Protocole de collecte des pancréas humain

L’objectif global de cette procédure est de disséquer le pancréas humain de manière à maintenir l’orientation anatomique. Ceci est accompli en retirant le duodénum et la rate du pancréas, puis en éliminant l’excès de graisse et les vaisseaux du pancréas. La deuxième étape consiste à peindre la surface antérieure avec de l’encre bleue et la surface postérieure avec de l’encre noire.

Ensuite, le pancréas est divisé en trois régions. Chaque région est ensuite coupée transversalement en plaques égales et placée sur des cassettes de paraffine, des moules OCT ou hachée davantage et placée dans des flacons. En fin de compte, des échantillons sont prélevés dans les trois régions du pancréas, tandis que l’orientation anatomique correcte est maintenue pour une analyse future.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la recherche sur le diabète de type un, telles que les mécanismes sous-jacents à la perte de masse ou de fonction des cellules bêta et la nature de l’attaque des cellules immunitaires. La démonstration visuelle de la méthode de traitement du pancréas est essentielle, car le maintien de l’orientation in vivo du pancréas nécessite une attention particulière aux détails. Linda Snyder, technologue en histologie, et Emily Montgomery, biologiste dans mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.

Commencez par préparer tout le matériel nécessaire à la procédure. Tout d’abord, étiquetez les cassettes qui contiendront les blocs de paraffine avec un identifiant de donneur, le type d’échantillon, le numéro d’aliquote et toute information supplémentaire. Ensuite, étiquetez les moules OCT de la même manière.

Coupez suffisamment de morceaux de papier d’aluminium pour envelopper chaque bloc OCT et mettez-les de côté pour une utilisation ultérieure. Préparez tous les flacons nécessaires à la conservation des échantillons frais et congelés. Ajouter l’ARN plus tard et le milieu RPMI le cas échéant.

Ensuite, préparez les zones de travail, placez les planches de dissection, les instruments stérilisés et toutes les autres fournitures nécessaires à la procédure dans une cagoule de biosécurité et sur un comptoir. Disposez toutes les cassettes et tous les moules OCT par ordre d’utilisation. Proche. Créez un bain glacial en ajoutant suffisamment d’isop pentane pour couvrir la glace sèche au fond d’une boîte en polystyrène.

Pour commencer la dissection, retirez le duodénum et la rate. Commencez à séparer le duodénum et le pancréas à une extrémité, et continuez jusqu’à ce qu’ils soient complètement détachés. La rate est lâchement attachée et s’enlève facilement de la graisse et du pancréas.

Ensuite, nettoyez le pancréas des vaisseaux graisseux et des nerfs étrangers à l’aide d’une combinaison de dissection émoussée et nette. Mettez de côté la graisse et les ganglions lymphatiques pour qu’ils soient traités plus tard. Une fois nettoyé, placez le pancréas sur une planche de dissection recouverte d’essuie-tout.

Le maintien de l’orientation correcte du pancréas est l’aspect le plus difficile de cette procédure. Pour assurer le succès, les surfaces antérieure et postérieure sont peintes avec des encres de couleurs différentes. Trempez un applicateur à embout de coton dans de l’encre bleue, étalez l’encre sur la surface antérieure du pancréas et épongez l’excédent.

Ensuite, trempez un nouvel applicateur dans de l’encre noire et étalez-le sur la surface postérieure du pancréas. Remettez le pancréas dans son orientation normale. Avec la surface antérieure vers le haut, le pancréas est maintenant prêt à être coupé en trois sections.

Tout d’abord, coupez la jonction entre la tête et le corps. Ensuite, divisez la portion restante en portions à peu près égales pour séparer le corps et la queue, enregistrez le poids de chaque région du pancréas. En commençant par la section de la tête.

Divisez chaque région en sections d’environ 0,5 centimètre en coupant de manière transversale, comme si vous coupiez une miche de pain. Une fois que chaque région du pancréas a été tranchée, retirez la dernière section de la région de la tête, qui est la section de jonction du corps de la tête, et placez-la sur une planche de dissection séparée. Hachez cette section en petits morceaux et répartissez-les uniformément entre des flacons cryogéniques marqués avec et sans ARN.

Plus tard, les flacons sont ensuite congelés. Suivre les procédures standard. Répétez cette procédure pour la section de jonction de la queue du corps.

Une fois les échantillons hachés collectés, inclinez toutes les sections transversales vers la droite. Les sections alternées de chaque région seront supprimées. Pour les blocs de paraffine et OCT, retirez la première section pour le blocage de la paraffine.

Si une section est trop grande, coupez-la en deux. Étiquetez les cassettes comme A et B.Si la pièce est encore trop grande, coupez chaque section perpendiculairement à la coupe précédente, puis étiquetez les cassettes de A à D dans le sens des aiguilles d’une montre. Comme on le voit ici, positionnez la cassette de manière à ce que l’étiquette soit à gauche.

Ensuite, placez le mouchoir dans la cassette et fermez le couvercle. Transférez la cassette dans un récipient contenant du formin tamponné neutre. Numérotez le bloc de manière séquentielle dans chaque région, en commençant par la section la plus médiane pour les blocs OCT.

Versez une fine couche de média OCT dans un moule pré-étiqueté Avant d’introduire le tissu, recouvrez le tissu avec un média OCT et congelez rapidement l’échantillon pour une utilisation ultérieure en le retournant dans le tissu qui a été mis de côté plus tôt. Isolez les ganglions lymphatiques pancréatiques en enlevant la graisse et le tissu conjonctif entourant la capsule ganglionnaire. Placez les nœuds dans un plat stérile contenant du DMEF hacher les gros nœuds en morceaux ne dépassant pas 0,5 centimètre.

Une fois les ganglions lymphatiques pancréatiques isolés, répartissez le tissu entre les flacons et les cassettes préparés pour un traitement ultérieur. Après avoir terminé les ganglions lymphatiques, la rate est hachée et stockée de la même manière. Pour traiter le duodénum, utilisez un tampon de gaze humidifié pour essuyer la muqueuse du mucus, coupez la muqueuse, puis coupez-la en sections.

Divisez les échantillons de muqueuse comme indiqué précédemment. À l’aide de cette procédure, des échantillons représentatifs de chaque région du pancréas sont prélevés, comme on le voit ici. Les poids de la tête, du corps et de la queue étaient à peu près égaux.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de traiter un pancréas humain en différents types d’échantillons, en particulier la capacité de maintenir l’orientation, ainsi que la façon d’isoler les ganglions lymphatiques de la graisse péripancréatique.