Name: הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים במבחנה כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: למדו לזהות אתרי השהייה בתרגום לאורך ה-mRNA באמצעות בידוד פוליפפטידים מתהווים על ריבוזומים במבחנה. השיטה משלבת תרגום בתא, סנטיפוגציה ואלקטרופורזה בג'ל SDS-PAGE לניתוח אוטורדיוגרפי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי תוכנית מדע האדם Frontier מענק RGP0024.

1. תבנית ה-DNA הכנה בתעתיק חוץ גופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגן של הריבית מתחת T7 לשכפל ו / או למשל SP6 האמרגן תעתיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכן שעתוק במבחנה DNA התבנית לינארית עם אנזים הגבלה מתאים לחיתוך במורד הזרם של קודון עצירה ORF ו / או ה-mRNA סוף &#39;3. יש צורך לאמת את לינאריזציה מלאה של DNA פלסמיד על ידי הפעלת המוצר העיכול מגבלה על ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפלסמיד לינארית משמש בתגובה שעתוק במבחנה. ריכוז שונה של DNA התבנית ניתן לבדוק לזהות ריכוז ה-DNA האופטימלי הנדרש ב שעתוק במבחנה. בדרך כלל, עם ערכת MEGAscript של Ambion תמלול, תפוקה גבוהה (Ambion / Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק), ה-DNA 1 מיקרוגרם לינארית מניב 40-60 מיקרוגרם של ה-mRNA. בתעתיק חוץ גופית נעשית בעקבות הוראה של היצרן (Ambion / Life Technologies, גרנד Islanד, ניו יורק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות בתעתיק חוץ גופית mRNA מטוהרים על ידי משקעים ליתיום כלוריד על פי הוראה של היצרן (MEGAscript תמלול העליון Ambion ערכת תשואה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלמות mRNA מאומת עוד יותר על ידי אלקטרופורזה על ג&#39;ל acrylamide או agarose. </li></ol> 2. Cell תרגום במבחנה חינם עבור בתרגום חוץ גופית באמצעות R abbit R eticulocyte lysate, RRL (Promega, מדיסון, WI) בצע את הפעולות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100 μl בהוראה התגובה במבחנה התרגום הבאה של היצרן. בקצרה, במים nuclease חינם להוסיף 2 חומצות אמינו μl תערובת מינוס מתיונין (1 מ&quot;מ), 10 יחידות של RNase אינהיביטור (Invitrogen / Life טכנולוגיות, גרנד איילנד, ניו יורק), 20 μCi של רדיואקטיבי [35 S]-מתיונין (Biomedicals מגה פיקסל, סולון, OH), 70 μl של הארנב Reticulocyte lysate (Promega, מדיסון, ויסקונסין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הדואר התגובה על 30 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות מראש תגובה חמה תרגום. הוסף 2 מיקרוגרם של ה-mRNA לתגובה תרגום דגירה על 30 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את התגובה על ידי הנחת התגובה התרגום על הקרח. </li></ol> 3. הבידוד של פוליפפטידים המתהווה מ בתגובה תרגום חוץ גופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד פוליפפטיד המתהווה חייב הריבוזומים (polysome), התגובה התרגום שכבות על גבי 4.5 מ&quot;ל של גליצרול 30% ב 10 mM Tris-HCl pH 7.6 חיץ, המכיל 100 מ&quot;מ KCl, 10 mM MgCI 2, centrifuged ב 100.000 X g בתוך הרוטור TLA-110 (Beckman Coulter, Inc, ברי, CA) עבור שעות 1 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Supernatant הוא עוד יותר להסיר בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה המכילה polysomal פוליפפטידים המתהווה הוא resuspended בנפח קטן (10-15 μl) של 1 mM Tris-HCl pH 7.6 המאגר, המכיל 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ribonuclease (Invitrogen / Life טכנולוגיות, גרנד איילנד, ניו יורק), ו מודגרות עבור 30 דק &#39;ב 37 ° C. על מנתכדי לשפר את הידרוליזה של peptidyl-tRNA אסתר בונד, NaOH מתווסף הריכוז הסופי של 10 מ&quot;מ, ו הדגירה נמשך 30 דקות נוספות. </li></ol> במבחנה התגובה התרגום כינס ללא mRNA וביצע באותם תנאים (ואחריו בידוד של פפטידים המתהווה כפי שתואר) ישמש שליטה מרכזי. טיפול התגובה התרגום (ים) עם puromycin לפני העמדת תמצית כדי צנטריפוגה שיפוע צפיפות עשוי לשמש מלאה נוספת. 4. פתרון פוליפפטיד ינוקא על טריס-tricine SDS PAGE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוליפפטידים המתהווה מבודדים נפתרות ונותחו על טריס-tricine SDS-PAGE. יש לציין כי כמות החומר טעון על ג&#39;ל יהיה תלוי היעילות של תיוג חלבון, יעילות על תרגום חלבונים רבים פרמטרים אחרים. כמות של חומר טעון צריך להיות מותאם באופן אמפירי כדי לאפשר את BESויזואליזציה לא והפרדה של בודדים רשתות פוליפפטיד המתהווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ג&#39;ל אלקטרופורזה קבועים, מיובשים באמצעות ואקום ג&#39;ל דייר ו נתון autoradiography. הפצה של פוליפפטידים המתהווה הם נצפו באמצעות phosphoimaging. </li></ol> 5. נציג תוצאות שור Gamma-B Crystallin תורגם על lysate Reticulocyte הארנב וכן א &#39; coli S30 תמצית מערכות (Promega, מדיסון, WI) ולאחריו בידודו של שרשרות פוליפפטיד המתהווה. איור 1 מתאר את השלבים הכרוכים בבידוד של הריבוזום רשתות המתהווה הנכנס. במחקר הנוכחי המטרה היתה לבדוק, אם משנים את הסביבה של הרפרטואר של התרגום כלומר tRNAs (ידוע להיות שונה באופן משמעותי יונקים (RRL) ו פרוקריוטים (E. coli) מערכות בשל הבדלי דעה קדומה קודון בין אורגניזמים) יכול לשנות את תנועת הריבוזום לאורך ה-mRNA ותוצאה והפצה של אתרי להשהות תרגום.תנועת הריבוזום שינה צריך להביא לשינויים בהתפלגות הגדלים של פוליפפטידים המתהווה המצטברים במהלך התרגום, כמו גם בעוצמות היחסיות שלהם. העוצמות היחסיות של להקות משקפים את משך הזמן של שתיקה. פוליפפטידים המתהווה בודדו והחליט על 16.5% T, 6% C טריס-tricine SDS PAGE (איור 2). Gamma-B Crystallin הוא חלבון 20 kDa. תצפית של פוליפפטידים המתהווה של לא זהים אורכי ועוצמות ב RRL וא &#39; מערכות קולי עולה כי תנועת ריבוזומים לאורך ה-mRNA של שתי מערכות אלו כדלקמן קינטיקה תרגום שונות. לדוגמה, צפינו בלהקה בולט של 17.7 kDa ב א coli lysate ולא במערכת RRL, דבר המצביע על כך שיש אתר נוסף להשהות translational באזור 3&#39;-end של ה-mRNA (קידוד בטרמינל C-באזור של גמא ב Crystallin), כאשר היא מתורגמת א &#39; coli המערכת. נציין כי Gamma-B Crystallin נמלים במקביל Arg קודונים (AGG 153 ו AGA 154) כי הם תכופים במערכות יונקים, אך ידועים להיות נדיר ביותר ותורגם לאט א &#39; coli. פפטיד הרומן המתהווה צבירת ה מערכת coli (~ 17.7 kDa איור 2.2) נגרמת ככל הנראה על ידי הריבוזום משתהה ליד אלה קודונים טנדם נדירים. שים לב לא ניתן לראות להקות בהעדר mRNA (איור 2.3), וכי הטיפול puromycin מסיר את רוב רשתות המתהווה של polysomes (איור 2.3). טיפול ממושך עם puromycin (&gt; 15 דקות) מסיר את כל רשתות המתהווה (מידע לא מוצג). זו מאשרת את המוצרים פוליפפטיד שנצפו הם הריבוזום רשתות המתהווה נלווים, ולא mRNPs cosedimenting עם polysomes. כאמור, הטיה קודון הוא אורגניזם כמו גם ברקמות ספציפיות. דוגמה מייצגת המתואר כאן, משקף את שינוי הסביבה של הרפרטואר של התרגום כלומר tRNAs / קודוןהטיה יכולה להוביל תנועה שונה של הריבוזום לאורך ה-mRNA. ככל הנראה, טכניקה פשוטה זו לא רק לאפשר זיהוי האתרים הפסקה של תרגום לאורך ה-mRNA, אלא גם מאפשר השוואה מהירה של להשהות אתרי תרגום בין מערכות שונות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4026/4026fig1.jpg" /> באיור 1. סכמטי להסביר את שלבים בידוד הריבוזום פוליפפטידים המתהווה הנכנס. שור Gamma-B Crystallin רצף ORF (528 זוגות בסיסים) שוכפלה במורד הזרם של האמרגן T7 ב pBSKS +. שכן שעתוק במבחנה DNA התבנית לינארית על ידי טיפול זה עם EcoRI. תבנית לינארית שימש ב שעתוק במבחנה. האמרגן T7 בתבנית ה-DNA הוא מוכר על ידי RNA פולימראז T7 כי מעתיק את הגן במורד Gamma-B Crystallin. mRNA מטוהרים באמצעות ליתיום כלוריד שיטת משקעים. MRNA מטוהרים משמש בתרגום חוץ גופית. הבאהדגירה, התגובה התרגום שכבות על גבי פתרון גליצרול 30% ו centrifuged עבור שעות 1 על 4 מעלות צלזיוס ב 100.000 X גרם לבודד הריבוזום פוליפפטידים המתהווה הנכנס. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4026/4026fig2.jpg" /> איור 2. הבידוד של פוליפפטידים שור Gamma-B Crystallin המתהווה המתורגמים הארנב Reticulocyte lysate (RRL) וא &#39; lysate coli. 2 mRNA מיקרוגרם היה מעורב בתגובה 100 μl המכיל RRL או E. coli S30 תמצית מערכת (Promega, מדיסון, ויסקונסין) על פי הוראה של היצרן עם 20 μCi [35 S]-מתיונין מודגרות על 30 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הדגירה הבאה התגובה התרגום שכבות על גבי 4.5 מ&quot;ל של גליצרול 30% ב 10 mM Tris-HCl pH 7.6 המאגר, המכיל 100 מ&quot;מ KCl, 10 mM MgCI 2, centrifuged במשך שעה 1 ב 4 ° C ו-X 100.000 גרם TLA-110 הרוטור (Beckman Coulter, Inc, ברי, קליפורניה). מבודד polyribosome גלולה היה resuspended ב μl 20 מתוך 1 mM Tris-HCl pH 7.6, המכיל 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ribonuclease (Invitrogen / Life טכנולוגיות, גרנד איילנד, ניו יורק) ואחריו טיפול עם NaOH (כמתואר בסעיף בפרוטוקול). פוליפפטידים המתהווה נפתרו על 16.5% T, 6% C טריס-Tricine ג&#39;ל SDS PAGE. ג&#39;ל היה יבש וחשוף עבור autoradiography. בעקבות חשיפת ג&#39;ל נסרק באמצעות סורק הדמיה טייפון של GE Healthcare. איור 2.1 מראה את הג&#39;ל עם פוליפפטידים המתהווה מבודדים נפתרה לאחר התגובות תרגום לעשות זאת בשתי מערכות שונות (RRL ו E. coli). איור 2.2 ג&#39;ל נותח על ידי תמונה קוואנט TL ., תוכנה v2005 ומשומשים כאן כדוגמה כדי להראות את המשקל בעוצמה מולקולרית של פוליפפטידים המתהווה המצטבר בשתי המערכות ניתן לנתח בקלות לעומת איור 2.3 מציג את שתי מערכות בקרה: פוליפפטידים המתהווה מבודדים והחליט בעמוד SDS לאחר התרגום התגובות נאספוללא mRNA ו / או אחרי התגובות תרגום טופלו puromycin (5 דק &#39;, קונצרט כלשהו הסופי. 1 מ&quot;מ) לפני התגובה היה נתון צנטריפוגה.

<ol><li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li>
<li>Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon+usage+patterns+in+Escherichia+coli%2C+Bacillus+subtilis%2C+Saccharomyces+cerevisiae%2C+Schizosaccharomyces+pombe%2C+Drosophila+melanogaster+and+Homo+sapiens%3B+a+review+of+the+considerable+within-species+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity.</a> Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).</li>
<li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2, e221(2006).</li>
<li>Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon+usage+and+tRNA+content+in+unicellular+and+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms.</a> Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).</li>
<li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).</li>
<li>Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonuniform+size+distribution+of+nascent+globin+peptides%2C+evidence+for+pause+localization+sites%2C+and+a+cotranslational+protein-folding+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model.</a> J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).</li>
<li>Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synonymous+codon+substitutions+affect+ribosome+traffic+and+protein+folding+during+in+vitro+translation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation.</a> FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).</li>
<li>Komar, A. A., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+translation+of+%CE%B3+B+crystallin+and+its+circularly+permutated+variant+in+an+in+vitro+cell-free+system%3A+possible+relations+to+codon+distribution+and+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Kinetics of translation of γ B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding.</a> FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).</li>
<li>Jha, S., Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth%2C+life+and+death+of+nascent+polypeptide+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Birth, life and death of nascent polypeptide chains.</a> Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).</li>
<li>Thanaraj, T. A., Argos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-mediated+translational+pause+and+protein+domain+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization.</a> Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).</li>
<li>Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%22silent%22+polymorphism+in+the+MDR1+gene+changes+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity.</a> Science. 315, 525-528 (2007).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li>
<li>Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Translating+Ribosomes+Containing+Peptidyl-tRNAs+for+Functional+and+Structural+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses.</a> J. Vis. Exp. (48), e2498(2011).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

לקבלת תוצאות לשחזור, איכות ריכוז המרכיבים המשמשים ב שעתוק במבחנה תרגום התגובות הן קריטיות. במחקר הנוכחי השתמשנו ערכות זמינים מסחרית ותמציות המספקים נתונים לשחזור ביותר, אם מטופל בזהירות. עם זאת, תרגום, המוסמכות תמציות ניתן להכין מתא הבחירה של האדם, במידת הצורך. האיכות של ה-mRNA יכול להשפיע על התרגום, ולכן הוא בעל חשיבות עליונה לבחון את תקינות mRNAs לפני השימוש בו במהלך בתרגום חוץ גופית. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direct...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / Kit </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 ערכת גבוהה תמלול תשואה </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> Ribonuclease אינהיביטור </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> חוצה [35 S]-Label </td><td> מגה פיקסל Biomedicals </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> Ribonuclease- </td><td> Invitrogen </td><td> 12091 </td></tr><tr><td> הארנב מערכת Reticulocyte lysate, התייחס nuclease </td><td> Promega </td><td> L4960 </td></tr><tr><td> E. coli S30 תמצית מערכת תבניות לינאריות </td><td> Promega </td><td> L1030 </td></tr><tr><td> צנטריפוגה </td><td> Beckman Coulter </td><td> אופטימה ultracentrifuge TLX </td></tr><tr><td> אחסון זרחן autoradiography </td><td> GE Healthcare </td><td> טייפון 9410 במצב משתנה imager </td></tr><tr><td> תוכנה לניתוח פוליפפטיד המתהווה </td><td> GE Healthcare </td><td> תמונה קוואנט TL, v2005 </td></tr></tbody></table>

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mrna

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

קצב התארכות translational היא לא אחידה. mRNA מבנה משני, שימוש קודון ו-mRNA חלבונים הקשורים סילוף תנועת הריבוזום על הודעה של חוות דעת ראה 1. עם זאת, זה עתה מקובל כי השימוש קודון נרדף הוא הגורם העיקרי שאינם אחידים שיעורי התארכות של תרגום 1. קודונים נרדפים לא משמשים בתדירות זהה. ההטיה קיימת בשימוש קודונים נרדף כמה קודונים בשימוש בתדירות גבוהה יותר מאחרים 2. קודון ההטיה היא אורגניזם כמו גם רקמה ספציפית 2,3. יתר על כן, תדירות השימוש קודון עומד ביחס ישר ריכוזי tRNAs מאותו מקור 4. לפיכך, קודון שימוש תכוף יהיה רב יותר של tRNAs המתאימים, אשר נוסף מצביע על כך קודון תכופים יתורגם מהר יותר מאשר 1 נדירים. כך, אזורים על mRNA המועשר קודונים נדירים (אתרי להשהות פוטנציאליים) יהיה בדרך כלל להאט את תנועת הריבוזום על מסהGE ולגרום הצטברות של פפטידים המתהווה של גדלים בהתאמה 5-8. אתרים אלה יכולים להשהות השפעה תפקודית על ביטוי החלבון, יציבות ה-mRNA ו קיפול חלבונים לבדיקה לראות 9. אכן, הוכח כי הקלה של אתרי להשהות כאלה יכולים לשנות את תנועת הריבוזום על ה-mRNA, ובהמשך עשוי להשפיע על היעילות של קיפול (in vivo) שיתוף translational חלבון 1,7,10,11. כדי להבין את התהליך של קיפול חלבונים in vivo, בתא, כי הוא יחד בסופו של דבר לתהליך של סינתזה של חלבון זה חיוני כדי לקבל תובנות מקיפות אל ההשפעה של השימוש בתוכן / tRNA קודון על תנועת ריבוזומים לאורך ה-mRNA במהלך התארכות translational . כאן אנו מתארים טכניקה פשוטה, שניתן להשתמש בהם כדי לאתר הגדולות להשהות תרגום אתרי ה-mRNA ניתן לתרגם בתא ללא מערכות שונות 6-8. הליך זה מבוסס על בידוד של המתהווה פוליפפטידים accumulating על הריבוזומים במהלך בתרגום חוץ גופית של mRNA המטרה. הרציונל הוא כי בתדירות נמוכה קודונים, עלייה בזמן מגוריו של תוצאות ריבוזומים בכמות מוגברת של פפטידים המתהווה של בגדלים המתאימים. ב-mRNA חוץ גופית עיבד משמש במבחנה תגובות של תרגום בנוכחות חומצות אמינו שכותרתו רדיואקטיבית כדי לאפשר זיהוי של רשתות המתהווה. כדי לבודד את הריבוזום מתחמי קשורות פוליפפטיד המתהווה התגובה התרגום שכבות על גבי פתרון גליצרול 30% ואחריו צנטריפוגה. פוליפפטידים המתהווה ב polysomal גלולה מטופלים נוספים עם ribonuclease והחליט על ידי SDS. טכניקה זו יכולה לשמש פוטנציאל של חלבון כל ומאפשר ניתוח של תנועת הריבוזום לאורך ה-mRNA לבין זיהוי האתרים להשהות הגדולות. בנוסף, פרוטוקול זה ניתן להתאים ללמוד גורמים ותנאים שיכולים לשנות תנועת הריבוזום ובכך באופן פוטנציאלי יכול גם לשנות את הדואר פונקציה / קונפורמציה של החלבון.

טכניקה לזהות אתרים על הפסקה של תרגום ה-mRNA מתואר. הליך זה מבוסס על בידוד של פוליפפטידים המתהווה המצטברים על הריבוזומים במהלך בתרגום חוץ גופית של mRNA המטרה, ואחריו ניתוח בגודל של רשתות המתהווה באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה denaturing.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

קצב ההארכה התרגומית אינו אחיד. מבנה שניוני של mRNA, שימוש בקודונים וחלבונים הקשורים ל-mRNA עשויים לשנות את תנועת הריבוזום על ה...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לזהות ולאתר אתרי השהיה תרגומית עיקריים עבור mRNA המתורגם במערכת תרגום נטולת תאים. דבר זה מושג תחילה על ידי שיבוט הגן הרלוונטי תחת בקרתו של מקדם שעתוק T7. לאחר מכן, ה-mRNA משתכפל ומטהר.לאחר מכן, מתבצע תרגום in vitro בנוכחות mRNA וחומצות אמינו רדיואקטיביות כדי לסמן את החלבון המסונתז ואת הפוליפפטידים המתהווים. לבסוף, הפוליסומים מבודדים באמצעות סנטריפוגה במהירות שיקוע, והשרשראות המתהוות המבודדות מופרדות באמצעות אלקטרופורזה בג'ל. כתוצאה מכך, ניתן לקבל תוצאות המראות פוליפפטידים מתהווים באורכים שונים באמצעות Tristine SDS page ואוטורדיוגרפיה, דבר המעיד על נוכחותם של אתרי עצירה (pause sites) לאורך ה-mRNA הנבדק.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון micro cocal nucleus protection assay, הוא שהיא פשוטה, מהירה ויעילה ביותר, ומאפשרת קביעה וזיהוי של אתרי התרגום העיקריים לאורך כל MNA במערכת תאיה נתונה. שיטה זו יכולה לסייע במענה על חלק מהשאלות המרכזיות בתחום התרגום וקיפול חלבוני תרגומי, כגון כיצד גורמים כגון שימוש בקודונים, שכיחות TNA ו/או מבנה שניוני של mRNA עשויים להשפיע על קינטיקת התרגום. שיטה זו עשויה להסב תועלת נוספת להבנתנו את הקשרים שבין קינטיקת התרגום לבין השלבים המרכזיים במסלול קיפול החלבון בתרגום הקוד.ההשלכות של טכניקה זו נשמעות על הבנת תהליך קיפול החלבונים in vivo, אשר לפי האמונה הרווחת מתרחש באופן קו-טרנסלציונלי במהלך התרגום בריבוזום, אף שבעבודה הנוכחית נעשה שימוש בתרגום ללא תאים של gamma bicrystalline באמצעות תמצית תאים זמינה מסחרית. ניתן להחיל טכניקה זו גם לזיהוי IDE טרנסלציונליים פוטנציאליים בכל חלבון, תוך שימוש בתמצית בעלת יכולת תרגום שהוכנה מכל מקור תאי. באופן כללי, מי שאינו מכיר את השיטה יתקשה בשני שלבים מרכזיים של הפרוטוקול.הדבר הראשון הוא קביעת הזמן הכולל הנדרש להרצת תגובת התרגום, מה שיבטיח שמרבית הפוליפפטידים הנסתרים (nascent polypeptides) יישארו קשורים לריבוזום. הדבר השני הוא מציאת מערכת הפרדה מתאימה כדי לבודד את מרבית הפוליפפטידים הנסתרים; בחירת מערכת ההפרדה תלויה בגודל החלבון הנחקר. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר החלטנו לבחון את קינטיקת התרגום של מולקולות הגלובין באמצע שנות השמונים, בהקשר למודל המוצע של קיפול תרגומי קו-טרנסלציונלי (COT) של גלובין.חוסר האחידות של תרגום הגלובין הובחן לראשונה על ידי PRO ו-Maurice בשנת 1974 בעת שימוש בכרומטוגרפיית CLO של חסימת גודל עבור שרשראות הגלובין NAS. עם זאת, הניתוח שלהם לא היה בעל הדיוק הרצוי; Pro ו-more הבחינו בארבעה אתרי כוח תרגומיים עיקריים במהלך תרגום הגלובין. לאחר מכן, הניתוח שלנו אפשר לחשוף כ-10 אתרי כוח נוספים ולהבנות מודל מפורט של קיפול הגלובין התרגומי. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הטכניקה המתוארת כאן כוללת בידוד של פוליסומים וניתוח של פוליפפטידים נולדים באמצעות ג'ל Tri S Ds page.שני שלבים אלה קריטיים להשגת תוצאות באיכות גבוהה ובשחזוריות. הדגמה של הפרוג'ל תתבצע על ידי סטודנט לתואר מתקדם ממעבדתו של Sujata For עבור תעתוק במקום (in vitro transcription) של RNA שליח. התחל עם גן עניין ששוכפל תחת פרומוטר T7 ו/או SP6; בעזרת אנזים הגבלה מתאים, לינאריז את תבנית ה-DNA במורד מקודון העצירה ו/או מקצה ה-3' של ה-mRNA.מדגם של עיכול הרסטריקציה יעבור אלקטרופורזה בגל של אגרוז כדי לוודא שה-DNA לינארי לחלוטין. לאחר קביעת ריכוז תבנית ה-DNA האופטימלי, השתמש בערכה לטרנסקריפציה כדי לבצע טרנסקריפציה של mRNA in vitro בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, השתמש בשיקוע באמצעות ליתיום כלוריד כדי לטהר את ה-mRNA.לאחר מכן, השתמש באלקטרופורזה של ג'ל אקרילאמידה או אגרוז כדי לאמת את טהרתו. הכן תגובת תרגום in vitro בנפח 100 µL במים נקיים מנוקלאז על ידי הוספת תערובת חומצות אמינו בריכוז 1 mM ללא methionine, 10 units של מעכב RNA, 20 µCi של 35 S methionine רדיואקטיבי וליזאט רטיקולוציטים של ארנב. לאחר מכן, חמם מראש את התגובה על ידי הדגרה בטמפרטורה של 30 °C למשך חמש דקות.לאחר מכן, הוסיפו 2 µg של mRNA והדגרימו בטמפרטורה של 30 °C למשך חמש דקות כדי לעצור את התגובה, והניחו על קרח כדי לבודד פוליפפטידים ראשוניים (nascent polypeptides) הקשורים לריבוזומים. שכבו את תגובת התרגום מעל 4.5 mL של 30% glycerol ב-Tris-HCl pH 7.6 עם potassium chloride ו-magnesium chloride, תוך שימוש בצנטריפוגה עם rotor TLA 110 ב-100,000 ×g למשך שעה ב-4 °C. לאחר מכן, הסירו בזהירות את העלייה (supernatant), ושעלקו מחדש את משקע הפוליסומים המכיל פוליפפטידים ראשוניים בנפח קטן של 1 mM Tris-HCl buffer pH 7.6 המכיל 0.5 mg/mL של ribonuclease A, והדגרימו למשך 30 דקות ב-37 °C.כדי להגביר את ההידרוליזה של קשר האסטר של ה-TRNA בפפטיד, הוסף נתרן הידרוקסיד בריכוז סופי של 10 millimolar לתגובה והדגרה אותה למשך 30 דקות נוספות. הפרד את הפוליפפטידים הצעירים באמצעות Tris-Tricine SDS-PAGE, ולאחר מכן קבע וייבש את הג'לים. העבר את הג'לים לאוטורדיוגרפיה, ולאחריה לדימות פוספורי (phospho imaging) לצורך זיהוי הפוליפפטידים הצעירים.תנועה משתנה של הריבוזום המושרה על ידי שינויים במאגר ה-TRNA צריכה להוביל לשינויים בהתפלגות הגדלים של פוליפפטידים צעירים המצטברים במהלך התרגום, וכן בעוצמות היחסיות שלהם, המשקפות את משך ההפסקה בנקודה זו. פוליפפטידים צעירים עבור חלבון ה-gamma B crystalline בודדו והופרדו באמצעות Tristine SDS page. האורכים והעוצמות השונים של הפוליפפטידים במערכות RRL ו-e coli מעידים כי תנועת הריבוזומים לאורך ה-mRNA בשתי מערכות אלו עוקבת אחר קינטיקת תרגום שונה.לדוגמה, שימו לב לפס הבולט של 17.7 kilodalton בליזאט של e coli, שאינו קיים במערכת הליזאט של רטיקולוציטים של ארנב. Gamma B crystalline מכילה קודוני ארגנין רצופים הנפוצים במערכות של יונקים, אך ידועים כנדירים ביותר ומתורגמים באיטיות ב-e coli, מה שמרמז כי פס זה נגרם על ידי עצירה של הריבוזום בקודונים נדירים רצופים אלו, כפי שמוצג כאן.לא ניתן להבחין בפסים בהיעדרו של mRNA, וטיפול ב-puromycin מסיר את רוב השלשלאות הנסמכות מהפוליסום. בנוסף, טיפול ממושך ב-puromycin מסיר את כל השלשלאות הנסמכות, מה שמאשר כי תוצרי הפוליפפטיד שנצפו הם שלשלאות נסמכות הקשורות לריבוזום ולא MRPs השוקעיםร่วม עם הפוליסום. ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן לבצעה בתוך יום עד יומיים. משך הפרוצדורה תלוי בעיקר במשך שלב הסנטריפוגציה ובשלב האלקטרופורזה של הפפטידים הנסמכים בג'ל.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להפסיק את תגובת התרגום מיד לאחר זמן הדגירה. כדי למנוע שחרור של פוליפפטיד ראשוני (nascent polypeptide) מהריבוזום, קריטי להימנע מחשיפה ל-RNAs בכל שלב. זיהום ב-RNAs עלול להשפיע על יעילות התרגום של התמצית ולהוביל לשחרור של הפוליפפטיד הראשוני מהריבוזום בעקבות ביצוע פרוצדורה זו.ניתן לבחון לאחר פיתוחה גם מטרות אחרות, כגון השפעתם של חלבונים נקשרי mRNA על יעילות תנועת הריבוזום על מסר נתון. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום קיפול חלבונים לחקור את תפקידה של השהיית התרגום הנובעת מנוכחותם של קודונים נדירים במהלך קיפול חלבונים תרגומי. טכניקה זו הועסקה בעבר לבחינת תפקידן של החלפות קאון בתנועת הריבוזום על מסר ובקיפול חלבונים תרגומי.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של האופן שבו ניתן לזהות אתרי כוח תרגומיים של mRNA המוצג על ידי בידוד פוליפפטיד גדל (nascent polypeptide) הקשור לריבוזום. זכרו כי עבודה עם איזוטופים רדיואקטיביים וחומצות אמינו מסומנות, כגון למשל $^{35}\text{S-methionine}$, מחייבת נקיטת אמצעי זהירות מיוחדים ויש להתחשב בכך תמיד בעת ביצוע פרוצדורה זו.

isolation-ribosome-bound-nascent-polypeptides-vitro-to-identify

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מכשול משמעותי מנתח ביוכימיים של הריבוזומים המכיל המתהווה peptidyl-tRNAs כבר נוכחות של הריבוזומים אחרים דגימות אותו, ריבוזומים לא מעורב בתרגום של רצף ה-mRNA ספציפי להיות מנותח. פיתחנו מתודולוגיה פשוטה כדי לטהר, בלעדי, את הריבוזומים המכיל את המתהווה peptidyl-tRNA של עניין.

בידוד של הריבוזומים תרגום המכילים Peptidyl-tRNAs עבור ניתוח פונקציונלי מבנית

המתואר כאן טכניקה כיום בשימוש שגרתי לבודד קשורות ביציבות הריבוזום מתחמי הרשת המתהווה (RNCs). שיטה זו מנצלת את הגילוי כי 17 חומצות אמינו ארוכה SecM "מעצר רצף" יכול לעצור את התארכות תרגום פרוקריוטים...

באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח שינויים בייזום של תרגום ה-mRNA של תאי אוקריוטים בתגובה למצבי לחץ. שיטה זו מבוססת על הפרדת המהירות בשיפועי סוכרוז של תרגום ריבוזומים מהריבוזומים שאינם תרגום.

ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

פרוטוקול זה ממחיש שינויים מהותיים בחלוקת polyribosome כדי ללמוד translatome של in vivo דגימות במערכת העצבים המרכזית. זה מאפשר הערכה הגלובלית של רגולציה תרגום ותעתיק דרך הבידוד והשוואה של רנ"א הכל לריבוזום שברי RNA מאוגד.

בחקירתו vivo של Translatome מערכת עצבים המרכזי על ידי Polyribosome היפוך חלוק

הריבוזומים לשחק תפקיד מרכזי בסינתזה של חלבונים. חלוקה Polyribosome (polysome) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות סוכרוז מאפשרת קביעה ישירה של יעילות תרגום של mRNAs הבודד בקנה מידת הגנום כולו. בנוסף, בשיטה זו ניתן להשתמש לצורך הניתוח ביוכימי של הריבוזום וגורמים הקשורים polysome כגון מלווים ומולקולות איתות.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

היכולת של תאים להסתגל ללחץ היא קריטית להישרדותם. ויסות תרגום mRNA הוא אסטרטגיית הסתגלות כזו, המספקת ויסות מהיר של הפרוטאום. כאן, אנו מספקים פרוטוקול פרופיל פוליזום סטנדרטי לזיהוי mRNAs ספציפיים המתורגמים באופן סלקטיבי בתנאי לחץ.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

כתב יד זה מתאר שיטה כדי להמחיש ולכמת תרגום לשפות אחרות אירועים בתאים subcellular. הגישה המוצעת כתב יד זה דורש מערכת הדמיה קונאפוקלית בסיסית, ריאגנטים, והוא מהיר וחסכוני.

Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

אנו מציגים טכניקה לייצוב מהיר של מתחמים תרגומיים (ביוסינטזה של חלבונים) עם קשרים צולבים פורמלדהידים בתאי שמרים ויונקים חיים. הגישה מאפשרת לנתח מתווכים ארעיים ואינטראקציות דינמיות של RNA:חלבון. ניתן להשתמש במתחמים המקושרים ביישומים מרובים במורד הזרם, כגון בשיטות פרופיל מבוססות רצף עמוק, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסה.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

אינטראקציות של תרגום משותף ממלאות תפקיד מכריע בשינויים בשרשרת המתהווה, במיקוד, בקיפול ובמסלולי הרכבה. כאן, אנו מתארים פרופיל ריבוזום סלקטיבי, שיטה לניתוח ישיר של in vivo, של אינטראקציות אלה במודל eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

זיהוי גלובלי של רשתות אינטראקציה בין תרגומים משותפים על ידי פרופיל ריבוזום סלקטיבי

ALIBi (ALIBi) היא שיטה חדשה שמופעלת אופטוגנטית שפותחה לתיוג וטיהור אוכלוסיות תת-תאיות של ריבוזומים לצורך ריצוף וניתוח פרוטאומי במורד הזרם וניתוח פרוטאומי.

בידוד תת-אוכלוסיות ריבוזום תת-תאיות בהתבסס על ביוטינילציה מוגברת במיקום ספציפי לתג פפטיד רקומביננטי - תאורה מוגבלת -

למדו לזהות אתרי השהייה בתרגום לאורך ה-mRNA באמצעות בידוד פוליפפטידים מתהווים על ריבוזומים במבחנה. השיטה משלבת תרגום בתא, סנטיפוגציה ואלקטרופורזה בג'ל SDS-PAGE לניתוח אוטורדיוגרפי.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים

גלה סרטונים נוספים