robot est maintenant prêt à fonctionner en mode automatique pour commencer la course. Le programme XAP du robot lance une série d’étapes de rinçage où les pointes de distribution du précipitant sur le bras deux du robot sont lavées et sont préparées pour aspirer les solutions du précipitant du bloc de puits profond, l’activation de la fonction de distribution sur le robot met en mouvement, le chargement séquentiel des puits avec du mease chargé de protéines les huit premiers puits à la fois, suivi de solutions précipitantes entre les livraisons. Le bras de distribution de mease revient à une position de stationnement où l’extrémité de l’aiguille est placée dans une éponge humidifiée pour empêcher la mease à l’extrémité de se dessécher.

Le plus souvent, les valeurs utilisées dans les essais de cristallisation effectués dans la membrane. Le groupe de biologie structurale et fonctionnelle est composé de 50 nanolitres de muse et de 800 nanolitres de solution précipitante. Le programme qui fait fonctionner le robot dans cette démonstration a été configuré de manière à ce que les deux bras se déplacent simultanément.

De cette façon, il est possible de terminer le chargement d’une plaque de 96 puits avec mease et précipitant en cinq minutes. Immédiatement, la plaque est remplie et les bras du robot sont revenus à leur position de stationnement. La plaque est retirée du pont du robot et placée sur une surface plane et solide.

Une vitre de protection est posée doucement sur le dessus de la plaque de base en contact avec la surface collante supérieure de l’entretoise. Il est important de s’assurer que les 96 puits sont entièrement couverts, que le verre de couverture est aligné carrément avec la plaque de base et qu’aucune partie du verre de couverture ne dépasse l’empreinte de la plaque de base. Un rouleau ou un brayer est utilisé pour créer une étanchéité étanche et uniforme entre le verre de couverture et l’entretoise.

La plaque doit être inspectée à ce stade pour s’assurer que la configuration s’est déroulée comme il se doit. Ce que l’on recherche, c’est un œuf au plat sur une apparence de poêle. Dans chaque puits, le joug de l’œuf correspond à la phase meza.

Le blanc de l’œuf est la solution précipitante, et le bord de la casserole est le périmètre de la cristallisation. Eh bien, idéalement, les trois sont concentriques. La plaque est maintenant prête à être placée dans une zone de stockage à température contrôlée pour la croissance des cristaux.

S’il n’y a plus de plaques à installer, le bloc précipitant doit être retiré du pont du robot, correctement scellé et remis en stock. La seringue contenant le mease est retirée du bras de distribution du robot, démontée de ses différentes pièces, y compris l’aiguille de distribution et le férial. Lavé soigneusement au méthanol et séché en préparation de la prochaine utilisation du robot Meso deux mosquito LCP.

Ce clip vidéo suivant montre le robot LCP mosquito qui peut être utilisé dans la mise en place d’essais de cristallisation en mésocristallisation. Il intègre un système de distribution de phase meph similaire à celui décrit précédemment dans cet article. Pour le premier robot, cependant, le précipitant est distribué à l’aide d’embouts jetables.

L’instrument lui-même est montré ici. Il comprend un pont sur lequel la plaque de cristallisation et le bloc de précipitation fixent une chambre vitrée pour le contrôle de l’humidité. Dans cette vue, les fenêtres de la chambre d’humidité ont été ouvertes : une bobine avec des pointes de distribution, un bras de distribution de mease, un capteur laser pour établir l’emplacement de l’aiguille de distribution de la phase meph.

Une plate-forme surélevée sur laquelle la plaque de cristallisation repose une plate-forme enfoncée pour maintenir le bloc de tamis précipitant. Dans cette séquence, le robot a vu passer par une séquence d’initialisation d’actions lorsque l’instrument est allumé. Un logiciel de programmation est utilisé pour configurer l’instrument afin de travailler avec des plaques de cristallisation et des blocs de précipitant particuliers, et pour distribuer des volumes définis de mease et de précipitant dans une séquence spécifiée.

Ces détails sont fournis par le fabricant et ne seront pas présentés ici. L’utilisation du robot pour mettre en place une plaque de cristallisation commence comme suit, Une seringue Hamilton complète avec une aiguille et remplie de mease chargée de protéines est préparée comme décrit ci-dessus ci-dessous dans meso robot one et dans Jo de 1 7 1 2. La seringue est serrée en position sous le bras de distribution du robot.

Les coordonnées X et Y de l’aiguille sur la seringue de distribution sont établies à l’aide du capteur laser monté sur le pont. Il s’agit d’une étape importante qui est nécessaire pour s’assurer que la mease est distribuée avec précision au centre de chaque puits sur la plaque de cristallisation. D’une simple pression sur un bouton du panneau de commande, la seringue est amorcée pour expulser la mèche de la pointe de l’aiguille.

muse extrudée est ensuite retirée à l’aide d’un mouchoir en papier en vue de l’utilisation du robot pour charger les puits avant de monter la plaque de cristallisation sur le pont du robot. La surface de la plate-forme est humidifiée avec quelques gouttes d’eau pour maintenir la plaque en place. Par capillaire, le couvercle de protection est retiré de la plaque et la plaque est placée fermement sur sa plate-forme pour assurer une bonne adhérence.

Il y a trois repères sur la plate-forme sur lesquels les trois puits d’angle sont centrés bientôt pour assurer le bon positionnement de la plaque par rapport à la pointe de l’aiguille de distribution, l’instrument est maintenant prêt à entrer dans un cycle de configuration. Cela commence par une deuxième étape d’amorçage où le Mease est distribué sur une petite plaque de verre immédiatement avant de passer au chargement de la plaque avec du Mease frais. Dans cette séquence, nous voyons le robot charger d’abord avec du mease, une colonne verticale de huit puits sur la plaque, puis utiliser les embouts jetables pour distribuer une solution précipitante sur le bol de mease.

Ce processus est répété 11 fois sur toute la longueur de la plaque jusqu’à ce que tous les puits soient remplis. L’ensemble du processus prend environ cinq minutes. Dans cette vidéo particulière, 50 nanolitres de Mease et 800 nanolitres de solution précipitante ont été distribués dans chaque puits.

La plaque remplie est retirée de la plate-forme du robot posé sur un banc. Le verre de protection est appliqué et la plaque est scellée avec un soutien-gorge comme décrit ci-dessus ci-dessous dans le robot miso. La plaque correctement étiquetée peut maintenant être placée dans un environnement à température contrôlée pour la croissance des cristaux dans le robot Meso trois, le Griffin LCP.

Ce dernier clip vidéo montre le robot LCP Griffin en cours d’utilisation lors d’essais de mésocristallisation. Le Griffin intègre un système de distribution de phase meph similaire à celui décrit ci-dessus pour le robot. Dans ce cas, cependant, les 96 solutions de précipitation sont distribuées simultanément.

L’instrument lui-même est montré ici. Il comprend un pont sur lequel reposent la plaque de cristallisation et le bloc de précipitation, un bras de distribution de mease et une tête de pointe Phoenix 96. Pour les solutions de distribution de précipitants, le robot en action est montré dans cette séquence vidéo finale.

La tête de pointe 96 est d’abord chargée avec une solution précipitante. Un délai défini par l’utilisateur est prévu pour faciliter l’aspiration des précipitants visqueux. La phase MEA est distribuée séquentiellement dans les 96 puits au cours d’un processus qui prend environ une minute.

Enfin, la tête à 96 pointes distribue simultanément les solutions de 96 précipitants au-dessus des bolus de phase MEA dans les puits de cristallisation. L’ensemble du processus de chargement des plaques est terminé en deux minutes. La plaque remplie est retirée du pont du robot et la plaque est scellée avec un verre de protection et placée dans des conditions de température contrôlée pour la croissance des cristaux.

Les prochaines étapes du processus global de détermination structurée par cristallographie macromoléculaire consistent à récolter et à cryorefroidir les cristaux, ainsi qu’à enregistrer et à traiter la diffraction des rayons X à partir de ceux-ci. Ces sujets sont abordés dans des articles d’emploi distincts dans cette série.I.