Isolement des cellules T CD4 + des ganglions lymphatiques de souris en utilisant Miltenyi MACS Purification

Il s'agit d'un aimant Max MIDI. Il indique : attention, champs magnétiques extrêmement puissants. Bonjour, je suis Melanie Matthew du laboratoire de Mike Collins au département de physiologie et de biophysique de l'Université de Californie à Irvine.

Aujourd'hui, nous allons vous montrer une préparation par sélection négative de cellules T CD4 positives à l'aide des kits de Milton Biotechnology. Ici, nous avons le Minimax et les aimants Minimax. Le Minimax est utilisé pour des séparations de plus grande ampleur. Vous pouvez traiter jusqu'à 10⁹ cellules à l'aide d'une colonne insérée dans le Minimax, tandis que les aimants Minimax sont destinés à des volumes cellulaires beaucoup plus faibles.

Ainsi, selon que vous effectuez une séparation positive ou négative, vous marquerez vos cellules avec l'anticorps approprié. Ces anticorps portent une microbille magnétique qui s'attachera à l'aimant. Dans le cas d'une sélection négative, les cellules qui vous intéressent passeront à travers la colonne et vous pourrez recueillir l'écoulement, qui contiendra vos cellules d'intérêt.

Je dois mentionner que les techniques que je vous montre ce soir ne sont pas stériles. Par conséquent, si vous souhaitez utiliser ces cellules pour une culture cellulaire, vous devez tout effectuer dans une hotte de culture tissulaire avec des instruments stériles. Ainsi, même si je vous montre une préparation de cellules T positives pour le CD4, bon nombre de ces techniques s'appliquent à la purification d'autres types cellulaires à l'aide des kits de Miltenyi Biotec.

D'accord, j'ai prélevé les ganglions lymphatiques de la souris, et je vous montre en détail comment procéder dans le numéro sept de JoVE, consacré à la préparation des ganglions lymphatiques pour l'imagerie à deux photons. Maintenant, je vais broyer les ganglions lymphatiques afin d'obtenir une suspension monocellulaire à l'intérieur d'un tamis cellulaire de 70 microns. Très bien, je broie maintenant les ganglions lymphatiques pour obtenir une suspension monocellulaire en utilisant l'embout arrière d'une seringue de six millilitres.

Les ganglions lymphatiques sont dans du RPMI à l'intérieur d'un filtre, et il est important de préparer une suspension monocellulaire adéquate. La raison pour laquelle nous effectuons cette étape dans un filtre est de s'assurer qu'il n'y ait aucun agrégat cellulaire. Ainsi, lorsque j'aurai terminé le broyage, je vais retirer le filtre du milieu, puis utiliser les cellules qui ont traversé le tamis et la suspension monocellulaire.

Lorsque vous broyez, vous devez vous assurer de perturber autant que possible tous les tissus. Cette suspension de cellules uniques est celle à partir de laquelle nous purifierons nos cellules T positives pour le CD4. Très bien, j'ai maintenant terminé le broyage du tissu et vous pouvez constater que la plupart des ganglions lymphatiques ont pratiquement disparu.

Nous avons encore quelques petits morceaux de graisse et une sorte d’enveloppe de ganglion lymphatique ici, avec un peu de tissu conjonctif, le tout collé ensemble provenant des six ganglions lymphatiques. Et maintenant, j’enlève le filtre à cellules. Vous pouvez constater ici que le milieu est très trouble.

Il est rempli de cellules provenant de la suspension monocellulaire afin de s'assurer que nous obtenons un nombre maximal de cellules issues du filtre, dont certaines adhéreront à celui-ci. Je le lave avec quelques millilitres de milieu, puis je transfère l'ensemble du milieu dans un tube Falcon de 15 ml et je centrifuge pour former un culot cellulaire en vue de la purification ultérieure. Voici donc ma suspension monocellulaire, centrifugée et mise en culot à 300 ×g pendant 10 minutes.

Si vous pensez que vous allez avoir une forte proportion de cellules mortes dans votre suspension unicellulaire, il est conseillé d'utiliser le kit de suppression des cellules mortes de Miltenyi. Maintenant que j'ai centrifugé mon échantillon, je vais décanté le milieu et effectuer une lyse des globules rouges, puis je vais compter les cellules et appliquer un kit de sélection négative des lymphocytes T CD4 positifs sur ces cellules en particulier. Très bien, je vais maintenant réaliser une lyse des hématies.

Nous allons lyser les globules rouges que nous avons mis en pellet avec les lymphocytes en diminuant l'osmolarité de la solution, en ajoutant d'abord de l'eau, puis en ramenant la solution à une concentration 1 x en ajoutant du D-B-P-S 10 X. Nos lymphocytes sont plus résistants aux variations d'osmolarité que les globules rouges, mais nous devons tout de même agir rapidement, sinon nous lyserez les lymphocytes, ce que nous ne souhaitons pas. Une partie de l'efficacité rapide consiste à préparer au préalable les volumes nécessaires pour la lyse avant d'ajouter effectivement de l'eau au système.

Je veux donc pouvoir ajouter mon 10 X-D-B-P-S quelques secondes après avoir ajouté mon eau, afin de m'assurer de ne pas lyser mes lymphocytes tout en ajustant la lyse des globules rouges. J'ajoute donc 900 microlitres d'eau, presque un millilitre, et cent microlitres de 10 X-D-B-P-S.

J'ai les deux pipettes prêtes à l'emploi. Dans le lyso, j'ajoute l'eau, attends quelques secondes, secoue éventuellement un peu le tube, puis ajoute le DBPS 10 X, et secoue encore un peu le tube. Et si vous avez un grand nombre de globules rouges que vous êtes en train de lysater, vous verrez apparaître un gros agrégat amorphe constitué de tous les membranes cellulaires rompues.

Nous en avons un peu ici et vous pouvez constater qu'il s'agit de membranes cellulaires partiellement rompues. Ainsi, après avoir effectué la lyse, au cas où une erreur de pipetage se serait produite, j'aime ajouter quelques millilitres de milieu aux cellules afin de m'assurer que l'osmolarité est correcte et que nous n'entamions pas davantage la lyse. Très bien, j'ai maintenant mes lymphocytes en suspension monocellulaire.

Encore une fois, j'ai procédé à la lyse des globules rouges et je vais maintenant les centrifuger pour former un culot. Avant cela, je vais les compter au cytomètre hématique afin de déterminer la quantité d'anticorps à ajouter pour le kit de sélection négative des cellules T CD4 positives. Très bien, maintenant je centrifuge les cellules dans du tampon Max et vous pouvez constater que le culot est beaucoup plus blanc après la lyse des globules rouges.

Et je vais effectuer une sélection négative des cellules T CD4 positives. Je vais donc verser tout le milieu, tout le tampon Max dans lequel j'ai mis en suspension les cellules. Ensuite, je vais les marquer avec le cocktail d'anticorps biotinylés, ce qui correspond à l'étape un de la sélection négative des cellules T CD4 positives.

Ensuite, j'incube au réfrigérateur pendant 10 minutes. Très bien, mes cellules ont terminé leur incubation initiale. Maintenant, je vais ajouter l'antibiotique aux microbilles et les remettre au réfrigérateur pendant 15 minutes.

Pour cette séparation cellulaire particulière, nous utilisons une colonne LS de Miltenyi Biotec et nous allons la placer sur le support magnétique. Nous préparons la colonne en y faisant passer trois millilitres de tampon MACS. Nous allons ouvrir la colonne et la positionner de manière à ce que les ergots soient orientés vers l'intérieur, en direction de l'aimant. Maintenant, je vais ajouter le tampon MACS dans la colonne, et vous devez voir le liquide descendre le long de la colonne LS et commencer à goutter par le bas. Ne vous inquiétez pas si la colonne s'assèche.

La tension superficielle du liquide empêchera celui-ci de s'assécher jusqu'à l'ajout de vos cellules. Avant d'ajouter vos cellules, il est important de laisser le tampon Max s'écouler complètement à travers la colonne. Bon, après l'incubation de 15 minutes avec nos billes magnétiques d'anticorps biotinylé liées aux cellules et au tampon Max, je vais verser le tampon, puis les resuspendre dans un volume de tampon adapté à notre nombre de cellules.

Vous devrez donc consulter votre protocole milli tiny à ce sujet. Ensuite, je vais appliquer les échantillons à la colonne que nous venons de rincer avec le tampon max. Nous allons maintenant ajouter la suspension cellulaire à la colonne.

Et puisque c'est une colonne de sélection négative, nous allons récupérer les cellules qui ont traversé, qui devraient toutes être des lymphocytes T CD4 positifs dans ce cas. Maintenant, je vais laver la colonne avec 12 mils de tampon max, et là encore, nous récupérons l'éluate, qui devrait contenir uniquement des lymphocytes T CD4 positifs. Ensuite, je vais centrifuger les lymphocytes T CD4 positifs, les resuspendre, puis les marquer avec la sonde appropriée que je vais utiliser pour l'imagerie de la protéine tau.

Je vais également prélever un petit échantillon des cellules que j'ai purifiées, les marquer avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD4, puis les analyser par cytométrie en flux afin de m'assurer d'obtenir une population homogène de lymphocytes T CD4 positifs. Voici donc un aperçu des cellules que nous venons de centrifuger. Il devrait s'agir d'une population pure de lymphocytes T positifs pour CD3 et CD4.

J'ai donc vient de vous montrer la sélection négative des lymphocytes T CD4 positifs. À l'aide du kit de biotechnologie Milit Tiny, nous allons transférer ces cellules de façon adoptive dans une souris et les utiliser pour l'une de nos propres expériences avec T Photon et la machine. Bonne chance avec vos propres expériences.