Simple mutagenèse bisulfite d'ovocytes

L’objectif global de cette procédure est d’analyser la méthylation de l’ADN dans un seul ovocyte. Ceci est accompli en éliminant d’abord les cellules de cumulus et les palitas de savon des ovocytes collectés. La deuxième étape consiste à intégrer l’ovocyte dans une solution d’azote à deux pour un afin de protéger la quantité infime d’ADN contre la perte ou la dégradation.

Ensuite, une mutagénèse au bi sulfite est effectuée, suivie d’une amplification par réaction en chaîne par polymérase imbriquée. La dernière étape consiste à ligaturer et cloner le produit PCR. Les clones sont ensuite prélevés, amplifiés par PCR et envoyés pour séquençage.

En fin de compte, la mutagenèse et le séquençage du bisulfite sont utilisés pour montrer la méthylation de l’ADN au niveau de la cytosine phosphate guine, ou des dinucléotides CPG d’une région d’intérêt dans un seul ovocyte. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la mutagenèse au bisulfite de grands nombres de cellules est que les données peuvent être obtenues à partir d’un seul ovocyte sans cumul de cytes, biais de PCR et contamination cellulaire par chimiothérapie. Le jour du prélèvement des ovocytes, préparez fraîchement les solutions énumérées dans le protocole écrit lors de la préparation des solutions, réduisez le risque de contamination de l’ADN en changeant souvent de gants et en utilisant des embouts filtrants, gardez également les tubes inclinés lorsqu’ils sont ouverts et refermez tous les tubes lorsqu’ils ne sont pas utilisés.

Commencez la collecte de l’OSI en plaçant les ovules de souris disséqués dans M deux milieux et en déchirant la poulie M pour extraire le complexe de cellules du cumulus. Ensuite, séparez les cytes du complexe cellulaire du cumulus en utilisant 0,3 milligramme par millilitre de solution d’hyaluronidase dans une goutte de 30 microlitres de milieu M deux. Ne conservez les cytes en solution que le temps nécessaire pour éliminer les cellules du cumulus, car une longue exposition pourrait les endommager.

Lavez les ovocytes en gouttes de 30 microlitres de M deux milieux en transférant les ovocytes de goutte en goutte. Retirer les cellules du cumulus périodiquement pour un total de trois lavages. Retirez le Z de LUCITA à l’aide d’une solution de tyro acide.

Placez d’abord les ovocytes dans une goutte de 30 microlitres de solution, puis transférez-les dans une autre goutte de 30 microlitres. Comme tout fluide transporté diluera l’acide et réduira son efficacité. Ne conservez les cytes en solution que le temps nécessaire pour éliminer la zone, car une longue exposition pourrait les endommager.

Après l’élimination de la zone, lavez à nouveau les cytes dans une goutte de 30 microlitres de M deux milieux pour effectuer l’enrobage agros en plaçant d’abord la solution de lyse sur un bloc de chaleur à 70 degrés Celsius. Ajoutez l’Agros à bas point de fusion préchauffé, ou LMP Agros à la solution de lyse, produisant une solution AGROS à lyse deux pour un. Placez ensuite un seul ovocyte sur une lame de verre propre dans un minimum de M deux milieux.

L’étape suivante consiste à intégrer le cyte unique dans la solution d’Agros et de lyse. Cela doit être fait rapidement car les agros durciront à des températures inférieures à 65 degrés Celsius. Prélever 10 microlitres de la solution de lyse Agros dans une pointe de pipette sous un microscope.

Expulsez doucement environ un microlitre ou moins de la solution d’agrolyse sur la lame de verre, en lui permettant de se mélanger avec le minimum de fluide. Prélevez doucement l’ovocyte dans l’embout de la pipette. Ensuite, mettez les 10 microlitres dans un tube einor avec 300 microlitres d’huile minérale afin que la perle résultante prenne une forme sphérique.

Incuber le tube sur de la glace pendant 10 minutes pour effectuer la lyse. Retirez les 300 microlitres d’huile minérale et ajoutez 500 microlitres de tampon de lyse SDS. Incuber l’échantillon pendant la nuit dans un bain-marie réglé à 50 degrés Celsius le deuxième jour.

Préparez les solutions de mutagénèse bisulfure fraîches comme décrit dans le protocole écrit. Commencer la mutagénèse en retirant complètement les 500 microlitres de tampon de lyse SDS. Gardez à l’esprit que tout tampon de lyse restant diluera l’agros lorsqu’il sera chauffé et que la bille sera plus susceptible de se dissoudre dans les étapes suivantes.

Après l’élimination complète du tampon de lyse, ajoutez 300 microlitres d’huile minérale. Incuber l’échantillon pendant deux minutes et demie sur un bloc de chaleur à 90 degrés Celsius. Prenez du carat pour mélanger ou remuer, étendre ou fluctuer la température.

Après deux minutes et demie. Incuber l’échantillon sur de la glace pendant 10 minutes. Pour effectuer la dénaturation, retirez l’huile minérale et ajoutez un millilitre d’hydroxyde de sodium 0,1 molaire dans le tube, retournez le tube cinq à six fois.

Incuber l’échantillon pendant 15 minutes. Dans un bain-marie réglé à 37 degrés Celsius en s’inversant toutes les trois à quatre minutes, la perle doit flotter dans l’hydroxyde de sodium. Notez que la perle n’est plus au fond du tube.

Pour effectuer un traitement au sulfite, tournez d’abord doucement le tube après avoir retiré l’hydroxyde de sodium. Ajouter 300 microlitres d’huile minérale et 500 microlitres de solution de sulfite BIS. Prenez soin d’éviter l’exposition à la lumière et incubez le tube pendant trois heures et demie dans un bain-marie à 50 degrés Celsius.

Effectuez maintenant la désination. Incuber d’abord l’échantillon sur de la glace pendant trois minutes avant de retirer la solution d’huile minérale et de sulfite BIS. Après une légère rotation, ajoutez un millilitre d’hydroxyde de sodium de 0,3 molaire et retournez le tube cinq à six fois.

Incuber l’échantillon pendant 15 minutes. Dans un bain-marie à 37 degrés Celsius inversé toutes les trois à quatre minutes, encore une fois, la bille doit flotter dans l’hydroxyde de sodium avant de commencer la PCR. Lavez les échantillons en les essorant d’abord doucement.

Retirez ensuite l’hydroxyde de sodium et ajoutez un millilitre d’un xte pH 7,5. Agitez pendant cinq à 10 minutes à température ambiante. Après un deuxième essorage doux, retirez le XTE.

Répétez ce processus de lavage deux fois. Ajoutez ensuite un millilitre d’autoclave, de l’eau distillée deux fois. Agitez pendant cinq à 10 minutes à température ambiante, tournez doucement une troisième fois et retirez l’eau.

Répétez deux fois le lavage à l’eau distillée. Enfin, retirez tout surnageant, en ne laissant que la perle aros. Vérifiez que le pH du surnageant est de 5,0.

Si le surnageant est encore trop basique, lavez à nouveau les billes avec de l’eau distillée doublement. Pendant ce temps, ajoutez le premier mélange PCR dans le tube PCR comme décrit dans le protocole écrit. Faites glisser le solide agro speed sur la lèvre du tube einor.

Ensuite, transférez soigneusement la vitesse agricole dans le tube PCR, chauffez à 70 degrés Celsius pendant une minute et mélangez, puis amplifiez est suggéré dans le protocole écrit. Après le premier tour d’amplification, préparez la réaction PCR du deuxième tour en utilisant cinq microlitres du produit du premier tour comme modèle. Assurez-vous de bipa sous la couche d’huile minérale.

Procédez à la deuxième série d’amplification comme indiqué dans le texte en tant que test de diagnostic. Les échantillons du deuxième tour peuvent être coupés avec une enzyme de restriction qui est la méthylation ou l’électrophorèse spécifique de la souche les produits de digestion sur un gel d’acrylamide à 8 %. Toutes les bandes hétérogènes qui en résultent représentent plus d’une séquence pour cloner le deuxième produit rond ligaturé dans le vecteur et effectuer le clonage TA comme décrit dans le manuscrit accompagnant cette vidéo après la plaque de clonage TA, tout le mélange réactionnel sur une plaque de gélose et de LB, complété par de l’ampicilline, de l’ex gal et de l’IPTG et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Ajoutez ensuite le mélange maître PCR de colonie dans le tube PCR comme indiqué dans le protocole écrit. Prélevez une colonie bactérienne blanche sur la plaque à l’aide d’une pointe de pipette et faites-la tourbillonner dans 35 microlitres du mélange maître PCR de colonie dans un tube PCR. Procéder à l’amplification de la suspension comme décrit dans le texte suivant l’amplification PCR électrophorèse quatre microlitres du produit PCR sur un gel AGROS à 1,5 %.

Enfin, envoyez environ 30 microlitres du produit PCR pour le séquençage de cinq PCR de colonie par cyte. Une fois les résultats de séquençage obtenus, les modèles de méthylation peuvent être lus : toute cytosine guanine originale qui est restée telle quelle a été méthylée. À l’inverse, toute cytosine guanine originale qui est maintenant une guanine thiamine a été non méthylée après amplification PCR emboîtée à l’aide d’amorces converties en bi sulfite.

Il est possible de confirmer une conversion réussie en visualisant une taille de fragment correcte sur une métaphase individuelle aros gel. Deux ovocytes représentent un allèle parental et, en théorie, ont un modèle de méthylation imprimé en tant que tel. Les produits PCR de deuxième tour peuvent être testés pour détecter toute contamination involontaire.

Une enzyme de restriction sensible à la méthylation de l’ADN peut être utilisée pour digérer le produit de PCR de second tour afin d’évaluer s’il contient un allèle méthylé ou non méthylé. Ici, une cytosine méthylée dans la séquence de reconnaissance enzymatique est clivée. Alors qu’une cytosine non méthylée qui est convertie en thymine n’est plus reconnue par l’enzyme et n’est pas coupée, tout échantillon d’ovocyte en métaphase deux contenant à la fois des allèles méthylés et non méthylés doit être jeté car il indique une contamination par des cellules cumulus ou une inclusion de corps polaire après la ligature et la transformation.

Une amplification réussie de la PCR de colonie peut être visualisée sur un gel AROS pour s’assurer que les échantillons avec la bonne taille de produit sont envoyés pour le séquençage. Pour cet exemple, la taille d’amplicon attendue après la ligature est de cent 56 paires de bases. Ici, le clone cinq a une taille d’amplicon incorrecte et ne doit pas être envoyé pour le séquençage.

La séquence de cinq clones individuels d’un ovocyte en métaphase deux devrait produire cinq modèles de méthylation identiques et des taux de conversion non CPG identiques. Tous les échantillons contenant plus d’un motif doivent être jetés. Étant donné que les deux cytes de la métaphase ovulée ont deux copies de chromosomes ou un corps polaire attaché, il est possible d’obtenir deux modèles de séquence similaires.

Les données doivent être éliminées de tous les cytes qui ont des modèles de méthylation très différents. Étant donné que la contamination des cellules des cumulus ne peut être exclue Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de laver d’abord les ovocytes plusieurs fois dans un milieu frais, après le traitement HI IDE pour éliminer autant de cellules cumul que possible. Deuxièmement, l’agros à bas point de fusion durcit à des températures inférieures à 65 degrés Celsius, alors travaillez soigneusement mais rapidement.

Et enfin, le sulfate de sodium bis et l’hydroquinone sont sensibles à la lumière, de sorte que les tubes et les solutions de réaction doivent être enveloppés dans du papier d’aluminium.