Quantification automatisée de la fluorescence dans Synaptic

L'objectif de cette procédure est de quantifier efficacement les dimensions et la luminosité des signaux fluorescents ponctuels chez les gans. Ainsi, de grandes populations d'objets peuvent être analysées. Les protéines synaptiques sont imagées de manière statistique.

Dans cette démonstration, la première étape de la procédure consiste à générer des cultures synchronisées à haute densité des ELEGANS d'intérêt. Ensuite, obtenir des images confocales des synapses marquées en minimisant la variabilité individuelle des images. Les puncta synaptiques sont automatiquement identifiés et distingués de la fluorescence de fond.

La dernière étape consiste à tabuler et organiser les données pour une analyse en aval efficace. En définitive, les résultats peuvent montrer avec précision comment les conditions expérimentales influencent la distribution des protéines synaptiques ou de toute autre protéine localisée dans des points de forte intensité. L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'analyse des projections de Zack, est que toutes les données sont conservées, y compris les volumes des synapses, et que l'identification automatisée permet de recueillir rapidement des centaines d'échantillons par condition. Testé.

Ce protocole nécessite des cultures denses de vers adultes CL egan's, cultivés sur des plaques en agar NGM de 10 centimètres de haut avec des bactéries NA 22 e Coli, en ayant préparé exactement une plaque pour chaque coloration immunologique prévue. Commencez par récolter les vers avec quelques millilitres d'eau. Transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres et répétez ce processus jusqu'à ce que la majorité des vers soient collectés.

Centrifuger les vers et laver le culot avec de l'eau jusqu'à trois fois jusqu'à ce que le surnageant soit clair. Cette étape élimine les bactéries résiduelles ; transférer toujours les solutions pouvant ou contenant des vers ou des œufs à l'aide de pipettes en plastique, car ils peuvent adhérer au verre. Il est maintenant essentiel d'aller rapidement à travers les étapes restantes afin d'éviter une perte de viabilité des œufs.

Libérez les œufs des vers en les redéformant dans cinq millilitres de solution hypochlorite alcaline. Agitez doucement les tubes et examinez-les au microscope stéréoscopique environ une fois par minute. Au bout de cinq minutes, ou dès que la moitié environ des vers dans un tube semblent courbés et ouverts.

Remplissez le tube jusqu’en haut avec du tampon à œufs et retournez-le plusieurs fois. Après avoir centrifugé pour former le culot, aspirez et jetez le surnageant. Lavez ensuite le culot trois fois avec du tampon à œufs.

Après les lavages, Reese resuspend le culot dans cinq millilitres d'eau, puis ajoute cinq millilitres de solution stérile de 60 % de saccharose dans l'eau et mélange soigneusement. Après la centrifugation de la suspension, les œufs se trouveront au ménisque et apparaîtront troubles.

Transférez chaque prélèvement d'œufs sur une plaque NGM Agar de 10 centimètres non ensemencée. De l'eau peut être utilisée pour rincer X sur la plaque, mais essayez de minimiser la quantité de liquide transférée. Incubez les plaques toute la nuit à 20 degrés Celsius pendant les premières heures. Aérez les plaques en laissant les couvercles légèrement entrouverts, mais veillez à les couvrir pendant la nuit.

Après l'éclosion, transférez les larves L1 dans un tube conique de 15 millilitres rempli de S basil. Récupérez les L1 par centrifugation et resuspendez-les dans un volume minimal de S basil. Ensuite, répartissez chaque prélèvement de L1 sur deux plaques de gélose NGM de 10 centimètres ensemencées avec des bactéries NA22.

Surveillez les cultures une ou deux fois par jour. S'ils risquent de subir la famine, transférez-les sur des boîtes de milieu NA 22 fraîches avant qu'ils n'aient faim, pendant que les lignées de type N deux s'assemblent et progressent ensemble comme une vague en s'éloignant des zones dépourvues de nourriture sur ces boîtes ; la nourriture sera alors complètement épuisée en quelques heures.

Lorsque les vers atteignent l'âge souhaité, ils sont prêts à être montés pour une immunomarquage ou une imagerie en direct. Pour l'imagerie confocale, utilisez un milieu de montage Antifa pour ajuster leur densité à quelques centaines de vers par microlitre.

Avec de l'expérience, cette densité peut être reconnue grâce à la turbidité de la suspension. Idéalement, les vers seront densément groupés sur la lame de microscope, sans toutefois se chevaucher excessivement. Sur la lame, préparer un coussin de 2 % d'agarose dans du milieu ESP entouré d'un fin anneau de vaseline.

Pour éviter l'évaporation pendant l'observation, appliquez le Vaseline à l’aide d’une seringue de trois millilitres munie d’une aiguille de calibre 25 dont la pointe a été coupée. Prélevez ensuite à la pipette quelques microlitres de la suspension de vers sur une lame couvre-objet en utilisant une pointe de pipette dont l’extrémité a été coupée afin d’éviter de sectionner les vers, puis déposez délicatement le coussin en agarose sur la lame couvre-objet, en répartissant uniformément les vers sur le coussin sous le microscope. Les synapses d’intérêt doivent être orientées de façon à pointer directement vers l’objectif ou dans un angle inférieur ou égal à 45 degrés par rapport à celui-ci uniquement.

Prenez quelques secondes pour éviter le photoblanchiment. La culture et les conditions doivent fournir suffisamment de vers pour satisfaire ce critère strict illustré ici par une orientation idéale, avec le cordon ventral orienté directement vers l'objectif du microscope. Celui-ci serait rejeté car le cordon ventral est orienté directement à l'opposé de l'objectif.

Remarquez comment la corde dorsale orientée vers l'objectif dans cet échantillon produit une image plus nettement focalisée. Voici un autre exemple qui serait rejeté parce que les cordons dorsal et ventral sont orientés aux bords du ver. Ainsi, la lumière d'excitation et d'émission doit traverser davantage de tissu du ver et deviendrait déformée.

Le principal défi consiste à minimiser la variabilité au sein des groupes de traitement : la synchronisation par âge et le choix de vers dont la structure d'intérêt est orientée directement vers l'objectif de l'objectif peuvent beaucoup aider. Commencer avec de grandes cultures augmente le choix de vers pour une cohérence maximale. Pour obtenir les meilleurs résultats d'imagerie, choisissez des échantillons relativement plats pouvant être intégrés dans une pile de 14 images ou moins.

Sections de 0,4 micron d'épaisseur. Des images à grande vitesse et faible résolution suffisent pour une collecte de données rapide et précise. Évitez de saturer le détecteur avec des signaux trop intenses, car cela entraînerait une sous-estimation des signaux de fluorescence.

Cette démonstration utilise le logiciel commercial Velocity, qui doit être d'au moins la version 4.0. De nombreux autres logiciels disponibles perdent les informations tridimensionnelles. Après avoir ouvert les fichiers de sortie au format TIFF multiple provenant du microscope confocal, sélectionnez l'image, puis la mise au point étendue, puis le tracé à main levée.

La zone d'intérêt recadre désormais les zones de l'image qui ne contiennent pas la structure étudiée. À l'aide de l'outil activé, la mise au point étendue fournit une projection en plan Z afin de faciliter la sélection de la zone d'intérêt. Ceci n'affecte pas les données sous-jacentes.

De même, les ajustements de luminosité et de contraste n'affectent pas les données sous-jacentes. Terminez le rognage en sélectionnant actions et rognage à la sélection. Ensuite, mesurez la longueur de la zone analysée.

À l'aide de l'outil ligne, la longueur de la ligne sera calculée et ajoutée au tableau de données. Identifiez maintenant les objets à l'aide du filtre d'objets par intensité en mode mesures. L'inclusion d'un marqueur synaptique indépendant marqué avec une couleur unique peut aider à identifier sans ambiguïté les synapses ; définissez un seuil de manière à ce que les groupes synaptiques soient mis en évidence tandis que le fond non synaptique ne le soit pas.

Effectuez cela une seule fois en utilisant un échantillon témoin et utilisez-le pour tous les échantillons ultérieurs ; seuiller chaque échantillon séparément est inacceptable, car cela introduit un risque de biais expérimental. Les objets sont sélectionnés et tabulés automatiquement. Les synapses typiques varient de quelques à quelques centaines de voxels ; avant d'exporter les données, triez-les par taille d'objet.

Cela facilite la suppression en aval des objets constitués de deux voxels ou moins, qui sont généralement de simples artefacts de fond. Exportez maintenant les données au format CSV, qui peut être ouvert par n'importe quel tableur. Chaque image produit un fichier de sortie permettant de trier et d'exporter les micrographies du cordon nerveux ventral des gan gl de CL montrant que 49 récepteurs GABA ont été obtenus avec le protocole décrit.

Tous les animaux présentaient une taille et une maturité très similaires. Les valeurs totales de fluorescence synaptique pour cinq vers ont été normalisées par rapport à la longueur du cordon nerveux analysée. Ces données présentaient des valeurs d'erreur standard d'environ 10 % de la moyenne.

L'image de gauche est brute, sans seuil ni suppression du fond spécifique. Les synapses ont été traitées avec du muscarmal, un agoniste des récepteurs GABA qui provoque une régulation à la baisse des récepteurs après une exposition prolongée. La fluorescence totale a été quantifiée et normalisée par rapport à la longueur du cordon nerveux et à la probabilité cumulative.

Des histogrammes du contenu en fluorescence des synapses individuelles ont été calculés. Il en va de même pour le volume des synapses. Ces mesures montrent que l'exposition à l'agoniste réduit significativement le contenu synaptique et le volume.

Dans l'ensemble, les résultats quantitatifs doivent toujours refléter ce qui peut être apprécié visuellement. Si ce n'est pas le cas, l'inspection des images et des objets identifiés par la vitesse doit révéler l'origine de l'erreur et suggérer des mesures correctives telles que le seuillage ou la suppression d'artéfacts lors de la réalisation de cette procédure. Il est essentiel de choisir les vers à imager en fonction de leur orientation géométrique plutôt que d'une évaluation subjective de la qualité de l'image ; dans la mesure du possible, une notation en aveugle est fortement recommandée.