Un flux de travail de remise en forme Analyse quantitative

L’objectif de cette procédure est de capturer des valeurs quantitatives de culture microbienne en parallèle à l’échelle du génome de manière précise et à haut débit. Ceci est accompli en commençant par Turing et une bibliothèque de colonies microbiennes dans des plaques à 96 puits et en augmentant la culture jusqu’à saturation. Ensuite, les cultures saturées sont diluées dans de l’eau, puis repérées sur des plaques de gélose solide.

Ensuite, les plaques solides sont photographiées périodiquement et jusqu’à ce que la croissance de la colonie microbienne soit saturée. Enfin, les photographies de l’évolution temporelle de la croissance de chaque culture sont converties en mesures quantitatives de la densité cellulaire et les courbes de croissance observées avec des modèles de croissance et des mesures quantitatives de la valeur adaptative microbienne sont résumées. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent des preuves d’interactions génétiques en démontrant que les souches microbiennes ont des valeurs adaptatives différentes, soit lorsqu’elles sont combinées à différentes mutations, soit cultivées dans des conditions différentes.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les méthodes d’épinglage à haute densité telles que SGA ou les expériences de compétition de codes-barres, est que les mesures de fitness sont plus précises. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement de médicaments anticancéreux, telles que quels gènes et processus sont importants dans la réponse aux dommages à l’ADN et le contrôle du cycle cellulaire, la compréhension et l’application de ces recherches et les micro-organismes fondamentaux sous la forme de cibles médicamenteuses potentielles dans les cellules cancéreuses humaines. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la fonction des télomères et de la visi.

Il peut également être appliqué à d’autres domaines de la biologie des levures ou à tout domaine où les phénotypes de fitness peuvent donner un aperçu de la biologie microbienne. Nous espérons que QFA pourra être appliqué à de nombreux autres organismes microbiens pour lesquels il existe des bibliothèques de puces. Par exemple, povi e coli, orilla surplus À partir de cultures nocturnes saturées jouées jusqu’à 96 souches de levure indépendantes dans des volumes de 200 microlitres de milieu liquide riche.

Dans une boîte bien cultivée, stérilisez une réplique manuelle de 96 broches, un huitième de pouce de diamètre en la trempant d’abord dans de l’éthanol à 100 %, puis en la flambant et en la laissant refroidir, 200 microlitres d’eau stérile dans les puits d’un vortex de plaque de 96 puits a saturé les cultures de levure et diluez en trempant l’outil à goupille stérilisé dans les souches trois fois. Ensuite, une fois dans la plaque contenant l’eau, stérilisez l’outil à goupille et laissez-le refroidir avant de le plonger trois fois dans les cultures diluées. Transférez ensuite le téton dans une plaque de gélose solide.

Après avoir incubé les plaques de gélose, utilisez un imageur SP de robotique s et p pour les imager manuellement en vue d’une culture automatisée. Commencez avec un éventail rectangulaire de souches de levure indépendantes cultivées sur de l’agar solide. Dans cet exemple, les souches de départ sont le résultat du croisement d’une mutation de requête sensible à la température avec la collection de délétion de levure

1 536 cultures représentant quatre répétitions de 384 souches de levures indépendantes sont cultivées sur des plaques SGA à l’aide d’un robot équipé d’un outil à goupille stérile de 96 broches d’un millimètre de diamètre Transfert de 384 des 1 536 souches en 4 96. Des plaques de culture contenant 200 microlitres de milieu sélectif font pousser les cultures à 20 degrés Celsius jusqu’à saturation. Pour repérer les cultures de levure saturées, commencez par les transférer dans un robot de manipulation de liquides, et Resus, en les suspendant sur un agitateur magnétique, diluez les cultures à environ une à 70 en utilisant un outil robotique stérile à 96 broches pour épingler dans 200 microlitres d’eau stérile.

Après avoir nettoyé et stérilisé l’outil à goupille, placez les cultures diluées sur des plaques de gélose. En format 384, transférez les plaques vers un incubateur humidifié à température contrôlée avec un carrousel automatique et une trappe d’accès. Pour imager les cultures, utilisez un imageur automatisé robotisé, qui retire à plusieurs reprises les plaques de l’incubateur, retire les couvercles, les transfère dans un espace uniformément éclairé sous une caméra de 35 millimètres, capture une image à 5, 184 par 3, 456.

La résolution en pixels remplace le couvercle, puis le renvoie dans le carrousel de l’incubateur pour suivre les emplacements des cultures sur les plaques et les traitements qui leur sont appliqués. Les plaques sont automatiquement code-barres en fonction du nom de l’incubateur, de la température, du numéro de lot séquentiel unique et de la position dans l’incubateur. Les noms d’image sont une concaténation du nom de la plaque et de l’horodatage et sont générés automatiquement lors de la capture d’image.

Les plaques sont souvent étiquetées manuellement pour s’assurer qu’elles restent dans le même ordre lors du transfert entre les carrousels de robots. Les fichiers de métadonnées sont des fichiers texte délimités par des tabulations, qui sont générés manuellement. Le fichier de description expérimentale FT deux.

La première table est unique à chaque expérience, mais la bibliothèque de description FT trois, la première table peut être largement réutilisée. Une fois construite, l’expérience est décrite dans le fichier de description expérimentale FT deux table un contenant des colonnes pour le code-barres ou le nom de la plaque généré automatiquement, le début de l’expérience, l’horodatage du traitement de la plaque, le contenu du traitement de la gélose solide, le nom de l’écran, le numéro de la plaque de bibliothèque pour les bibliothèques avec plusieurs plaques et un numéro de quadrant répété pour la réduction de 1, 536, du format de puits à 384. La bibliothèque de souches e est décrite à l’aide d’un fichier de description de bibliothèque FT trois, le tableau un indiquant le génotype cultivé dans chaque lieu de culture.

Dans chaque plaque d’une bibliothèque, elle contient les colonnes quatre, le nom de la bibliothèque, l’ORF, la plaque d’immatriculation de la plaque, la colonne de la plaque de ligne et une colonne de notes facultative. Un fichier facultatif de nom de gène standard peut être fourni FT quatre, le tableau un décrivant le nom de gène standard associé à chaque numéro ORFY systématique, identifiant les souches criblées. Ce fichier contient deux colonnes, ORF et nom du gène pour l’analyse des données.

Le flux de travail de calcul QFA nécessite l’accès à une station de travail informatique multicœur raisonnablement puissante sur laquelle est installé. L’outil logiciel d’analyse d’images du colonisateur et le progiciel QFAR, tous deux documentés en ligne, sont disponibles gratuitement et fonctionnent sur une gamme de systèmes d’exploitation. Exécutez le coloniseur avec chacune des images de plaque capturées en entrée, générant un fichier de sortie du coloniseur FT cinq, la table un pour chaque image capturée des fichiers de sortie du colonisateur, spécifiez les estimations de densité de culture, la culture, la surface, la forme et la couleur.

Pour chacun des 384 emplacements de la plaque d’image, un nom de fichier de sortie est automatiquement copié à partir du nom de fichier image source. Le package QFAR contient des fonctions qui permettent de chronométrer les cours pour chaque culture afin d’ajuster les modèles de population logistiques généralisés aux observations et de tracer des graphiques. Les deux voir les figures deux et trois à titre d’exemple.

Les valeurs de paramètres ajustées sont écrites dans les fichiers de paramètres logistiques QFA. Le package QFAR contient également des fonctions pour le contrôle de la qualité. Les colonies de bord sont éliminées en raison de la plus grande disponibilité des nutriments sur les bords de la plaque et de la difficulté d’analyse des images.

Près des parois des plaques et des cultures, qui ont échoué à la SGA et les génotypes présentant une liaison avec des gènes marqueurs spécifiques au criblage sont retirés de l’analyse. Plusieurs mesures quantitatives de la valeur adaptative sont dérivées des paramètres du modèle de population logistique pour chaque culture. Il s’agit notamment des taux maximaux de doublement de la population et du nombre de divisions entre l’inoculation et la saturation pour chaque ensemble de cultures répétées et pour chaque définition de la valeur adaptative.

Plusieurs statistiques sommaires d’estimations de la valeur adaptative sont calculées : valeur adaptative moyenne et moyenne, écart-type de valeur adaptative et nombre de répétitions observées. Les statistiques récapitulatives sont transmises aux fichiers récapitulatifs de la condition physique QFA FT huit, tableau un pour une analyse plus approfondie. Par exemple, les calculs des scores d’interaction génétique FT neuf table un.

Cette figure montre une courbe de croissance typique sur une échelle logarithmique OUTTA 384 QFA. Cultures poussant à 20 degrés Celsius sur gélose solide telle que quantifiée par le colonisateur avec une augmentation de la densité cellulaire détectable pour la première fois après environ deux jours. Ce retard est probablement l’effet combiné d’une phase de décalage de culture après l’inoculation sur un milieu solide et d’une limite inférieure de détection pour la densité cellulaire.

Ici, 308 courbes de croissance similaires ont été capturées à partir d’une seule plaque. Notez que les souches qui produisaient une ligne plate étaient très malades ou mortes. Cette figure illustre la comparaison de deux cribles QFA à l’échelle du génome pour déduire les forces d’interaction génétique.

Le progiciel QFAR comprend également des fonctions permettant de produire la courbe de croissance précédente et de produire des listes classées des génotypes examinés et des estimations de la force de l’interaction génétique. Associé à une valeur Q pour la signification du SIG observé, une fois maîtrisé un QF complet à quatre réplications à l’échelle du génome. Une expérience peut être terminée en trois semaines. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’être organisé dans le suivi et le nommage de toutes les plaques et images.

Toutes les plaques doivent être inoculées et placées dans le bon sens et dans l’ordre suivant. L’analyse des données repose sur l’exactitude des fichiers texte auxiliaires construits par le scientifique expérimental. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’estimer la valeur adaptative de milliers de cultures microbiennes indépendantes.

Les valeurs adaptatives sont estimées en photographiant à plusieurs reprises des cultures tachetées, en poussant sur des plaques de gélose solides, en convertissant les images capturées en estimations de la densité cellulaire et en générant des courbes de croissance. La modélisation mathématique des courbes de croissance fournit des estimations quantitatives de la valeur adaptative, qui peuvent ensuite être utilisées pour déduire les relations fonctionnelles entre les produits géniques à l’échelle du génome.