Mesure cinétique cellulaire avec la progression du cycle marquage métabolique et cytométrie de flux

L’objectif global de la procédure suivante est de mesurer la cinétique et la progression du cycle cellulaire. Les premières cellules sont marquées à la chasse d’impulsions avec du romo, du désoxy, de l’uridine ou du BRDU, qui est incorporé dans l’ADN de la cellule à la place de la thymidine. Les cellules sont ensuite immuno-colorées avec des anticorps contre BRDU et analysées par cytométrie en flux immédiatement après la coloration.

Seules les cellules en phase S sont marquées au fur et à mesure que les cellules marquées progressent dans le cycle cellulaire jusqu’à G deux. Ils sont détectés comme ayant quatre teneurs en NDNA après mitose. La teneur en ADN est réduite à deux N.Ainsi, l’analyse des profils de fluorescence générés par cytométrie en flux peut être utilisée pour déterminer la cinétique de progression du cycle cellulaire.

Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres protocoles qui utilisent des produits chimiques pour la synchronisation cellulaire est qu’il n’y a pas de perturbations physiologiques qui pourraient affecter par inadvertance la machinerie de division cellulaire. Nous avons utilisé cette méthode pour la première fois lorsque nos tentatives d’étude du taux de progression du cycle cellulaire à l’aide de la synchronisation chimique nous ont donné des résultats inattendus qui ont interféré avec notre analyse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire.

Par exemple, sur quelle base se fondent les taux de croissance différentiels entre les différents types de cellules ? Pour ce faire, commencez ce protocole en marquant les cellules avec BRDU par Pulse Chase. Commencez par étiqueter une plaque de 10 centimètres pour chaque point temporel plus une pour chacune des commandes suivantes.

BRDU uniquement PI uniquement BRDU négatif PI négatif graine chaque plaque avec cinq fois 10 puissance cinquième. Le MCF sept cellules dans du DMEM supplémenté incubent les plaques pendant 24 à 48 heures pour permettre aux cellules de récupérer et de se fixer. Une fois que les cellules atteignent 60 % de fluidité, remplacez le milieu par du DMEM frais contenant 10 micromolaires.

Les BRDU incubent les cellules pendant une heure à 37 degrés Celsius 5 % CO2 pour permettre l’incorporation des BRDU dans l’ADN. Assurez-vous de laisser une plaque non traitée pour agir comme le contrôle négatif ou le point de temps zéro après une heure. Retirez le milieu de marquage par impulsions et rincez brièvement les cellules avec du PBS jusqu’à ce qu’elles soient comprises entre deux et huit heures.

Ajoutez du milieu de croissance frais et remettez-les dans l’incubateur. Ensuite, récoltez immédiatement les plaques de points temporels de zéro et d’une heure, comme décrit dans la section suivante. Pour récolter les cellules, aspirez le milieu et rincez la plaque.

Une fois avec PBS, puis la trypsine oculaire les cellules pour les détacher de la plaque et les collecter dans une centrifugeuse DMEM à trois 90 fois G pendant cinq minutes. Jetez le surnageant. Ensuite, rincez les cellules dans une centrifugeuse PBS glacée d’un à cinq millilitres à trois 90 fois G pendant cinq minutes après l’essorage, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans cent microlitres de glace.

PBS froid contenant 1 % FBS. Le FBS aide à prévenir l’agglutination des cellules. L’un des aspects les plus importants de cette procédure est de s’assurer que vous avez une suspension de cellule unique à partir de vos cellules récoltées.

Pour les faits. Pour y parvenir, vous pouvez ajouter vos cellules directement à l’éthanol goutte à goutte. Ceci est essentiel Ensuite, pour fixer les cellules, utilisez la pipette pour ajouter les cellules goutte à goutte à cinq millilitres de code de glace.

70 % d’éthanol dans un tube conique de 15 millilitres. Incuber les cellules sur de la glace pendant 30 minutes ou les stocker à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Il s’agit d’une étape idéale pour arrêter la collecte d’échantillons à partir des différents points temporels, les échantillons peuvent être laissés dans de l’éthanol pendant plusieurs jours, ce qui leur permet d’être traités simultanément pendant le reste du protocole pour effectuer une coloration BRDU et à l’iodure de propidium.

Retirez les cellules à quatre degrés Celsius et centrifugez-les à trois 90 fois G pendant cinq minutes. Après l’essorage, aspirez la majeure partie du fixateur, laissant environ 50 microlitres. Puis vortex.

Pour détacher la pastille afin de dénaturer l’ADN tout en tourbillonnant. Ajoutez lentement un millilitre de deux HCL Triton X 100 normaux goutte à goutte, puis incubez les échantillons à température ambiante pendant 30 minutes. Les cellules à granulés, en centrifugeant des échantillons pendant cinq minutes à trois 90 fois G, aspirent et jettent ensuite le surnageant.

Ensuite, remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de tétraborate de sodium 0,1 molaire. Après la centrifugation, les cellules aspirent à nouveau et éliminent le surnageant. Ensuite, mettez en suspension la pastille cellulaire dans 75 microlitres de coloration BRDU.

Mélangez et incubez à température ambiante pendant 45 minutes, à l’abri de la lumière après l’incubation. Granulez les cellules par centrifugation comme précédemment et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de PBS contenant cinq microgrammes par millilitre par iodure de perdium. Lorsque vous faites passer l’échantillon PI positif dans le cytomètre en flux, créez un graphique de dispersion vers l’avant par rapport à la diffusion latérale pour assurer la distribution correcte de la taille des cellules.

Ces deux paramètres doivent être tracés sur une échelle linéaire. Visualisez simultanément un graphique de FL trois H par rapport à FL deux W pour visualiser la coloration PI en fonction de la largeur d’impulsion de fluorescence. Ce graphique est utilisé pour créer une démarche afin d’isoler la fraction de cellules que l’on pense être dans le modèle de distribution normal du cycle cellulaire.

En général, ce modèle de distribution est caractérisé par deux groupes de cellules à partir des deux N et des quatre contenus NDNA de la coloration PI représentant respectivement les phases G un et G deux du cycle cellulaire. Une chaîne de cellules située entre ces deux groupes est représentative de la réplication continue de l’ADN qui se produit dans la phase S du cycle cellulaire. Créez un graphique affichant les cellules fermées avec FL un, H ou FITC sur une échelle logarithmique sur l’axe Y et PI sur une échelle linéaire sur l’axe X.

Ce graphique sera utilisé pour définir les paramètres restants à l’aide des différentes commandes ainsi que pour collecter des données. Pour l’analyse, placez l’échantillon de coloration PI uniquement dans l’orifice de chargement du cytomètre en flux, ajustez le gain pour placer G un à environ 200 sur l’axe des x. Cela sera plus facile à visualiser dans un graphique d’histogramme de la coloration PI.

Ensuite, placez l’échantillon BRDU uniquement dans le port de chargement et exécutez-le. Ajustez le gain de sorte que les deux populations de cellules, BRDU positive et BRDU négative, apparaissent sur le graphique. Idéalement, les cellules négatives BRDU sont positionnées juste au niveau ou en dessous de 10 par rapport à un.

Le contrôle final est l’échantillon négatif BDU slash PI. Exécutez cette commande négative pour vous assurer que les cellules n’apparaissent dans aucun des quadrants supérieur ou droit. Une fois que les paramètres des différentes parcelles ont été définis, le cytomètre en flux est calibré et prêt pour le traitement de BRDU et PI. Les cellules colorées collectent des données à partir d’un minimum de 10 000 cellules PI fermées pour chaque échantillon.

Ensuite, à l’aide d’un logiciel tel que FlowJo ou fax diva, créez un graphique de FITC en fonction de PI en fonction de PI avec des cellules contrôlées comme PI positives à partir du graphique PI en fonction de FL deux W. Pour distinguer la population cycliste. Ensuite, générez une deuxième porte pour isoler la population positive au BRDU.

Ensuite, pour suivre l’évolution temporelle de la progression du cycle cellulaire, tracez le nombre de cellules BRDU positives avec un contenu G un ou G deux en fonction du temps pour comparer le cycle cellulaire de progression. Cinétique entre deux lignées cellulaires colorectales HT 29 et LS 180. Les cellules ont été prélevées toutes les heures pendant huit heures après le retrait de l’impulsion A-B-R-D-U.

En comparant la cinétique des deux profils, l’émergence d’un pic G un est évidente à t égale quatre heures après BRDU dans les cellules LS 180 par rapport au point temporel correspondant pour la lignée cellulaire HT 29, qui n’a pas ce pic. Cela indique une progression accélérée du cycle cellulaire à travers la phase G deux du cycle cellulaire. Dans la lignée cellulaire colorectale LS 180 pour générer un profil cyclable de la lignée cellulaire du cancer du sein.

MC sept cellules ont été prélevées toutes les heures pendant huit heures. Suite à l’élimination de l’impulsion BRDU. Les cellules immunomarquées et les cellules de contre-coloration de l’ADN ont ensuite été triées en fonction de leurs signaux fluorescents.

Comme on peut le voir ici, les sept cellules de la mucoviscidose ont circulé à un rythme significativement plus lent que l’une ou l’autre des deux lignées de cellules colorectales testées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon dont le marquage métabolique de l’ADN en conjonction avec la récolte de points temporels vous permet de suivre la cinétique du cycle cellulaire.