Name: 蛍光によるウイルスRNAの検出その場でハイブリダイゼーション（FISH） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学ぶウイルスRNAの蛍光インプラントハイブリダイゼーション法で、感染細胞内のゲノムRNA局在を可視化する技術です。蛍光顕微鏡を用いて細胞内ウイルス輸送メカニズムの理解を深めます。

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著者らは、アドバイスのためにここで説明する手法の開発へとアランコクランへの貢献のためにラボの過去と現在のメンバーに感謝します。 LAは、フレイザー、モナトとマクファーソンキャリア賞でサポートされている保健研究（CIHR）博士フェローシップとAJMのカナダの協会の者です。この作品は、CIHR（助成金＃MOP-56974）からの助成金によってサポートされています。

1。プローブ調製<ol><li>ダイジェスト1時間37℃でのin vitro転写ベクター、PKS（+）POL Kpn1酵素と236nt 9μgの、アガロースゲル上で線状化DNAの製品を実行します。断片は、約2500 bpのでなければなりません。 </li><li>ゲルの断片を切り取り、ロシュ社のマイクロ溶出ゲル抽出キット（使用されるすべての試薬 ​​は、表1に記載されています）を使用して精製する。 30μlの溶出バッファーの最後の溶出を実行します。精製を確認するためにアガロースゲル上で製品の5μlを実行します。 </li><li> 2時間37℃ロシュDIG RNAラベリングキットとインキュベートを用いたin vitro転写反応（下記レシピ参照） に混ぜる。 </li></ol> in vitro転写反応で ： <table border="1"><tbody><tr><td>直鎖状DNA </td><td> 23μlの</td></tr><tr><td> 1X DIG RNAラベリングミックス（ロシュ） </td><td> 4μlの</td></tr><tr><td> 1Xテリグマンnscriptionバッファ</td><td> 8μlの</td></tr><tr><td> 20UのRNase OUT </td><td> 1μlの</td></tr><tr><td> 80U T7 RNAポリメラーゼ</td><td> 4μlの</td></tr><tr><td>合計</td><td> 40μlの</td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> 15分間37℃でのDNase Iとインキュベート228 Uを追加します。 </li><li> 20mMの最終濃度にEDTA pHが8.0を加えることによって反応を停止します。 </li><li>メーカーによって指定されたロシュからクイックスピンカラムを用いて反応を浄化する。 </li><li> 1/10量のDEPC処理3M NaOAc pHが5.2と氷冷95％エタノールを2.5倍量で沈殿させることにより、プローブを精製します。混合し、一晩に30分間-80℃でインキュベートする。 </li><li> 15000×gで4℃15分°Cのためのプローブを遠心分離します。 </li><li>上清を除去し、氷冷70％エタノールでペレットを洗浄する。 15000×gで4℃5分°Cのために再度遠心します。 </li><li>上清を除去し、ペレットを乾燥させます。 50μlのwにペレットを再懸濁し10 UインビトロジェンRNaseを含むOUTアテル（デオキシリボヌクレアーゼ/ RNaseフリー）。 </li><li>吸光光度法によるプローブの濃度（260 nmで測定RNA）を推定し、ng /μLの5の濃度に希釈する。 -20℃でアリコートで店短期使用、または-80℃で長期保存のために。これは、インターアッセイの比較を行うので、このためのアリコートを節約することをお勧めします。 </li></ol> 2。細胞固定<ol><li>収穫時に最終的にコンフルエントには約70〜80％ですので、それは、未処理、滅菌したカバーガラス上にシード付着細胞に最初に重要である。非接着細胞の場合は、通常どおりに成長したときに収集する準備ができて、1時間に0.01％（w / v）のポリ-L-リジン（シグマアルドリッチ社製）で処理したカバースリップでそれらをインキュベートする。典型的な12ウェルのポリスチレン組織培養プレート（3.8 cm 2）のために、150,000細胞（例えば、HeLa細胞）をトランスフェクション前に24時間でメッキされています。非接着細胞は、感染またはトランスフェクトいつものようにと広告を許可することができますここで固定3の前にガラスカバースリップに。 </li><li>メディアを破棄し、1分間蒸留水（DPBS）で調製した1Xリン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄する。ジエチル（DEPC、Sigma-Aldrich社、Inc。）を処理1X PBSは、しかし、未処理のPBSは、それがRNaseの酵素が含まれる場合がありますできないため、使用することができます。 </li><li> PBSを捨て、細胞を完全にカバーするのに十分な4％パラホルムアルデヒドを追加します。 15から20分間インキュベートします。 </li><li> paraformaldeyhydeを破棄し、1分間1X DPBSで細胞を洗浄する。 </li><li> DPBSを捨てて、0.1 Mグリシン（1X DPBSに溶解）を追加します。 10分間インキュベートする。 </li><li>グリシンを破棄し、1分間1X DPBSで細胞を洗浄する。 </li><li> DPBSを破棄し、トリトン-X（1X DPBSに溶解した）0.2％を追加します。 5〜10分間インキュベートします。核小体や核膜タンパク質を染色する場合は5分以上またはタンパク質の局在化のためにトリトンX-100は、拡散になると、透過性。 </li><li>トリトンX-100を破棄し、一度に洗う1分間1X DPBS。 </li><li>長期保存のために、最大4ヶ月までは4℃で70％エタノールストアでPBSを交換してください。また、1X DPBSで複数回洗浄し、FISHに進みます。 </li></ol> 3。 蛍光 in situハイブリダイゼーション （FISH） <ol><li>カバーガラスをエタノールに格納されている場合は、1X DPBSでエタノールを交換し、細胞が30分間再水和することができます。カバーグラスを4℃で保存されている場合は水分補給を一晩行うことができます</li><li> 1分間1X DPBSでカバーガラスを洗浄する。 </li><li>きれいにし、それらをよくラベルに注意しながら上にカバースリップをインキュベートするためにスライドを準備します。 </li><li> 18ミリメートルカバースリップ、スライドにDNase溶液（市販の25単位/カバースリップ）、50μlを加える。それはセル側を下に置き、室温で15分間静置している、カバースリップを追加します。 </li><li> 1分間1X DPBSでカバーガラスを洗浄する。 </li><li>カバースリップあたり50μlのハイブリダイゼーション混合物（以下のレシピを参照してください）​​に追加スライドと42℃16〜18時間のためにカバーガラスの細胞面を下にインキュベート℃にインキュベーションは、50％ホルムアミド、2×SSPEミックス（12.5ミリリットルの脱イオンホルムアミド、2.5ミリリットル20X SSPE、10 mlの水）を含むトレイで実行する必要があります。 </li></ol>ハイブリダイゼーションミックス（1カバースリップのために、50μL）： <table border="1"><tbody><tr><td> 在庫量 </td><td> 材料（最終濃度） </td></tr><tr><td> 25μlの</td><td>ホルムアミド、50％（イオン、任意のソース） </td></tr><tr><td> 5μlの（10 mg / mlの） </td><td> tRNAは、1 mg / mlの（シグマアルドリッチ社） </td></tr><tr><td> 5μlの（20Xの） </td><td> SSPE、2X </td></tr><tr><td> 5μlの（50Xの） </td><td> Denharts、5X </td></tr><tr><td> 0.125μL（5ユニットの） </td><td> RNaseのOUT </td></tr><tr><td> 5μlの（5、25 ngのng /μlに） </td><td>プローブ</td></tr><tr><td> 5μlの</td><td>最終的なをするH 2 O DEPC、ボリュームを50μl </td></tr></tbody></table><ol start="7"><li> 42℃15分間50μlの50％ホルムアミド（1X DPBSで希釈した）℃でインキュベートカバーガラスの細胞面を下</li><li> 5分ごとに42℃で50μlの2X SSPE（20X SSPEは1X DPBSで希釈した）にそれらの細胞側を下にインキュベートすることにより、2X SSPEで二度カバーガラスを洗う</li><li> 1分間1X DPBSにカバースリップを洗ってください。 </li></ol> 4。免疫蛍光染色<ol><li> 30分間、50μlの1Xロシュブロッキング溶液（1×DPBSで希釈した10Xのロシュ社のブロッキング溶液）にそれらの細胞側を下に置くことによって、カバースリップをブロックします。 </li><li> 37℃で1時間50μlの一次抗体溶液にカバーガラスの細胞面を下にインキュベートします。抗DIG抗体は1Xブロッキング溶液中で、製造元の指示に従って希釈する必要があります。他の抗体は、タンパク質を染色するために使用されている場合は、それらが使用されるすべての抗体は、異なるホスト仕様から導出されていれば正しい濃度で添加してもよいIES。 </li><li> 1X DPBSで10分間カバースリップを洗ってください。 </li><li> 37℃で1時間50μlの二次抗体溶液にカバーガラスの細胞面を下にインキュベートします。のAlexa Fluor®標識抗体（Invitrogen）を色の範囲を生成するために使用することができ、1Xブロッキング溶液、1X DPBSで1:500で使用されます。 </li><li> 1X DPBSで10分ごとに倍カバースリップを洗ってください。 </li><li>ワットマン紙の上にカバーガラスの細胞面を上にして乾かします。光と漂白への曝露を避けるために、カバースリップをカバーするようにしてください。 </li><li>すべての液体が蒸発した後、8μlのImmunoMount（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用して、新鮮なスライドにカバースリップをマウントします。静かに気泡を除去するためにカバースリップをタップします。 </li><li>所定の位置に固定するためにカバースリップの端をマニキュア適用されます。 </li><li>顕微鏡技術によるRNAおよびタンパク質の可視化も、この技術の成功に不可欠です。それが鍵となりますので、使用する顕微鏡の設定は、視覚化を助けたり、妨げることができます顕微鏡の設定は正しく設定され、指定された実験では1つのサンプルから別の一貫性を保つことができます。詳細顕微鏡の設定については、光学系と抗体の組み合わせは、参照の1,10を参照してください。 </li></ol> 5。代表的な結果ウイルスRNA染色の例を図2に見ることができます。小細胞punctaeは珍しいものではありませんが、HIV-1ウイルスRNAは、大部分はびまん性に表示された細胞質全体に見られている。特異性は全く蛍光を表示しない周囲の細胞に陽性細胞を比較することによって見ることができます。これは核の明るいシグナルとして可視化することができ、細胞質内RNAの蛍光信号の不足などの導入で述べたように、規制のRevタンパク質を欠いているHIV-1は核内に保持されるRNAを生成します。細胞タンパク質の過剰発現はまた、HIV-1ウイルスRNAの分布をシフトさせることができます。 図2の</強い&gt;、エンドソーム小胞輸送に関与するタンパク質の過剰発現（例えば、RAB7相互作用するリソソーム蛋白質（RILP）11またはN-末端削除RILP（RILPN）11と、ダイニン運動機能を妨げるタンパク質は、[例えばp50/dynamitin 1、 12]は 、FISH分析により決定されたウイルスゲノムRNAの正常な定常状態の局在を妨げるRILP発現は微小管組織の中心（MTOC）13〜ウイルスゲノムRNAの再局在化につながる; RILPN後半分散内のエンドソームダイニンモーター複雑な14 p50/dynamitinブロックダイニンモーターとリリースの大サブユニットの集成 P150にバインドできないために、細胞質は、後期エンドソームでなく、細胞周囲にウイルスゲノムRNAとHIV-1構造タンパク質1（ 図2）ウイルスゲノムRNAの感染性に重要な貢献者の定常状態の局在化の操作は、ウイルス粒子は、治療薬の最終的な開発の鍵となります。我々の手では、ウイルスRNAは、早ければ3時間後にトランスフェクションと感染10などのセルに表示され、12時間することによって、このFISH法により容易に観察可能になります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig1.jpg" /> 図1。 FISH / IFの共同分析のためのプロトコルのフローチャートである。細胞はカバースリップの上に成長し、パラホルムアルデヒドで固定されています。細胞はどちらFISH / IF用に使用したり、ストレージの70％エタノールに格納される前にグリシンおよびTriton-Xの治療が行われます。ストレージ用の脱水細胞はFISH / IFに進む前に1X DPBS（DEPC処理PBS）で再水和されています。細胞はDNase Iで処理し、プローブとハイブリダイズするために一晩放置されています。一度ハイブリダイゼーションが完了すると、細胞は同様にSSPEと同じように、ホルムアミドで洗浄し、最後の1X DPBSリンスされています。ブロッキング液とのインキュベーションに続いて、セルに適用され一次抗体。洗浄後、二次抗体が適用されます。 1X DPBS二最後の洗浄では、イメージングのためのカバースリップ上に乾燥させ、スライド上にマウントされた染色の手順を実行します。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig2.jpg" /> 図2。 FISH / IF共同分析を用いて代表的な結果。）HIV-1は、細胞タンパク質の過剰発現（RILP、p50/DynamitinとRILPΔN（アミノ末端欠失変異体））を引き起こすコンストラクトでHeLa細胞に、いくつかのケースでトランスフェクトされる。 FISH / IF共同分析を行った：RNAを区別するためにG3BPまたはLAMP1（赤）のいずれかで緑色で識別されます。 B）HIV-1はHeLa細胞で発現させ、異なる時点で収集されます。細胞タンパク質のhnRNP A1は、赤色に染色されている間、ウイルスRNAの発現は、緑色で追跡されます。サイズバーは10μmである。画像は、文献1（; RILP、p50/Dynamitin、とRILPでるパネルから選択して数字）から変更、17（パネルB）。

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

FISH / IFの共同分析では、現在9,15,16洗練された細胞内でウイルスRNAを可視化する信頼性の高い方法です。数年にわたって、我々はRNAを染色の洗練された方法を開発した。この手法は、プローブが標的RNA 17に固有のもので設けられたセルの種類の幅広い使用することができます。 DIGプローブを標識することによって、我々は単純な染色によるRNAを可視化することが可能である。 RNAと他のタンパク質を染色するが結合されたときに、FISH / IF共同分析は、細胞の構造と蛋白質/ RNAの局在を観察するための強力なツールになります。 RNA検出の特異性はかなり高いです。これは図2に示されています。ウイルスゲノムRNAの局在化に焦点を当てたオリジナル作品の一部で、FISHは、Revの欠如が核18でウイルスRNAをトラップことを確立した。これ以来、ウイルスゲノムRNAの局在化に関する豊富な新しい情報がtechniquを使用して得られたeは、ここで概説した。過剰発現細胞のタンパク質によって、特定の集団としないウイルスRNAすべてのセルの異なる領域にローカライズするために強制することができます。のhnRNP A2がでsiRNAによって枯渇した場合に得られる表現型HIV-1発現細胞を13に似ているRILPの過剰発現は、RNAが目に見えてMTOCに蓄積させる。 （携帯周囲に細胞内ドメインからのウイルスゲノムRNAのリリースでは、ダイニン重鎖1の結果のp50/Dynamitin過剰発現やノックダウン：ウイルスゲノムRNAはマイナス端モータータンパク質、ダイニンを無効にすることにより、細胞周囲にプッシュすることができます図2）。彼らはもはや積極的にjuxtanuclearドメインに局在しているため、もはやダイニンモーターをバインドされることはありませんRILP、RILPΔNの変異体は、分散するには、細胞質に（LAMP1でタグ付けされた）エンドソーム。これらの結果は、HIV-1ゲノムRNAの、特にプラスチック製の人口の概念を指すようHIV-1ゲノムの異なるプールウイルス複製サイクルの中で時々識別可能な役割と存在するRNA。これらの同じ概念は、すでにこのmRNAによってコードされるタンパク質、ギャグ19の同定されている。 抗体の選択性と可用性に関連するFISH / IFの共同分析の用途に制限があります。一次および二次抗体の最適な組み合わせの最適化、およびそれらの濃度は、（ 表1＆2を参照） を最適化するために時間がかかります。大手企業によるハイブリドーマから作られた、または産生された抗体は、1:2から1:2000にどこでも異なる濃度を持っていますが、最良の結果を得るために製造元から提供されているガイドラインに従ってくださいすることができます。抗体が生成されているホストも考慮の下で撮影する必要があります。ヤギ抗体との混合の羊はまた、クロス種認識（データは示さず）に起因する高いバックグラウンドでこの組み合わせの結果として、一次および二次抗体は避けるべきである。アレクサ·弗素seconda用RY抗体は、濃度は、セットのほぼすべての抗体を1:500で使用することができます。このレポートで説明したようにFISH /共同分析IFへの他の欠点は、細胞を固定し、パラホルムアルデヒドと洗剤（ 図1）を使用して透過された後、それが定常状態でその位置でRNAを捕捉します。 しかし、生細胞内RNAイメージングは、主にGFPなどの蛍光タンパク質でタグ付けされたウイルスRNAゲノムのバリエーションを使用して、手段20から22までのさまざまなを実現しました。しかし、生細胞中のRNAの局在を同定するための追加手段が表面に進みます。これらの新しいメソッドは、ほうれん草23、SNAP 24の手段、またはMTRIP 2タギングRNAを含んでいます。これらの技術はまた部分が顕微鏡でmRNAを検出するためにmRNAをタグ付けするように設計されなければならないこと基板を追加したりする前に、細胞を透過処理するための要件を含むいくつかの欠点がある。確かに、主要なアドバこのレポートで概説したFISH解析のntageは、ネイティブのRNAが最も生理学的に関連性の高い結果につながる不変であるという事実にある。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 18ミリメートルカバースリップ</td><td> VWR </td><td> 48380 046 </td><td></td></tr><tr><td> 16％パラホルムアルデヒド</td><td> JTベーカー</td><td> S898-07 </td><td>百分の四を作るために：5滴NaOHで60°Cで500mLに1XDPBSで20グラムを溶かす。 -20℃で、熱や店舗から7.2へのpH 70を超えないようにしてください°C！ </td></tr><tr><td>トリトン-X </td><td> OmniPur </td><td> 9400 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロ溶出ゲル抽出キット</td><td>ロシュ社</td><td> D6294-02 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNAラベリングミックス</td><td>ロシュ社</td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td>転写T7 RNAポリメラーゼ</td><td>インビトロジェン</td><td> 18033-019 </td&gt; <td></td></tr><tr><td>クイックスピンカラム</td><td>ロシュ社</td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> DNアーゼI </td><td>インビトロジェン</td><td> 18047-019 </td><td></td></tr><tr><td> 1XのDPBS </td><td>ギブコ</td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td> EMD </td><td> FX0420-8 </td><td></td></tr><tr><td> tRNAの</td><td>インビトロジェン</td><td> 15401-021 </td><td></td></tr><tr><td> RNaseのOUT </td><td>インビトロジェン</td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td>蛍光抗体エンハンサーは、DIG検出のための＃4（ブロッキング溶液）を設定します。 </td><td>ロシュ社</td><td> 1768506 </td><td></td></tr><tr><td>のAlexa Fluor®二次抗体</td><td>インビトロジェン</td><td>表2を参照してください。 </td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブン</td><td> Boekel科学他の同種</td><td>モデル24100 </td><td></td></tr><tr><td> Microslides </td><td> VWR </td><td> 48300-047 </td><td></td></tr><tr><td> Immunomount </td><td> Thermoscientific </td><td> 9990402 </td><td></td></tr></tbody></table> 表1特異的試薬および機器の識別<table border="1"><tbody><tr><td> 抗DIG抗体の種（希釈;会社、カタログ番号） </td><td> 色 </td><td> のAlexa Fluor使用（1:500） </td></tr><tr><td rowspan="3">マウス（1:500、Sigma社、B7405） </td><td>緑</td><td>のAlexa Fluor 488ロバ抗マウス（Invitrogen社、A21202） </td></tr><tr><td>赤</td><td> Alexa Fluor 594のロバ抗マウス（Invitrogen社、A21203） </td></tr><tr><td>青</td><td>のAlexa Fluor 647ロバ抗マウス（Invitrogen社、A31571） </td></tr><tr><td rowspan="3">羊（1:200;ロシュ、11376623） </td><td>緑</td><td>のAlexa Fluor 488ロバ抗ヒツジ（Invitrogen社、A11015） </td></tr><tr><td>赤</td><td> Alexa Fluor 594のロバ抗ヒツジ（Invitrogen社、A11016） </td></tr><tr><td>青</td><td>のAlexa Fluor 647ロバ抗ヒツジ（Invitrogen社、A21448） </td></tr></tbody></table> 表2のカタログ番号と濃度で記載されている二次抗体と抗DIGの組み合わせ。

蛍光によるウイルスrnaの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（fish）

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

細胞はウイルス複製のためのエネルギーや資源を流用するのに役立つ正常な細胞機能に固有の変更を誘発感染するウイルス。宿主細胞の機能の多くの側面は、通常、募集宿主細胞タンパク質と機械そのウイルスの遺伝子産物の発現により、ウイルスによって徴用されています。また、de novoの感染時にセルの領域（ターゲットとするモバイル小胞とモータータンパク質の上でウイルスエンジニア特定の膜小器官またはタグを、ウイルス共同OPT分子モータータンパク質は、核を対象とする。以降では、ウイルスの組み立て時に、彼らは携帯電話ハイジャックされウイルスの組み立てに役立ちます機械）。以下は、ウイルスは、特にRNAゲノムを持つものは、タンパク質とRNAの両方のコンポーネントの細胞内輸送を調整し、それらが細胞内の特定の遺伝子座での感染性粒子のアセンブリを達成する方法をどのように理解されています。 RNAの局在化の研究は、以前の仕事に始まりました。 EMは、下等真核生物の開発bryosと神経細胞は、生物学的に重要な情報を提供し、また、遺伝子発現カスケードのプログラミングでRNAの局在化の重要性を強調した。他の生物と細胞システムの研究では、同様の重要な情報が得られている。ウイルスは絶対寄生虫であり、複製するためにそれらの宿主細胞を利用する必要があります。したがって、RNAウイルスが子孫ウイルス粒子1に、核から、核膜孔を介して、細胞質を通って最終的な宛先のいずれかに彼らのRNAゲノムを指示する方法を理解することが重要です。 FISHは、ウイルスRNAの定常状態の局在の変化を識別するために有用なツールとして機能します。免疫蛍光法（IF）の解析22と組み合わせると、FISH / IFの共同分析では、ウイルスRNAの3タンパク質の共局在についての情報を提供します。この分析は、したがって、他の生化学的または生物物理学によってRNA-タンパク質相互作用をテストするための良い出発点を提供しています単独での共局在から4,5のテストでは、相互作用の特定であるための十分な証拠はありません。このような方法を用いてウイルスRNAの局在化の研究に、豊富な情報は、ウイルスと細胞のRNAの人身売買のイベント6の両方で得られている。例えば、HIV-1感染細胞の核内でRNAを生成しますが、RNAは、細胞質に翻訳されています。つのキーウイルスタンパク質が欠落している（改訂）7、ウイルスRNAのFISHは、ウイルス複製のブロックが核8 HIV-1ゲノムRNAの保持によるものであることを明らかにした。 ここでは、 その場でウイルスゲノムRNAの視覚的な分析手法を提案する。方法は、標識したRNAプローブを使用しています。このプローブは、ウイルスのゲノムRNAと相補的になるように設計されています。アンチセンスRNAプローブのin vitro合成中に、ジゴキシゲニン（DIG）で修飾されているリボヌクレオチドは 、in vitro で transcrに含まれていますiption反応。プローブは、細胞内の標的mRNAにハイブリダイズした後にFISH / IFを実行するときに、その後の抗体標識のステップ（ 図1）は、mRNAの局在だけでなく、目的のタンパク質を明らかにする。

蛍光<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）法は視覚的に蛍光顕微鏡を用いてウイルスゲノムRNAを検出するために開発されました。プローブをハイブリダイゼーションと免疫蛍光技術の組み合わせを用いて同定することができるウイルスRNAに特異性で作られています。この手法は、細胞内のウイルスの人身売買のイベントの制御に関する情報を提供し、定常状態でウイルスRNAまたはDNAの局在を同定するという利点があります。

蛍光によるウイルスRNAの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

細胞に感染するウイルスは、ウイルスの複製にエネルギーとリソースを転用させるため、正常な細胞機能に特異的な変化を誘発します。多くの場合...

この手順の全体的な目的は、細胞内におけるウイルスRNAの局在を可視化することです。これを達成するため、まず、トランスフェクションまたは感染させる細胞をガラスカバースリップ上で培養します。次に、トランスフェクションまたは感染が成功した後、4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。次に、RNAを標識するハイブリダイゼーション混合液で細胞をインキュベートします。これは、カバースリップの細胞側を、スライド上のハイブリダイゼーション混合液に接するように置いて行います。この手順の最終ステップは、抗体を用いてRNA標識細胞を染色することです。最終的に、細胞内における標識RNAの局在は、C two hybridizationまたはfishによる蛍光観察で視覚化されます。タグを用いて生細胞内でRNAイメージングを行うなどの他の手法と比較したこの手法の主な利点は、修飾RNAではなく天然のRNAを検出できる点にあります。一般的に、この手法に不慣れな方は、カバースリップの丁寧な取り扱い、方法の標準化、および正確なタイミングの管理が求められるため、習得に苦労することがあります。インキュベーション中、固定のための細胞培養の具体的な手順は、細胞の種類によって異なります。接着性細胞の場合、最初に未処理の滅菌済みガラスカバースリップ上に播種することが重要です。これにより、回収時の最終的なコンフルエンシーが約70～80%になるようにします。非接着性細胞は、回収準備が整うまで標準的な方法で培養してください。その後、poly L lysineで処理したカバーガラスとともにインキュベートします。一般的な12ウェルポリスチレン組織培養プレートの場合、感染またはトランスフェクションの24時間前に、1ウェルあたり150,000個の細胞を播種します。細胞固定の手順を開始するため、カバーガラス上の細胞を37°Cで1時間インキュベートします。培地を慎重に吸引して除去し、二回蒸留水で調製した1×PBSを静かに加えます。または、DPBSで細胞を1分間洗浄します。Diethyl pyrocarbonate（DEPC）処理済みの1×PBSも使用可能です。未処理のPBSにはRNaseが含まれている可能性があるため、使用しないでください。DPBSを除去し、細胞全体を完全に覆うのに十分な量の4%パラホルムアルデヒドを穏やかに追加します。15～20分間インキュベートした後、パラホルムアルデヒドを除去し、DPBSで1分間細胞を洗浄します。DPBSを除去し、0.1 Mグリシンを添加して10分間インキュベートします。次に、グリシンを除去し、DPBSで1分間細胞を洗浄します。DPBSを除去した後、0.2% Triton X 100を加え、5～10分間インキュベートします。核小体または核膜タンパク質を染色する場合は、タンパク質の局在が拡散するため、Triton X 100による透過処理を5分以内に留めてください。魚の処置を開始する前に、Triton X 100を捨て、DPBSで1分間ずつ2回洗浄します。カバーガラスをインキュベートするためのスライドグラスを用意し、十分に洗浄し、ラベルを貼付します。18 mmのカバーガラスを使用する場合、スライドグラスに50 µLのDNA溶液を加えます。この手順で最も困難な点は、カバーガラスの適切な取り扱いです。カバーガラスの正しい面をインキュベートさせ、慎重に取り扱うことが重要です。破損を防ぐため、カバーガラスをスライドガラスに載せ、必ず細胞側を下にして室温で15分間インキュベートします。15分後、カバーガラスの細胞側を上にして、1X DPBSが入った培養皿に入れます。カバースリップを1分間洗浄します。この混合液は以下のように構成されています：50%脱イオンホルムアミド、1 mg/mL tRNA、2X SSPE、5X DNase RNase-free probe、および最終容量50 µLになるまでDEPC処理水で調整したもの。プローブは、ウイルスゲノムRNAに相補的に設計されたジゴキシニン標識RNAプローブです。各カバーガラスの細胞側を、スライド上のハイブリダイゼーション混合液に接するように配置します。インキュベーションは、50% フォルムアミドを含む 2×SSPE 溶液を入れたトレイ内で行ってください。42 °Cで16〜18時間混合インキュベートします。次に、カバーガラスの細胞側を下にして、50% FIDE 50 µL中で42 °Cで50分間インキュベートします。カバーガラスを2 X-SSPEで2回洗浄します。具体的には、カバーガラスの細胞側を下にして、2 X-SSPE 50 µL中で42 °Cでそれぞれ5分間インキュベートします。最後に、カバーガラスを1X DPBSで1分間洗浄します。この手順を開始するには、カバーガラスの細胞側を下にして50 µLの1X Rocheブロッキング溶液に入れ、室温で30分間ブロッキングします。ブロッキングが完了したら、各カバーガラスの細胞側を下にして、実験に必要なすべての一次抗体を適切な濃度で含む50 µLの一次抗体溶液に入れます。37 °Cで1時間インキュベートします。1時間後、カバーガラスの細胞側を上にし、DPPSを含む培養皿に入れ、10分間洗浄します。次に、カバーガラス1枚につき50 µLの二次抗体溶液をスライドガラスに分注します。Alexa Fluor結合抗体を使用するとさまざまな色を生成でき、1xブロッキング溶液および1x DPBSを用いて1:500に希釈して使用します。各カバーガラスの細胞側を二次抗体溶液に浸し、37 °Cで1時間インキュベートします。カバーガラスを10分間ずつ2回洗浄します。DPBSで洗浄後、細胞の付着面を上にしてブロッティングペーパーの上で乾燥させます。光への曝露および退色を防ぐため、必ずカバーガラスを遮光してください。液体がすべて蒸発した後、カバーガラスを新しいスライドガラスに載せます。8 µLの封入剤を使用して、カバーガラスを軽く叩いて気泡を取り除き、カバーガラスの端にマニキュアを塗って固定します。顕微鏡技術によるRNAおよびタンパク質の可視化も、本手順を成功させるために不可欠です。使用する顕微鏡の設定によって、可視化の精度が向上する場合もあれば低下する場合もあります。したがって、顕微鏡の設定を正しく行い、ある実験におけるサンプル間で一貫性を保つことが重要です。この図に、ウイルスRNAの可視化と免疫蛍光染色によるタンパク質の局在についての代表的な結果を示します。HeLa細胞にHIV-1を導入したこの最初のパネルでは、緑色で標識されたHIV-1のウイルスRNAが細胞質全体に拡散して分布しているのが見られますが、小さな細胞質内の点状構造が見られることも珍しくありません。特異性は、ウイルスRNA染色のみを示す白黒の挿入画像に示されているように、陽性細胞と蛍光を示さない周囲の細胞を比較することで確認できます。赤色の染色は、Ross GAPSH3ドメイン結合タンパク質（G3BP）の免疫蛍光を示しており、調節タンパク質であるRev proteinを欠いたHIV-1をHeLa細胞に導入した場合、主に細胞質を標識します。産生されたウイルスRNAは核内に保持されます。これは、核における明るい緑色のシグナルと、細胞質におけるRNA蛍光シグナルの欠如として視覚化できます。HIV-1ウイルスRNAの分布は、特定の細胞タンパク質の過剰発現によっても変化します。例えば、エンドソーム小胞輸送に関与するタンパク質であるRAB7相互作用リソソームタンパク質（RLIP）を過剰発現させると、緑色で追跡されたウイルスゲノムRNAが微小管形成中心へと再局在化します。ここでは、エンドソームがLAMP1によってタグ付けされ、赤色に染色されています。対照的に、ダイニンモーター複合体のp150gluedに結合できないアミノ末端欠損型delta Nを過剰発現させると、後期エンドソームが細胞質内に分散します。p50 dyneinの過剰発現は、ダイニンモーターの大サブユニットをブロックして後期エンドソームを放出させますが、同時にウイルスゲノムRNAおよびHIV V1構造タンパク質も細胞辺縁部へと放出させます。HIV-1をHeLa細胞で発現させ、その後、異なる時点で細胞を回収して解析すると、ウイルスRNAはトランスフェクションおよび感染後、早ければ3時間で細胞内に現れ、12時間までにはこのFISH法によって容易に観察できるようになります。ここでは、ウイルスRNAの発現を緑色で、細胞タンパク質であるH-N-R-N-P-A 1を赤色で染色して追跡しています。この手法に習熟し適切に実施すれば、1日目は20分、2日目は4時間半で完了させることができます。本手順を行う際は、カバーガラスを破損させないよう慎重に取り扱うこと、および二次抗体を適用した後は遮光を徹底することが重要です。HIV-1やその他の高レベルの病原体を取り扱う際、固定前は極めて危険であるため、本手順の実施にあたっては、適切なトレーニングや封じ込めなどの予防措置を必ず講じてください。

detection-of-viral-rna-by-fluorescence-in-situ-hybridization-fish

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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蛍光その場で</emヒト精子の>ハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル

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蛍光によるウイルスRNAの検出

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