Formulations pour la lyophilisation des bactéries et leur influence sur la survie des cellules

L'objectif de l'expérience suivante est d'observer l'effet que différents types de formulations pour la lyophilisation ont sur la survie cellulaire. Pour commencer, différentes formulations destinées à la lyophilisation de cultures cellulaires sont préparées. Ensuite, chaque formulation est mélangée avec la culture cellulaire, puis lyophilisée, réhydratée par la suite, et les taux de survie sont mesurés.

Les résultats montrent des différences de taux de survie qui peuvent être associées aux propriétés caractérisées. Cette méthode peut vous aider à comprendre quelles sont les propriétés physiques et structurales d'une formulation qui sont importantes pour la survie cellulaire durant la déshydratation. Pour préparer une culture initiale de Pseudomonas putida, commencez par ensemencer 100 millilitres de bouillon trypticasé soja, ou TSB, avec une colonie de cellules ayant été cultivée sur un milieu gélosé complété avec du bouillon trypticasé soja ou TSB. Incubez la culture à 30 degrés Celsius, sous agitation à 130 tr/min, pendant sept heures.

Transférez un aliquot de la culture dans du TSB frais et faites croître pendant 16 heures. Récupérez les cellules par centrifugation à 1 500 ×g pendant 20 minutes à température ambiante. Lavez le culot cellulaire par Resus en le resuspendant dans du chlorure de sodium à 150 millimolaire.

Centrifuger les cellules et les resuspendre. Les suspendre dans un milieu de formulation. Pour préparer les solutions de formulation destinées au lyophilisation des cellules.

Pesez les composants respectifs de la matrice et dissolvez-les dans de l’eau afin d’obtenir des conditions isotoniques. Ajustez la solution avec l’excipient, le chlorure de sodium, ou d’autres solutés compatibles avec les cellules. Pour resuspendre homogènement les cellules dans une solution de faible viscosité, vortexez-les dans les solutions de haute viscosité.

Ajoutez une barre magnétique et agitez le mélange. Ensuite, répartissez les formulations dans des vials préalablement pesés pour lyophilisation et pesez les vials. Prélevez 100 microlitres de chaque échantillon et effectuez des dilutions sérielle d'un facteur dix, plaquez les dilutions souhaitées et incubez-les à température ambiante. Si les vials doivent être scellés à l'intérieur du lyophilisateur, placez un bouchon en caoutchouc sur chaque vial à partir des cellules ensemencées.

Compter les cellules dans chaque formulation. En utilisant la méthode du du Nou, mesurer la tension superficielle des mélanges bactériens partiellement séchés. Nettoyer l'anneau en platine en le plaçant dans une flamme incolore jusqu'à ce qu'il devienne rouge.

À l’aide d’acétone et d’un tissu sans peluches, rincez et essuyez le récipient de mesure, puis passez une flamme à l’intérieur. Remplissez le récipient avec la solution et laissez la surface se stabiliser avant de mesurer, pour les solutions qui mettent du temps à atteindre l’équilibre. Le dispositif utilisé ici fournira des données qualitatives pour les formulations présentant une forte viscosité.

Utilisez une solution de concentration plus faible pour mesurer la tension superficielle et extrapolez que les conditions de lyophilisation doivent être ajustées en fonction des propriétés physiques de la formulation. Le paramètre le plus important est la température de transition vitreuse ou TG de la formulation, notée TG prime pour l'échantillon concentré par congélation, ce qui indique que de l'eau est encore présente. Pour déterminer le comportement de congélation de la formulation, placez cinq à dix milligrammes de l'échantillon dans un creuset en aluminium pour analyse par calorimétrie différentielle à balayage (DSC) avec couvercle.

Préparez un creuset vide comme référence. Réglez le programme de balayage thermique de la DSC pour imiter l'étape de congélation du programme de lyophilisation. Ceci est effectué parce que la cinétique de refroidissement peut influencer la température de transition vitreuse des formulations non lyophilisées avant le début du balayage thermique.

Abaisser la température bien en dessous de la tg attendue. Pour les formulations étudiées, choisir une vitesse de chauffage appropriée. Le signal d'effet thermique enregistré s'exprime en watts et sera influencé par la vitesse de chauffage.

Un taux de chauffage plus élevé produira un signal plus important de TG prime. Régler la plage de température de manière à couvrir à la fois la TG prime et la fusion de la formulation. Une fois le comportement de congélation déterminé, ajuster les paramètres du processus de lyophilisation afin que la température de l'échantillon reste toujours inférieure à la TG de l'échantillon et que la pression dans la chambre permette une sublimation rapide de la glace et de l'eau résiduelle dans la formulation. Pour protéger les produits secs après lyophilisation.

Contrôlez l'atmosphère de l'échantillon en scellant les échantillons dans le lyophilisateur avant que le vide ne soit relâché à la fin du cycle de lyophilisation. Alternativement, les flacons peuvent être remplis avec une atmosphère choisie. Il est important d'éviter d'exposer les échantillons aux conditions ambiantes, car toute humidité ou oxygène présent dans l'atmosphère de stockage influencera la survie des cellules.

Enfin, peser les vials pour analyser les échantillons par rayons X. Déposer une petite quantité de la matrice bactérienne sur un porte-échantillon et installer le porte-échantillon dans le réfractomètre à rayons X. Utiliser le logiciel compatible avec l'équipement à rayons X pour analyser toute phase cristalline présente dans l'échantillon.

Pour analyser la matrice bactérienne par microscopie électronique, déposez une petite quantité sur du ruban de carbone fixé sur un porte-objet pour microscopie électronique à balayage. Insérez le porte-objet dans un appareil de pulvérisation, puis recouvrez l'échantillon d'or et de palladium ou de platine afin d'obtenir une image. Placez le porte-objet dans la chambre d'observation et sélectionnez les paramètres d'imagerie appropriés.

Par exemple, sur cet instrument, nous utilisons une tension d'accélération de cinq kilovolts, une taille de spot de trois, une distance de travail de cinq millimètres et le détecteur d'électrons secondaires. Ce tableau présente les données pour différentes formulations, incluant les événements thermiques enregistrés par DSC lors du chauffage des formulations congelées, la structure des échantillons secs et la tension superficielle des solutions de formulation. La Tg' du saccharose est de moins 40 degrés Celsius et il peut être difficile de détecter les concentrations de saccharose inférieures à 20 % poids par poids.

L'événement thermique à moins 35 degrés Celsius est probablement lié au début de la dissolution de la glace illustré ici. Données de survie pour la bactérie gram-négative P putter et la bactérie gram-positive, a CHLOROPHYL cus, formulées dans différentes préparations à base de saccharides. Remarquez que la tendance concernant l'efficacité des formulations à soutenir la survie cellulaire est similaire pour les deux espèces de bactéries.

Ce graphique illustre la corrélation entre la survie après lyophilisation et les tensions superficielles des formulations, indiquant que des tensions superficielles plus élevées entraînent des taux de survie plus importants. Les images MEB présentées ici représentent des formulations sèches pour quatre polymères différents dont les matrices ont l'apparence de papier croustillant ou de feuillets lisses interconnectés avec des motifs ondulés contenant des bactéries pour fi, ccal et le saccharose. Les feuillets mesurent environ un micron d'épaisseur et de 10 à 20 microns de large, fi ccal présentant une surface plus lisse que HPMC et HEC pour des feuillets nettement plus minces.

Et les bactéries sont plus facilement visibles, probablement parce que le rapport polymère-bactéries est plus faible dans ces formulations à base de cellulose. De plus, des cristaux de sel ont été observés pour l'HEC et l'HPMC, cette dernière présentant une quantité plus importante de précipités à la surface des feuilles de polymère. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment la survie cellulaire dépend des propriétés de la formulation, en utilisant les techniques présentées ici.