Mesure cinétique cellulaire avec la progression du cycle marquage métabolique et cytométrie de flux

L'objectif général de la procédure suivante est de mesurer la cinétique et la progression du cycle cellulaire. Tout d'abord, les cellules sont marquées par une méthode de type « pulse-chase » à l'aide de bromodésoxyuridine ou BrdU, qui s'incorpore à l'ADN cellulaire en remplacement de la thymidine. Les cellules sont ensuite immunomarquées à l'aide d'anticorps dirigés contre le BrdU et analysées par cytométrie en flux immédiatement après le marquage.

Seules les cellules en phase S sont marquées, car ces cellules marquées progressent dans le cycle cellulaire jusqu'à la phase G deux. Elles sont détectées comme ayant un contenu d'ADN de quatre N après la mitose. Le contenu d'ADN est réduit à deux N. Ainsi, l'analyse des profils de fluorescence générés par la cytométrie en flux peut être utilisée pour déterminer la cinétique de la progression du cycle cellulaire.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres protocoles utilisant des produits chimiques pour la synchronisation cellulaire est qu'elle n'entraîne aucune perturbation physiologique susceptible d'affecter indirectement le mécanisme de division cellulaire. Nous avons utilisé cette méthode pour la première fois lorsque nos tentatives d'étude de la vitesse de progression du cycle cellulaire par synchronisation chimique nous ont donné des résultats inattendus qui interféraient avec notre analyse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire.

Par exemple, quelle est la base des taux de croissance différentiels entre les différents types cellulaires ? Commencez ce protocole par une étiquetage pulse-chase des cellules au BrdU pour réaliser ceci. Commencez par étiqueter une plaque de 10 centimètres pour chaque point temporel, plus une pour chacun des contrôles suivants.

BRDU uniquement, PI uniquement, BRDU négatif, PI négatif : ensemencez chaque plaque avec cinq fois 10 à la puissance cinq cellules MCF7 dans du DMEM supplémenté. Incubez les plaques pendant 24 à 48 heures pour permettre aux cellules de récupérer et d'adhérer. Une fois que les cellules atteignent une confluence de 60 %, remplacez le milieu par du DMEM frais contenant 10 micromolaire.

Incuber les cellules avec du BRDU pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 afin de permettre l'incorporation du BRDU dans l'ADN. Veiller à laisser une plaque non traitée pour servir de témoin négatif ou de point zéro après une heure. Retirer le milieu de marquage pulse et rincer brièvement les cellules avec du PBS pour les points temporels de deux à huit heures.

Ajoutez du milieu de croissance frais et replacez les plaques dans l'incubateur. Ensuite, récoltez immédiatement les plaques aux points temporels zéro et une heure comme décrit dans la section suivante. Pour récolter les cellules, aspirez le milieu et rincez la plaque.

Une fois avec du PBS, puis la trypsine est ajoutée pour détacher les cellules de la plaque et les recueillir dans du DMEM centrifugé à 390 ×g pendant cinq minutes. Éliminer le surnageant. Ensuite, rincer les cellules dans un à cinq millilitres de PBS glacé, centrifuger à 390 ×g pendant cinq minutes ; après la centrifugation, éliminer le surnageant et resuspendre les cellules dans cent microlitres de glace.

PBS froid contenant 1 % de FBS. Le FBS aide à prévenir l'agglutination des cellules. L'un des aspects les plus importants de cette procédure est de s'assurer que vous disposez d'une suspension monocellulaire à partir de vos cellules récoltées.

Pour les faits. Pour y parvenir, vous pouvez ajouter vos cellules directement à la goutte d'éthanol goutte à goutte. Ceci est essentiel. Ensuite, pour fixer les cellules, utilisez la pipette pour ajouter les cellules goutte à goutte à cinq millilitres de glace sèche.

70 % d'éthanol dans un tube conique de 15 millilitres. Incuber les cellules sur de la glace pendant 30 minutes ou les conserver à quatre degrés Celsius toute la nuit. Cette étape constitue un moment idéal pour interrompre la collecte des échantillons provenant des différents points temporels ; les échantillons peuvent rester dans l'éthanol pendant plusieurs jours, ce qui permet de les traiter simultanément lors des étapes suivantes du protocole afin d'effectuer la coloration au BRDU et à l'iodure de propidium.

Retirer les cellules de quatre degrés Celsius et centrifuger à 390 ×g pendant cinq minutes. Après la centrifugation, aspirer la majeure partie du fixateur en laissant environ 50 microlitres. Puis vortexer.

Pour desserrer le culot afin de dénaturer l'ADN pendant la vortexation. Ajouter lentement un millilitre de HCl deux normal contenant du Triton X-100 goutte à goutte, puis incuber les échantillons à température ambiante pendant 30 minutes. Culer les cellules par centrifugation des échantillons pendant cinq minutes à 390 ×g, puis aspirer et jeter le surnageant.

Ensuite, resuspendre le culot cellulaire dans un millilitre de tétraborate de sodium 0,1 molaire. Après centrifugation, aspirer à nouveau les cellules et jeter le surnageant. Ensuite, resuspendre le culot cellulaire dans 75 microlitres de coloration BRDU.

Mélanger et incuber à température ambiante pendant 45 minutes, en protégeant de la lumière après l'incubation. Récupérer les cellules par centrifugation comme précédemment et resuspendre le culot cellulaire dans un millilitre de PBS contenant cinq microgrammes par millilitre de iodure de propidium. Lors de l'analyse de l'échantillon positif au PI en cytométrie de flux, créer un graphique de dispersion de la diffusion antérieure contre la diffusion latérale afin de vérifier la distribution adéquate de la taille des cellules.

Ces deux paramètres doivent être tracés sur une échelle linéaire. Affichez simultanément un graphique de FL trois H en fonction de FL deux W pour visualiser la coloration par iodure de propidium par rapport à la largeur du pulse de fluorescence. Ce graphique est utilisé pour créer une porte permettant d'isoler la fraction de cellules considérée comme appartenant au profil de distribution normal du cycle cellulaire.

En général, ce profil de distribution est caractérisé par deux groupes de cellules correspondant aux contenus d'ADN de deux N et quatre N marqués par l'iodure de propidium (PI), représentant respectivement les phases G1 et G2 du cycle cellulaire. Une traînée de cellules située entre ces deux groupes représente la réplication de l'ADN en cours, qui se produit lors de la phase S du cycle cellulaire. Créez un graphique affichant les cellules sélectionnées avec le FL1-H ou la FITC sur une échelle logarithmique en ordonnée et le PI sur une échelle linéaire en abscisse.

Ce tracé sera utilisé pour régler les paramètres restants à l'aide des différents contrôles, ainsi que pour recueillir les données. Pour l'analyse, placez l'échantillon coloré uniquement avec l'iodure de propidium (PI) dans le port de chargement du cytomètre en flux et ajustez le gain de manière à positionner le pic G1 à environ 200 sur l'axe des abscisses. Cette manipulation sera plus facile à visualiser sur un tracé sous forme d'histogramme de la coloration par l'iodure de propidium.

Placez ensuite l'échantillon contenant uniquement le BRDU dans le port de chargement et lancez l'analyse. Réglez le gain de manière à ce que les deux populations cellulaires, positives et négatives pour le BRDU, apparaissent sur le graphique. Idéalement, les cellules négatives pour le BRDU doivent être positionnées juste à ou en dessous de 10 puissance un.

Le dernier témoin est l'échantillon négatif BDU/PI. Exécutez ce témoin négatif afin de s'assurer que les cellules n'apparaissent dans aucun des quadrants supérieurs ou droits. Une fois que les paramètres des différents graphiques ont été définis, le cytomètre en flux est étalonné et prêt à analyser les cellules marquées au BRDU et à la PI. Collectez des données à partir d'au moins 10 000 cellules sélectionnées par la PI pour chaque échantillon.

Ensuite, à l'aide d'un logiciel tel que FlowJo ou FACS Diva, créez un graphique de FITC en fonction de PI avec les cellules sélectionnées comme positives pour PI à partir du tracé PI versus FL deux voies. Pour distinguer la population en cycle. Ensuite, générez une deuxième sélection pour isoler la population positive pour BRDU.

Ensuite, afin de suivre l'évolution temporelle de la progression du cycle cellulaire, tracez le nombre de cellules positives pour la BRDU ayant un contenu en G1 ou en G2 en fonction du temps, afin de comparer la progression du cycle cellulaire. Cinétique entre deux lignées cellulaires colorectales, HT 29 et LS 180. Les cellules ont été recueillies chaque heure pendant huit heures suivant la suppression de l'impulsion d'A-B-R-D-U.

En comparant la cinétique des deux profils, l'apparition d'un pic en G1 est évidente à t égal à quatre heures post-BRDU dans les cellules LS 180 par rapport au point temporel correspondant pour la lignée cellulaire HT 29, qui ne présente pas ce pic. Cela indique une progression accélérée du cycle cellulaire à travers la phase G2 du cycle cellulaire. Dans la lignée cellulaire colorectale LS 180, afin de générer un profil de cycle pour la lignée cellulaire de cancer du sein.

Des cellules MC seven ont été collectées chaque heure pendant huit heures, après le retrait de l'impulsion de BRDU. Les cellules marquées par immunofluorescence et contre-colorées pour l'ADN ont ensuite été triées en fonction de leurs signaux fluorescents.

Comme on peut le voir ici, les cellules CF7 ont cyclé à un rythme nettement plus lent que chacune des deux lignées cellulaires colorectales testées. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment le marquage métabolique de l'ADN combiné à la récolte à différents points temporels permet de suivre la cinétique du cycle cellulaire.