Immunohistochimie Wholemount de la topographie du cerveau révélatrice complexe
5 avril 2012
Les circuits neuronaux sont topographiquement organisée en compartiments fonctionnels avec des profils spécifiques moléculaires. Ici, nous fournissons les étapes pratiques et techniques pour révéler la topographie du cerveau planétaire grâce à une approche polyvalente wholemount coloration immunohistochimique. Nous démontrons l'utilité de la méthode utilisant la cytoarchitecture bien compris et les circuits du cervelet.
L'objectif général de cette procédure est de révéler les schémas complexes d'expression génique dans une structure cérébrale entière et intacte. Cela est réalisé en perfusant d'abord l'animal et en retirant le cerveau. Le cervelet est ensuite disséqué et traité selon le protocole de coloration en montage entier.
La dernière étape consiste à visualiser l'expression des gènes à l'aide d'une réaction colorée histochimique. En fin de compte, la microscopie en champ clair est utilisée pour imager les profils d'expression génique en surface. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'immunohistochimie sur coupes tissulaires réside dans la capacité à visualiser des profils complexes en trois dimensions, sans nécessiter de reconstruction.
La procédure est démontrée par Joshua White, étudiant diplômé de mon laboratoire. Après avoir sacrifié l'animal et retiré le cerveau du crâne, séparez le cervelet du reste du cerveau en insérant d'abord les pointes d'une paire de forceps dans la partie médiane des collets supérieur et inférieur. Puis, à l'aide d'une seconde paire de forceps, détachez lentement les collets et le cortex du cervelet.
Positionnez le cervelet de manière à ce que le côté antérieur soit orienté vers le bas et que le tronc cérébral pointe vers le haut. Insérez maintenant la pince dans le quatrième ventricule, entre le tronc cérébral et les lobules neuf et dix du cervelet. Coupez les pédoncules en pinçant avec la pince des deux côtés, puis soulevez délicatement le cervelet en l'écartant du tronc cérébral.
Postfixer le cervelet par immersion dans du paraformaldéhyde à 4 % à quatre degrés Celsius pendant un minimum de 24 à 48 heures. Le cervelet peut être conservé dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant une période prolongée en travaillant sous une hotte. Verser délicatement le solution de paraformaldéhyde et la remplacer par du fixatif concentré.
Placer le tube contenant le cervelet et la solution de fixatif sur un agitateur et agiter doucement pendant six à huit heures. Une fois le temps d'incubation écoulé, verser délicatement le fixatif concentré et le remplacer par de l'eau de Javel concentrée. Incuber le cervelet dans cette solution toute la nuit à quatre degrés Celsius avec agitation le lendemain.
Remplacer la solution dans le tube par du méthanol à 100 %. Placer le tube sur l'agitateur et agiter doucement à température ambiante pendant 30 minutes. Une fois le temps d'incubation écoulé, remplacer la solution par du méthanol à 100 % frais et répéter l'incubation afin de garantir la déshydratation du cervelet.
À présent, congeler-dégeler le tissu dans du méthanol à 100 % en plaçant le tube dans un récipient contenant de la glace sèche et en congelant pendant 30 minutes. Au terme de ce délai, utiliser des pinces pour retirer le tube de la glace sèche, puis le placer sur la paillasse pour le dégeler pendant 15 minutes. Répéter la procédure de congélation-décongélation au moins quatre fois afin d'améliorer la pénétration des solutions de coloration.
Après le dernier dégel, placer le tube dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit. Le tissu peut être conservé pendant de longues périodes à moins 80 degrés Celsius, soit immédiatement avant soit après les étapes de congélation-décongélation. Sinon, le protocole doit être poursuivi.
Le lendemain. Réhydrater le cervelet par immersion avec agitation dans un mélange à 50 % de méthanol et 50 % de PBS, puis dans 15 % de méthanol et 85 % de PBS, et enfin dans du PBS à 100 %, pendant 60 à 90 minutes chacun à température ambiante. Ensuite, pour le cervelet de souris adulte, soumettre le tissu à une digestion enzymatique avec 10 microgrammes par millilitre de protéinase K dans du PBS pendant deux à trois minutes à température ambiante sous agitation.
Cette étape de digestion n'est pas nécessaire pour les cervelets de souris de cinq jours postnataux ou plus jeunes. Après la digestion, versez immédiatement le protéinase K et lavez le cervelet dans du PB S trois fois pendant 10 minutes chacun afin d'éviter une sur-digestion. Après le dernier lavage, remplacez la solution par du P-B-S-M-T et du ROCK, puis incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius pour bloquer les tissus le jour suivant.
Versez la solution de blocage P-B-S-M-T et incubez le tissu dans l'anticorps primaire dilué dans du P-B-S-M-T, complété avec 5 % de DMSO, pendant 48 heures à quatre degrés Celsius sous agitation. Une fois le temps d'incubation écoulé, lavez le cervelet deux à trois fois, deux à trois heures chacun, dans du P-B-S-M-T à quatre degrés Celsius sous agitation, afin d'éliminer les anticorps primaires non liés.
Incubez ensuite le tissu dans l'anticorps secondaire dans une solution de P-B-S-M-T avec 5 % de DMSO à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le jour suivant, sous agitation, lavez le cervelet dans du P-B-S-M-T comme précédemment. Effectuez ensuite un dernier lavage dans du PBT pendant une à deux heures sous agitation à quatre degrés Celsius.
Cette étape élimine l'excès de lait et améliore la netteté de la coloration. Enfin, incuber le tissu dans la solution de DAB. Jusqu'à ce que l'intensité de coloration optimale soit atteinte, il est préférable d'utiliser le DAB à l'abri de la lumière.
La lumière provoque la précipitation du chromogène, ce qui peut augmenter la coloration du fond. Le produit de réaction brun doit être clairement visible dans les 10 minutes lorsque l'intensité de coloration optimale est atteinte. Arrêter la réaction en plaçant le cervelet dans du PBS contenant 0,4 % d'azoture de sodium.
Le tissu peut être conservé à long terme dans cette solution. Le tissu coloré en montage entier doit être observé immergé dans du PBS ou un autre milieu offrant un indice de réfraction optimal. Pour positionner facilement le montage entier pendant l'observation, préparez un gel d'agar à 1 % dans une boîte de Pétri en plastique.
Ensuite, découpez de petits trous dans le gel, puis insérez les cervelets dans ces trous selon l'orientation souhaitée pour l'imagerie, et recouvrez les cervelets avec du PBS. Le tissu marqué est désormais prêt à être observé par microscopie optique. ZEIN deux Adelaide c.
L'immunohistochimie révèle des bandes sagittales dans les sections transversales du cervelet. Les labiales quatre, cinq et trois sont indiquées sur le schéma. À des fins d'orientation, la barre d'échelle représente 500 microns.
ZEIN deux. Le C d'Adelaide est exprimé exclusivement dans des sous-ensembles de cellules kinji sata et de dendrites. Dans cette image, l'échelle représente 150 microns.
Cette image montre un cervelet entier coloré pour la zéine deux, Adela C, révélant des bandes de cellules en bikini dans les images des zones antérieure, centrale et postérieure du cervelet. Les chiffres romains indiquent les lobes cérébelleux. LS est le lobule simplex.
PML signifie labiale paramédiane. COP désigne les paramètres copulaires et les étiquettes. Crust un et Crust deux désignent les noms de deux LOE hémisphériques, les désignations P un et P trois sont basées sur une nomenclature standard utilisée pour indiquer des bandes spécifiques BR deux.
Pour plus de détails, voir Sillitoe et Hawks, 2002. L'échelle représente un millimètre. Ici, le cervelet a été immunomarqué avec un anticorps dirigé contre le peptide régulé par la cocaïne et l'amphétamine.
On peut le voir. Ce cart est exprimé dans des sous-ensembles de fibres grimpantes qui traversent la couche de cellules étiquetée PCL et se terminent dans la couche moléculaire étiquetée ml. Ici, la barre d'échelle représente 100 microns.
On peut observer sur cette image que les fibres positives au cart projettent des stries de dendrites cellulaires en bikini dans la couche moléculaire du cortex cérébelleux, y compris des régions telles que l’Oculus marqué PFL et l’Oculus marqué fl. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d’éviter de blesser le cervelet. Tout dommage externe obscurcira la visibilité des motifs de coloration complexes.
Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de révéler des schémas complexes et intéressants d'expression génique dans les neurones et dans les fibres qui les contactent dans le cerveau intact.
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Aperçu
Cet article présente une méthode permettant de révéler la topographie cérébrale globale par une coloration immunohistochimique sur coupe entière. Cette technique permet de visualiser en trois dimensions des profils d'expression génique complexes, spécifiquement appliquée au cervelet.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Immunohistochimie
- Topographie cérébrale
Contexte
- Les circuits neuronaux sont organisés en compartiments fonctionnels.
- La compréhension de la topographie cérébrale est essentielle pour la recherche en neurosciences.
- Les méthodes traditionnelles peuvent ne pas visualiser efficacement les schémas complexes.
- La coloration sur coupe entière offre une approche novatrice pour l'étude des structures cérébrales.
Objectif de l'étude
- Mettre en évidence les schémas complexes d'expression génique dans des structures cérébrales intactes.
- Démontrer l'utilité de la coloration immunohistochimique en préparation entière.
- Visualiser les schémas d'expression génique en trois dimensions.
Méthodes utilisées
- Perfusion de l'animal et prélèvement du cerveau.
- Disséction du cervelet.
- Application du protocole de coloration en préparation entière.
- Visualisation de l'expression génique à l'aide de réactions colorimétriques histochimiques.
Résultats principaux
- Visualisation réussie des profils d'expression génique à la surface.
- Mise en évidence des avantages de la méthode par rapport à l'immunohistochimie sur coupes de tissus.
- Capacité d'observer des profils complexes sans reconstruction.
Conclusions
- La technique de coloration en tout-organisme est efficace pour l'étude de la topographie cérébrale.
- Cette méthode améliore la compréhension de l'organisation des circuits neuronaux.
- Elle constitue un outil précieux pour les futures recherches en neurosciences.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'immunohistochimie sur prélèvement entier permet la visualisation directe de motifs complexes d'expression protéique dans des structures cérébrales intactes, offrant une vue tridimensionnelle de la topographie moléculaire sans artefacts de reconstruction. Cette approche facilite la validation des cibles en révélant des distributions spatialement résolues de biomarqueurs dans des circuits neuronaux pertinents pour la maladie, renforçant ainsi la confiance prédictive dans les modèles précliniques. La méthode est particulièrement utile pour réduire les risques dans les programmes ciblant le SNC, en clarifiant les relations anatomiques et fonctionnelles dès les premières étapes de la découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en cartographiant l'expression protéique dans l'architecture cérébrale tridimensionnelle native.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle de cibles grâce à l'observation directe de la compartimentalisation moléculaire.
- Valeur prédictive : Aide au tri des portefeuilles en précisant la localisation des biomarqueurs dans les voies cérébelleuses et afférentes.
Tests et développement de tests
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour des criblages ultérieurs en préservant la topologie tissulaire intacte.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation des tests grâce à des protocoles reproductibles de coloration en tout-organisme.
- Extensibilité : Met en évidence la réutilisation de la plateforme pour des études comparatives entre espèces et stades de développement.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Aborde la pertinence pour les maladies grâce à la visualisation des projections afférentes et de la topographie moléculaire.
- Alignement préclinique : Décrit la continuité allant de la découverte à la validation préclinique, en utilisant zebrinII/aldolaseC comme exemple de biomarqueur.
- Décisions ajustées au risque : Met l'accent sur la réduction prédictive des risques en révélant des motifs complexes dans la conformation native.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, allant du test d'hypothèses à l'identification de composés candidats, en soutenant la réduction des risques biologiques et la clarification des voies dans la recherche sur le système nerveux central.
- Biologie de la découverte : Explique comment la méthode soutient la vérification d'hypothèses en révélant les profils d'expression génique dans les lobules et zones cérébelleux intacts.
- Depistage : Décrit la préparation du test grâce à une coloration et une imagerie normalisées de l'expression génique en surface en trois dimensions.
- Analytique : Met en évidence des mesures quantitatives issues de réactions colorées histochimiques permettant la comparaison de l'intensité d'expression entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Relie la méthode à la continuité préclinique par la visualisation des projections des fibres afférentes et de leurs champs terminaux dans les couches moléculaires.
- Réutilisation en milieu professionnel : Présente la méthode comme une capacité réutilisable pour des études comparatives de topographie entre modèles de rongeurs et régions cérébrales.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive, validation des cibles, réduction de l'ambiguïté mécanistique dans la cartographie des circuits neuronaux.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité de la coloration sur prélèvements entiers pour l'analyse de motifs à haut débit.
- Valeur stratégique : Meilleures décisions d'aller/arrêt, efficacité du capital et réduction des risques biologiques tardifs dans le développement de médicaments du système nerveux central.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation et décisions d'avancement ajustées au risque, fondées sur des données biomarqueurs spatialement résolues.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Compétences scientifiques requises en neuroanatomie, en immunohistochimie et en microscopie.
- Besoins en instrumentation et en infrastructure analytique, notamment des microtomes, des agitateurs rotatifs, des congélateurs et des microscopes en champ clair.
- Exigences de standardisation entre équipes pour les protocoles de fixation, de déshydratation, de blocage et d'incubation avec les anticorps.
- Considérations d'adaptation selon les systèmes modèles, y compris les cervelets de souris et de rat, ainsi que les stades de développement.
- Limites pratiques appuyées par les données de la littérature, telles que l'évitement des dommages mécaniques pendant la dissection afin de préserver la clarté de la coloration.
