L'épuisement et la reconstitution des macrophages chez la souris

Les macrophages jouent un rôle central dans l'homéostasie et de la pathologie dans de nombreux tissus. Le protocole présenté ici décrit des méthodes pour épuiser les macrophages

Le but de l’expérience suivante est de déterminer le rôle des macrophages polarisés dans un processus biologique in vivo. Ceci est réalisé en appauvrissant d’abord les macrophages des souris. Ensuite, de nouveaux macrophages, qui expriment des caractéristiques uniques et ont des fonctions distinctes, sont générés.

Ensuite, les macrophages polarisés sont transférés adoptivement chez la souris pour déterminer leur rôle dans le processus biologique d’intérêt. En fin de compte, les différences dans l’inflammation médiée par les macrophages en fonction de la maladie clinique et histologique peuvent être mesurées. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le croisement de souris sur un fond BDTR CD 11 est que cette méthode est plus rapide que l’élevage de souris.

Pour les expériences. C’est relativement facile et rentable et peut être réalisé avec des souris de n’importe quel patrimoine génétique. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du rôle des macrophages dans l’intestin, elle peut également être appliquée à une variété d’autres organes, notamment le foie, la rate et les poumons.

Deux heures avant l’injection, retirer les tubes de liposomes et de PBS du stockage à quatre degrés Celsius. Lorsque les liposomes ont atteint la température ambiante, retournez les tubes huit à 10 fois pour assurer une distribution uniforme. Ensuite, chargez 200 microlitres de suspension chaude à liposomale dans une seringue d’un millilitre et fixez une aiguille de calibre 26.

Faites rouler la seringue entre les paumes des deux mains et retournez-la six fois pour répartir uniformément la solution liposomale avant l’injection. Maintenant, utilisez une main pour ébouriffer, une souris juste en dessous des oreilles, en tenant suffisamment de peau pour immobiliser sa tête et ses membres, puis inclinez la souris de manière à ce que sa tête soit légèrement vers le sol. Ensuite, tenez la seringue à un angle de 30 à 40 degrés.

Insérez l’aiguille dans le quadrant inférieur droit de l’abdomen et injectez 200 microlitres de solution liposomale. Après avoir euthanasié une souris de huit à 12 semaines et attaché les membres en position étirée, retirez les fémurs et les tibias en coupant autant de muscle que possible pendant le processus de dissection. Chargez ensuite une seringue de cinq millilitres avec de l’IMDM avec 10 % de FCS.

Fixez une aiguille de calibre 26 et rincez la moelle des os. Diluez les ponctions de moelle osseuse dans 40 millilitres d’IMDM avec FCS, puis transférez les cellules dans un flacon de culture tissulaire de 75 centimètres carrés. Incuber la culture à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone après quatre heures.

Prélevez le supinate dans un tube conique de 50 millilitres et centrifugez les progéniteurs non adhérents pendant cinq minutes à 300 fois G et à température ambiante. Après le comptage, cultivez les cellules récupérées à une concentration de 0,5 fois 10 à six cellules par millilitre dans un milieu complet dans des flacons frais de 75 centimètres carrés. Le quatrième jour, faites tourner les cellules de non-adhérence et remettez-les dans les flacons dans un milieu frais.

Le septième jour, jetez les cellules de non-adhérence et remplacez-les par des milieux frais. Le 10e jour, jetez le support. Ajoutez ensuite cinq millilitres de tampon de dissociation cellulaire dans la fiole.

Après cinq minutes, frappez fermement le côté de la fiole avec le talon de la paume d’une main à plusieurs reprises. Examinez les cellules au microscope pour vous assurer qu’elles se sont détachées du fond du flacon. Ensuite, pipetez les cellules remises en suspension dans un tube conique de 15 millilitres.

Lavez le flacon avec 10 millilitres supplémentaires d’IMDM plus FCS, puis faites tourner les cellules pendant cinq minutes à 300 fois G et à température ambiante. Après le comptage, remettez en suspension les cellules récupérées à une concentration de 10 à sept cellules par millilitre dans du PBS stérile en réservant une fois 10 aux six macrophages pour les évaluations du phénotype des macrophages Commencez par équiper une seringue d’un millilitre remplie de 100 microlitres à la suspension de macrophage qui vient d’être préparée avec une aiguille de calibre 26. Ensuite, la souris plus chaude utilise une lampe chauffante pendant cinq à 10 minutes pour dilater la veine de la queue.

Après avoir transféré la souris sur un dispositif de retenue, faites pivoter la queue de 90 degrés pour que la veine soit tournée vers le haut. Nettoyez le site d’injection avec un tampon imbibé d’alcool, puis tenez l’aiguille avec le biseau vers le haut. Et à un léger angle, insérez l’aiguille presque parallèlement à la veine.

Si l’aiguille est insérée correctement, qu’aucune résistance ne doit être ressentie et que la veine doit devenir claire après l’injection. Suite à l’injection, appliquez une légère pression sur le site d’injection jusqu’à ce que le saignement cesse. Ces coupes immunohistochimiques d’un côlon de souris démontrent que l’injection intrapéritonéale de clodronate contenant des liposomes entraîne une diminution des macrophages positifs F quatre 80 au cours de la colite induite par le DSS, comme en témoigne la diminution de la coloration F quatre 80 chez les souris brunes par rapport aux souris témoins injectées de PBS arginase un positif. Alternativement, les macrophages activés en brun sont également épuisés avec succès à l’aide d’injections de liposomes de clodronate.

La tache bleue de cette figure et de la figure précédente représente les noyaux, car le graphique à barres montre une évaluation quantitative de F quatre positifs 80 macrophages dérivés de MCSF et d’une arginase positive. Alternativement, les macrophages activés dérivés de MCSF plus IL quatre traités indiquent que les deux populations sont significativement appauvries chez les souris qui reçoivent des injections intrapéritonéales de liposomes de clodronate. Ces données démontrent les résultats d’un dosage typique des graisses, qui mesure les niveaux d’oxyde nitrique en réponse au lipopolysaccharide en détectant son métabolite en aval, le nitrite.

Ainsi, les macrophages dérivés de MCSF activés classiquement produisent des niveaux significativement plus élevés de nitrite par rapport aux macrophages dérivés de MCSF activés alternativement plus IL quatre traités. Les macrophages activés de manière classique produisent également un rapport IL 12 P 70 à IL 10 plus élevé que les macrophages activés alternativement, tels que mesurés par ELA, compatibles avec un phénotype activé alternativement. Les macrophages dérivés de MCSF traités avec l’IL quatre expriment constitutivement YM un et l’arginase un tel que détecté par l’immuno-soie dentaire occidentale.

Ici, le nombre total de macrophages M1 activés classiquement et le nombre de macrophages M deux alternativement activés sont énumérés dans des coupes histologiques de souris injectées avec des macrophages polarisés dérivés de la moelle osseuse. La barre de données C indique les souris témoins qui ont reçu une injection de PBS sans macrophages. L’impact du transfert de macrophages polarisés sur le côlon au cours de la colite induite par le SSD est indiqué par l’indice d’activité de la maladie, un score additif basé sur la perte de poids, les saignements rectaux et la diminution de la consistance des selles.

Notez que les macrophages M1 n’ont pas d’impact sur l’inflammation, tandis que les macrophages M deux réduisent considérablement l’indice d’activité de la maladie. Par conséquent, ces résultats démontrent que les macrophages transférés adoptivement dérivés de dex vivo peuvent se déplacer vers le côlon et avoir un impact sur l’inflammation induite après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs qui étudient la biologie des macrophages pour explorer le rôle de la polarisation des macrophages chez la souris.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer le rôle des macrophages polarisés dans l’homéostasie et dans la maladie chez la souris.