Name: Simple mutagenèse bisulfite dovocytes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Apprenez la mutagénèse bisulfite pour analyser la méthylation de l'ADN dans des ovocytes individuels. Cette méthode protège l'ADN minute et permet une analyse épigénétique précise au niveau unicellulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par l&#39;Université de Western Ontario, le Département d&#39;obstétrique et de gynécologie, et une subvention ER06-02-188 à partir de la recherche et l&#39;innovation Ministryof, bourse de nouveau chercheur. MMD a été soutenue par un programme de formation des IRSC sur la reproduction, le développement des jeunes et l&#39;impact sur les bourses d&#39;études supérieures de la santé (REDIH).

<ol><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).</li>
<li>Rodenhiser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+and+human+disease%3A+translating+basic+biology+into+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22CMAJ%22%5BJournal%5D)">Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications.</a> CMAJ. 174, 341-348 (2006).</li>
<li>Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).</li>
<li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+analysis+on+individual+chromosomes%3A+improved+protocol+for+bisulphite+genomic+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).</li>
<li>Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bisulfite+method+of+5-methylcytosine+mapping+that+minimizes+template+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation.</a> Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).</li>
<li>Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Methylation%3A+Bisulphite+Modification+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis.</a> J. Vis. Exp. (56), e3170(2011).</li>
<li>Olek, A., Oswald, J., Walter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+and+improved+method+for+bisulphite+based+cytosine+methylation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis.</a> Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).</li>
<li>Mann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+loss+of+imprinting+in+the+placenta+following+preimplantation+development+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture.</a> Development. 131, 3727-3735 (2004).</li>
<li>Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+effects+of+superovulation%3A+loss+of+maternal+and+paternal+imprinted+methylation+in+a+dose-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).</li>
<li>Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+on+bisulfite+sequencing+method+for+methylation+status+of+imprinted+genes+in+single+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Yi+Xue+Yi+Chuan+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes.</a> Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).</li>
<li>Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+imprinting+perturbations+do+not+originate+from+superovulation-induced+defects+in+DNA+methylation+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition.</a> Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).</li>
<li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>Hajj, N. E. l <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+dilution+bisulfite+%28pyro%29sequencing+reveals+parent-specific+methylation+patterns+in+single+early+mouse+embryos+and+bovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes.</a> Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Ce test seul ovocyte contient de nombreuses étapes avec un certain nombre qui sont essentiels et nécessitent des soins spéciaux. La première est le lavage des ovocytes. Il est particulièrement important de se laver chaque ovocyte à plusieurs reprises dans un milieu frais tombe suite à un traitement hyaluronidase pour enlever le plus les cellules du cumulus plus grand nombre possible. En outre, lors du transfert des ovocytes à la solution acide de Tyrode pour zone pellucide retrait assurez-vous du milieu environnant est ...

Table des réactifs spécifiques et des équipements. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td colspan="4"> Collection d&#39;ovocytes </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> Sigma </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> Acide de Tyrode </td><td> Sigma </td><td> T1788 </td><td></td></tr><tr><td> Protéinase K </td><td> Sigma </td><td> P5568 </td><td></td></tr><tr><td> IGEPAL 10% </td><td> Bioshop </td><td> NON999.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Solution de lyse </td></tr><tr><td> Tris, pH 7,5 </td><td> Bioshop </td><td> TRS001.5 </td><td></td></tr><tr><td> LiCl </td><td> Sigma </td><td> L9650 </td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> EDTA pH 8,0 </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> LiDS </td><td> Bioshop </td><td> LDS701.10 </td><td></td></tr><tr><td> TNT </td><td> Invitrogen </td><td> P2325 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Tampon de lyse SDS </td></tr><tr><td> PH 7,5 TE </td><td> Bioshop (Tris) Sigma (EDTA) </td><td> TRS001.5 E5134 </td><td></td></tr><tr><td> SDS à 10% </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Conversion au bisulfite </td></tr><tr><td> Hydroxyde de sodium </td><td> Sigma </td><td> S8045 </td><td></td></tr><tr><td> Hydrogénosulfite de sodium (bisulfite de sodium) </td><td> Sigma </td><td> 243973 </td><td>; </td></tr><tr><td> Hydroquinone </td><td> Sigma </td><td> H9003 </td><td></td></tr><tr><td> Bas point de fusion (LMP) Agarose </td><td> Sigma </td><td> A9414 </td><td></td></tr><tr><td> Huile minérale </td><td> Sigma </td><td> M8410 </td><td></td></tr><tr><td> Milieu M2 </td><td> Sigma </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> GIBCO eau distillée </td><td> Invitrogen </td><td> 15230-196 </td><td></td></tr><tr><td> Autoclavée bidistillée (jj) de l&#39;eau </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> PCR </td></tr><tr><td> Illustra Hot Mix Démarrer RTG </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9006-54 </td><td></td></tr><tr><td> 240 ng / ml ARNt de levure </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td></td></tr><tr><td> 5x tampon vert réaction GoTaq </td><td> Proméga </td><td> M7911 </td><td></td></tr><tr><td> Intérieure et extérieure amorces imbriquées </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> La ligature </td></tr><tr><td> Promega vecteur pGEM-T Facile </td><td> Fisher Scientific </td><td> A1360 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> TA Cloning </td></tr><tr><td> Compétentes cellules de E. coli </td><td> Zymo Research Corp </td><td> T3009 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Équipement </td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 70 ° C et 90 ° C à chaleur blocs </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C et 50 ° C Bain-marie (42 ° C pour les transformations) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bascule </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Machine à PCR </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

simple mutagenèse bisulfite d&#39;ovocytes

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

L&#39;épigénétique englobe toutes héréditaires et des modifications réversibles de la chromatine que l&#39;accessibilité des gènes alter, et sont donc les principaux mécanismes de régulation de la transcription du gène 1. Méthylation de l&#39;ADN est une modification épigénétique qui agit principalement comme une marque de répression. Grâce à l&#39;addition covalente d&#39;un groupement méthyle sur les cytosines dans les dinucléotides CpG, on peut recruter d&#39;autres protéines de répression et les modifications des histones pour lancer le processus impliqués dans la condensation de la chromatine et faire taire des gènes 2. Méthylation de l&#39;ADN est essentielle pour le développement normal car elle joue un rôle essentiel dans la programmation du développement, la différenciation cellulaire, la répression des éléments rétroviraux, inactivation du chromosome X et l&#39;empreinte génomique. Une des méthodes les plus puissants pour l&#39;analyse méthylation de l&#39;ADN est la mutagenèse bisulfite. Bisulfite de sodium est un agent mutagène ADN qui désamine cytosines en uraciles. Après amplification par PCR et seque<html> ncing, ces phénomènes de conversion sont détectés comme thymines. Cytosines méthylées sont protégés de la désamination et restent donc en cytosines, permettant l&#39;identification de la méthylation de l&#39;ADN au niveau individuel nucléotide 3. Développement de l&#39;essai de mutagenèse bisulfite a progressé de ceux initialement déclarés 4-6 vers ceux qui sont plus sensible et reproductible 7. Un progrès important a été l&#39;incorporation de petites quantités d&#39;ADN dans un bourrelet d&#39;agarose, protégeant ainsi l&#39;ADN provenant du traitement bisulfite dure 8. Cette analyse de la méthylation permis à être exécuté sur des pools d&#39;ovocytes et embryons au stade blastocyste-9. Le protocole le plus sophistiqué du bisulfite de mutagenèse à ce jour est pour individuels blastocyste-embryons au stade 10. Toutefois, étant donné que les blastocystes ont en moyenne 64 cellules (contenant 120-720 pg d&#39;ADN génomique), cette méthode n&#39;est pas efficace pour les études de méthylation sur les ovocytes individuels ou clivage au stade d&#39;embryons. tente &quot;&gt; Prendre des indices de plongement d&#39;agarose des montants d&#39;ADN minute, y compris les ovocytes 11, nous présentons ici une méthode par laquelle les ovocytes sont directement intégrés dans une solution de lyse agarose et perles de récupération qui suit immédiatement et le retrait de la zone pellucide de l&#39;ovocyte. Cela nous permet de contourner les deux principaux défis de la mutagenèse ovocyte unique: bisulfite. protégeant une infime quantité d&#39;ADN de la dégradation et la perte subséquente au cours des étapes du protocole de nombreuses important, car les données sont obtenues à partir d&#39;ovocytes simples, la question de la partialité PCR au sein des pools est éliminée plus. , par inadvertance la contamination de cellules du cumulus est détectable par cette méthode depuis n&#39;importe quel échantillon avec plus d&#39;un modèle de méthylation peuvent être exclus de l&#39;analyse 12. Ce protocole fournit une méthode améliorée pour les analyses réussies et reproductibles de méthylation de l&#39;ADN au niveau unicellulaire et est parfaitement adapté des ovocytes individuels ainsi que le clivage au stade d&#39;embryons.

Mutagenèse bisulfite est l&#39;étalon-or pour l&#39;analyse de méthylation de l&#39;ADN. Notre protocole modifié permet une analyse méthylation de l&#39;ADN au niveau unicellulaire et a été spécialement conçu pour les ovocytes individuels. Il peut également être utilisé pour le clivage-embryons au stade.

Simple mutagenèse bisulfite d&#39;ovocytes

L'épigénétique englobe toutes les modifications héritables et réversibles de la chromatine qui altèrent l'accessibilité des gènes, et constituent ainsi les mécanismes primaires pour...

L'objectif général de cette procédure est d'analyser la méthylation de l'ADN dans un seul ovocyte. Cela est réalisé en premier lieu en éliminant les cellules du cumulus et la palita savonneuse des ovocytes recueillis. La deuxième étape consiste à inclure l'ovocyte dans une solution de lyse aros deux pour un afin de protéger la quantité minime d'ADN contre la perte ou la dégradation.Ensuite, une mutagenèse par bisulfite est réalisée, suivie d'une amplification par réaction en chaîne par polymérase imbriquée. La dernière étape consiste à ligaturer et cloner le produit de PCR. Les clones sont ensuite sélectionnés, amplifiés par PCR et envoyés pour séquençage.En fin de compte, la mutagénèse par bisulfite et le séquençage sont utilisés pour révéler la méthylation de l'ADN au niveau des dinucléotides cytosine-phosphate-guanine, ou CpG, d'une région d'intérêt dans un seul ovocyte. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la mutagénèse par bisulfite effectuée sur un grand nombre de cellules, est que les données peuvent être obtenues à partir d'un unique ovocyte, sans regroupement, sans biais de PCR ni contamination par des cellules somatiques. Le

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Les ovocytes sont sujettes à une aneuploïdie raison d'erreurs dans la ségrégation des chromosomes lors de la maturation méiotique. Oeufs aneuploïdes peut causer l'infertilité, fausses couches ou des troubles du développement tels que le syndrome de Down. Ici, nous décrivons les méthodes pour introduire des matériaux de choix dans des ovocytes et des méthodes pour étudier la maturation méiotique et évaluer ploïdie.

Évaluation microinjection des ovocytes de souris, la maturation et de ploïdie

Ici, nous présentons un protocole de l'épuisement de l'ARNm de siRNA médiation spécifique suivie d'une analyse d'immunofluorescence pour évaluer l'assemblage du fuseau méiotique et de l'organisation dans des ovocytes de souris. Ce protocole est approprié pour l'appauvrissement de produits de transcription in vitro et l'évaluation fonctionnelle de broche différents et / ou des facteurs de MTOC associée dans les ovocytes.

Meiotic évaluation de la broche dans la souris ovocytes par silençage siRNA médiation

Génétiquement codés histone-miniSOG induit des mutations héréditaires du génome entier d'une manière dépendant de la lumière bleue. Cette méthode de mutagenèse est simple, rapide, exempt de produits chimiques toxiques, et bien adapté pour le dépistage génétique avant et l'intégration du transgène.

Optogénétiques mutagenèse aléatoire Utilisation Histone-miniSOG dans<em&gt; C. elegans</em

Comme les variantes génétiques associées à des maladies humaines commencent à devenir non couvert, il devient de plus en plus important de développer des systèmes permettant d’évaluer rapidement l’importance biologique de ces variants identifiés. Ce protocole décrit les méthodes d’évaluation de la fonction du gène humain au cours de la méiose femelle j’ai utiliser les ovocytes de souris.

À l’aide des ovocytes de souris pour évaluer la fonction du gène humain au cours de la méiose I

Cet article présente deux méthodes basées sur l’hybridation in situ par fluorescence pour déterminer le contenu chromosomique X des cellules ovariennes dans le tissu du cortex ovarien non greffé et greffé de femelles présentant des aberrations chromosomiques X.

Explorer les aberrations chromosomiques X dans les cellules ovariennes en utilisant l’hybridation in situ par fluorescence

Dans ce protocole, la méthode de purification par affinité des ribosomes de traduction (TRAP) et la méthode d’isolement des noyaux marqués dans des types cellulaires spécifiques (INTACT) ont été optimisées pour l’interrogation par appariement du transcriptome ovarien et de l’épigénome spécifiques à la cellule à l’aide du modèle murin NuTRAP croisé vers une lignée de souris Cyp17a1-Cre.

Interrogation par appariement spécifique à la cellule de l’épigénome ovarien et du transcriptome de la souris

Le maintien de l’intégrité du génome de l’ovocyte est nécessaire pour assurer la fidélité génétique de l’embryon résultant. Nous présentons ici un protocole précis pour détecter les cassures double brin de l’ADN dans les cellules germinales femelles de mammifères.

Détection de cassures double brin de l’ADN dans des ovocytes de souris

Cet article établit un pipeline pour des suspensions de cellules uniques et de noyaux de haute qualité d’embryons de souris gaztrulants pour le séquençage de cellules uniques et de noyaux.

Séquençage de l’ARN unicellulaire d’embryons entiers de souris mutantes : de l’épiblaste à la fin de la gastrulation

Les erreurs méiotiques dans les synapses et la recombinaison sont courantes chez les ovocytes de mammifères. Une analyse rigoureuse des protéines impliquées dans ces processus est essentielle pour comprendre comment et pourquoi l’ovogenèse tourne souvent mal. Les techniques présentées ici permettent un suivi complet de la recombinaison et des synapses pour évaluer la qualité des ovocytes chez la souris.

Préparation de la propagation des chromosomes méiotiques à partir d’ovocytes de souris pour l’évaluation de la synapse et de la recombinaison

Mutagenèse dirigée de plasmides ensemble est un moyen simple de créer des variations légèrement différentes d'un plasmide d'origine. Ici nous démontrons une manière facile et rentable d'introduire des substitutions de bases dans un plasmide standard en utilisant des réactifs.

Mutagenèse dirigée maison des plasmides entiers

Apprenez la mutagénèse bisulfite pour analyser la méthylation de l'ADN dans des ovocytes individuels. Cette méthode protège l'ADN minute et permet une analyse épigénétique précise au niveau unicellulaire.

Simple mutagenèse bisulfite d'ovocytes

Explorer plus de vidéos