L'isolement et la caractérisation des cellules dendritiques et les macrophages de l'intestin de souris

L’objectif global de cette procédure est d’isoler rapidement les cellules dendritiques intestinales de souris et les macrophages pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle. Ceci est accompli en prélevant d’abord du tissu intestinal. La deuxième étape consiste à dissocier l’épithélium intestinal du Lamin propria.

Ensuite, le Lamin Propria intestinal est digéré au cours des dernières étapes de la procédure. Les cellules Lamin propria sont colorées avec de la fluorescence, des anticorps conjugués et des cellules fermées pour des populations cellulaires spécifiques. En fin de compte, les populations intestinales de DC et de macrophages peuvent être caractérisées et purifiées avec plus de précision pour des études fonctionnelles visant à évaluer la présentation de l’antigène de production de cytokines et la régulation des cellules immunitaires.

Ainsi, le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que la rapidité de la digestion tissulaire garantit une expression optimale de l’antigène de surface cellulaire, la viabilité cellulaire et/ou cellulaire. Après avoir euthanasié la souris et confirmé la mort par le réflexe de pincement des orteils, testez la pulvérisation d’éthanol à 70 % sur l’abdomen et le thorax de l’animal. Ensuite, utilisez une paire de ciseaux pour faire une petite incision horizontale au milieu de l’abdomen et décollez la peau pour exposer le péritoine.

Ouvrez le péritoine à l’aide de ciseaux après avoir coupé le sphincter pilo pour séparer l’estomac de la partie supérieure de l’intestin grêle et à l’aide d’une pince pour enlever le mésentère. Coupez à nouveau au niveau de la valve iléo-caecale pour libérer tout l’intestin grêle du gros intestin. Continuez à séparer le mésentère du gros intestin et faites une incision au niveau de la bordure anale.

Utilisez des ciseaux pour ouvrir le côlon longitudinalement et utilisez C-M-F-P-B-S à température ambiante pour laver le contenu fécal et le mucus de la lumière intestinale. Ensuite, utilisez les ciseaux et la pince pour macroscopiquement. Disséquez les plaques de bûchers le long de la surface anti-mésentérique de l’intestin grêle et ouvrez l’intestin grêle longitudinalement.

Ensuite, nettoyez la lumière de l’intestin grêle du contenu fécal et du mucus avec plus de température ambiante C-M-F-P-B-S. Séparément, coupez l’intestin grêle et le gros intestin en morceaux d’environ 1,5 centimètre et placez les morceaux dans des tubes coniques individuels de 50 millilitres contenant 30 millilitres de C-M-F-H-B-S-S d’avant-guerre avec FBS et deux millimolaires EDTA. Placez chaque tube conique de 50 millilitres horizontalement dans un agitateur orbital en secouant les tubes à 250 tr/min pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, placez une passoire en fil de fer sur un seau à déchets. Versez le contenu de chaque tube conique de 50 millilitres à travers le grillage pour récupérer les morceaux d’intestin, puis placez-les dans de nouveaux tubes coniques individuels de 50 millilitres contenant 30 millilitres de Préchauffage C-M-F-H-B-S-S avec FBS avec EDTA deux millimolaires. Enfin, remettez les tubes dans l’agitateur orbital pendant 20 minutes de plus.

Après le deuxième tour de secousse, versez le contenu de chaque tube à travers la passoire. Encore une fois, tamponnez l’excès de média à l’aide d’une serviette en papier, puis transférez les morceaux d’intestin dans un petit bateau de lactosérum en plastique. L’aspect le plus difficile de cette technique est la digestion des tissus pour assurer le succès, tous les différents paramètres de la durée de la digestion, les propriétés de la collagénase, l’intégrité des tissus et la taille du tissu à digérer doivent tous être pris en compte à l’aide de ciseaux rapidement.

Hachez les morceaux d’intestin, puis ajoutez l’intestin haché dans un tube conique de 50 millimètres contenant 20 millilitres de solution de collagénase. Placez le tube conique horizontalement dans l’agitateur orbital et digérez les morceaux d’intestin à 200 tr/min pendant 10 à 20 minutes à 37 degrés Celsius. Maintenant, vortex brièvement le tube pour assurer une dissociation complète de tout tissu intestinal restant, puis filtrez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 100 microns directement dans un tube conique de 50 millilitres.

Enfin, complétez le tube conique avec C-M-F-H-B-S-S avec FBS et centrifugez la solution cellulaire deux fois pendant cinq minutes à 425 fois G à quatre degrés Celsius. Versez ensuite le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans du C-M-F-H-B-S-S glacé avec FBS et placez les échantillons sur de la glace. Après coloration des cellules pour les protéines de surface d’intérêt.

Commencez par créer un graphique à points excluant les cellules qui sont positives pour la coloration des cellules mortes, comme illustré ici. Ensuite, excluez les événements doublet comme indiqué ici et ici. Utilisez maintenant les canaux de diffusion avant et latéral pour cibler les cellules d’intérêt, en veillant à exclure les débris.

Créez ensuite un autre diagramme de points sur l’antigène CD 45 positif et l’antigène IAB positif. La présentation des cellules dans un graphique à points séparé crée des régions permettant de distinguer des sous-ensembles spécifiques de DC et de macrophages. La région R one illustrée ici capture les cellules négatives ternes CD 11 C positives CD 11 B.

La région R deux délimite les cellules qui ont un niveau d’expression de surface similaire pour le CD 11 C que les cellules de la région R un, mais qui expriment également le CD 11 B. Les régions R trois désignent les cellules qui sont CD 11, B positif et CD 11 C négatif terne. Ces trois régions peuvent être analysées plus en détail pour l’expression de F, quatre, 80 et CD, 1, 0, 3 afin de différencier les populations de macrophages et de CD, respectivement. Comme le montre ce graphique à points, les cellules négatives ternes CD 11 C positives CD 11 B dans la région R un exprimeront des niveaux élevés de l’alpha ein CD 1 0 3 et des niveaux faibles de F quatre 80.

Ce diagramme à points montre que les cellules CD 11 B positives pour CD 11 C positives dans la région R deux seront composées à la fois de DCS et de macrophages en fonction de leur expression dichotomique de CD 1 0 3 et F quatre 80. Enfin, sur la base de leur profil phénotypique F quatre 80 positif et CD 1 0 3 négatif R trois, les cellules CD 11 B B positives CD 11 C del négatives seront constituées de macrophages, la relation entre la durée de la digestion tissulaire sur le rendement cellulaire total et l’expression de CD 11 B et CD 11 C est illustrée dans les six figures suivantes. Le tissu intestinal qui est digéré pendant trois minutes produit un faible nombre total de cellules, ce qui se traduit par un faible nombre de dcs et de macrophages disponibles pour la caractérisation La digestion des tissus pendant 11 minutes produit un rendement robuste de cellules vivantes, produisant des populations de dcs et de macrophages qui expriment des niveaux élevés de CD 11 B et de CD 11 C qui sont phénotypiquement distincts.

En revanche, une digestion de 50 minutes permet d’obtenir un rendement cellulaire similaire à celui d’une digestion optimisée. Cependant, la délimitation de différentes populations cellulaires à l’aide du CD 11 B et du CD 11 C devient plus difficile. À mesure que l’expression du CD 11 C diminue et que le nombre de cellules mortes augmente.

Ainsi, en optimisant les paramètres de digestion des tissus intestinaux, un rendement cellulaire robuste peut être rapidement atteint. Par conséquent, l’isolement rapide des dcs intestinaux et des macrophages de souris peut être utile pour évaluer les propriétés fonctionnelles des cellules immunitaires avec des antigènes de surface intacts.