Protocole de collecte des pancréas humain

L'objectif général de cette procédure est de disséquer le pancréas humain de manière à préserver l'orientation anatomique. Cela est réalisé en retirant le duodénum et la rate du pancréas, puis en éliminant les excès de graisse et de vaisseaux du pancréas. La deuxième étape consiste à appliquer de l'encre bleue sur la surface antérieure et de l'encre noire sur la surface postérieure.

Ensuite, le pancréas est divisé en trois régions. Chaque région est ensuite tranchée transversalement en tranches régulières et placée dans des cassettes à paraffine, des moules OCT ou broyée davantage et placée dans des flacons. Finalement, des échantillons sont prélevés des trois régions du pancréas, tout en maintenant l'orientation anatomique correcte pour les analyses ultérieures.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans la recherche sur le diabète de type 1, telles que les mécanismes sous-jacents à la perte de masse ou de fonction des cellules bêta, ainsi qu'à la nature de l'attaque des cellules immunitaires. La démonstration visuelle de la méthode de traitement du pancréas est cruciale, car le maintien de l'orientation in vivo du pancréas exige une attention méticuleuse aux détails. La procédure sera démontrée par Linda Snyder, technicienne en histologie, et Emily Montgomery, scientifique en biologie, de mon laboratoire.

Commencez par préparer tous les matériaux nécessaires à la procédure. Étiquetez d'abord les cassettes qui contiendront les blocs de paraffine avec un identifiant du donneur, le type d'échantillon, le numéro d'aliquot et toute autre information complémentaire. Ensuite, étiquetez les moules en OCT de la même manière.

Découpez suffisamment de morceaux de papier d'aluminium pour envelopper chaque bloc OCT et mettez-les de côté pour une utilisation ultérieure. Préparez tous les flacons nécessaires pour stocker les échantillons frais et congelés. Ajoutez ultérieurement de l'ARN et du milieu RPMI selon les besoins.

Ensuite, préparez les zones de travail, placez les planchettes de dissection, les instruments stérilisés et tous les autres fournitures nécessaires à la procédure à la fois dans une hotte de sécurité biologique et sur un plan de travail. Disposez tous les cassettes et moules OCT par ordre d'utilisation à proximité. Préparez un bain de congélation en ajoutant suffisamment d'isopentane pour recouvrir la glace sèche au fond d'une boîte en polystyrène.

Pour commencer la dissection, retirez le duodénum et la rate. Commencez à séparer le duodénum et le pancréas à une extrémité, puis poursuivez jusqu'à ce qu'ils soient complètement détachés. La rate est faiblement attachée et peut être facilement retirée de la graisse et du pancréas.

Ensuite, nettoyer le pancréas des vaisseaux graisseux et des nerfs accessoires à l’aide d’une combinaison de dissection émoussée et tranchante. Mettre de côté la graisse et les ganglions lymphatiques afin de les traiter ultérieurement. Une fois nettoyé, placer le pancréas sur une planche de dissection recouverte de serviettes en papier.

Le maintien de l'orientation correcte du pancréas est l'aspect le plus difficile de cette procédure. Pour assurer le succès, les surfaces antérieure et postérieure sont enduites d'encres de couleurs différentes. Trempez un applicateur en coton dans de l'encre bleue, étalez l'encre sur la surface antérieure du pancréas et absorbez l'excédent.

Ensuite, trempez un nouvel applicateur dans de l'encre noire et étalez-la sur la surface postérieure du pancréas. Replacez le pancréas dans son orientation normale. Avec la surface antérieure orientée vers le haut, le pancréas est maintenant prêt à être découpé en trois sections.

Tout d'abord, sectionnez la jonction entre la tête et le corps. Ensuite, divisez la portion restante en parties approximativement égales afin de séparer le corps et la queue, puis enregistrez le poids de chaque région du pancréas, en commençant par la section de la tête.

Divisez chaque région en sections d'environ 0,5 centimètre en effectuant des coupes transversales, de manière similaire à la découpe d'une miche de pain. Une fois que chaque région du pancréas a été tranchée, retirez la dernière section de la région de la tête, c'est-à-dire la section de jonction tête-corps, et placez-la sur une planchette de dissection séparée. Hachez finement cette section en petits morceaux et répartissez les morceaux équitablement entre des cryotubes étiquetés avec ou sans ARN.

Ensuite, les vials sont congelés. Suivre les procédures standard. Répéter cette procédure pour la section de jonction corps-queue.

Une fois les échantillons hachés collectés, incliner toutes les coupes transversales vers la droite. Des coupes alternées de chaque région seront retirées. Pour les blocs en paraffine et en OCT, retirer la première coupe destinée au blocage en paraffine.

Si un fragment est trop grand, divisez-le en deux. Étiquetez les cassettes A et B. Si le morceau est encore trop grand, coupez chaque section perpendiculairement à la coupe précédente, puis étiquetez les cassettes de A à D dans le sens horaire. Comme indiqué ici, positionnez le cassette de sorte que l'étiquette se trouve à gauche.

Ensuite, placez le tissu dans la cassette et fermez le couvercle. Transférez la cassette dans un récipient contenant du formol tamponné neutre. Numérotez le bloc séquentiellement au sein de chaque région, en commençant par la section la plus médiale pour les blocs OCT.

Verser une fine couche de milieu OCT dans un moule préalablement étiqueté. Avant d'introduire le tissu, recouvrir celui-ci de milieu OCT et congeler rapidement l'échantillon pour une utilisation ultérieure, en revenant au tissu mis de côté précédemment. Isoler les ganglions lymphatiques pancréatiques en éliminant les tissus adipeux et conjonctifs entourant la capsule du ganglion. Placer les ganglions dans une boîte stérile contenant du DMEF, puis hacher les ganglions de grande taille en morceaux ne dépassant pas 0,5 centimètre.

Une fois les ganglions lymphatiques pancréatiques isolés, répartir le tissu entre les flacons et cassettes préparés pour un traitement ultérieur. Après avoir terminé les ganglions lymphatiques, hacher la rate et la conserver de manière similaire. Pour traiter le duodénum, utiliser un tampon de gaze humide pour nettoyer la muqueuse des mucosités, découper la muqueuse et la sectionner ensuite en morceaux.

Divisez les échantillons de muqueuse comme indiqué précédemment. À l’aide de cette procédure, des échantillons représentatifs de chaque région du pancréas sont collectés, comme illustré ici. Les poids des régions de la tête, du corps et de la queue étaient approximativement égaux.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de traiter un pancréas humain en différents types d'échantillons, notamment de la capacité à préserver l'orientation, ainsi que de la méthode d'isolement des ganglions lymphatiques à partir de la graisse péripancréatique.