NADH imagerie par fluorescence de biventriculaire isolé travail coeurs de lapin

L'objectif général de cette procédure est d'étudier le métabolisme. En utilisant l'imagerie du NADH sur un cœur fonctionnel, cela est réalisé en isolant d'abord le cœur de lapin. La deuxième étape de la procédure consiste à canuler avec succès les quatre cavités cardiaques afin d'obtenir un modèle de cœur fonctionnel.

La dernière étape consiste à installer le matériel d'imagerie et à recueillir des données sur le NADH à différents rythmes de stimulation. En fin de compte, les résultats peuvent montrer les changements métaboliques du cœur par imagerie de la fluorescence du NADH. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la perfusion rétrograde au lanor, est que le cœur fonctionne dans son état physiologique, avec un flux dans le sens normal et le cœur assurant lui-même la pression nécessaire à la perfusion coronaire.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles en électrophysiologie et sur les mécanismes des arythmies mortelles. Elle permet cela en fournissant un modèle physiologique pour étudier le lien entre le métabolisme du flux coronaire et l'activité électrique. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de canulation des vaisseaux et des cavités cardiaques sont difficiles à apprendre.

Une technique inappropriée peut endommager le cœur et compromettre le reste de l'expérience. Avant de commencer une expérience, rincez toutes les tubes dans les chambres du système cardiaque fonctionnel avec de l'eau purifiée, puis purgez l'eau du système en faisant fonctionner les pompes. Ajoutez des filtres à membrane en cellulose en ligne avec la pompe de perfusion LOR, la pompe de perfusion du cœur gauche et la pompe de perfusion du cœur droit.

Après avoir ajouté le PERFUSE huit au système, effectuez une calibration à deux points pour chaque capteur de pression. Allumez le bain d'eau chaude thermostaté qui réchauffe les tubes à double enveloppe et les échangeurs de chaleur. Allumez le bain d'eau, utilisé pour chauffer le PERFUSE huit.

Mettez en marche les pompes qui font circuler le PERFUSE huit en circuit fermé, puis allumez le réservoir de circulation afin d'oxygéner le Perfuse huit. Vérifiez que l'oxygénateur en microfibre ou les filtres hématiques fournissent 95 % d'oxygène au Perfuse huit à une pression de 80 kilopascals. Enfin, assurez-vous que les échangeurs de chaleur maintiennent la température du Perfuse en circulation.

Huit à 37 degrés Celsius, commencez l'excision cardiaque en configurant d'abord le système cardiaque fonctionnel pour fonctionner en pression constante. Mode LRF. Réglez la pression du bloc aortique entre 50 et 60 après avoir sédaté un lapin.

Injecter du pentobarbital et de l'héparine soit dans la veine marginale de l'oreille, soit dans la veine saphène latérale située à l'intérieur du membre postérieur. Dès que le lapin perd le réflexe douloureux, ouvrir rapidement la cavité thoracique. Inciser le péricarde, pincer l'aorte et exciser le cœur et les poumons.

Les poumons sont conservés attachés afin de faciliter l'isolement des veines pulmonaires. Ensuite, remplissez une seringue avec 60 millilitres par F huit et 200 unités d'héparine. Fixez une canule de cinq millimètres et canulez l'aorte.

Fixez l'aorte à la canule à l'aide de fils de soie de taille zéro. Ensuite, appuyez lentement sur la seringue pour chasser le sang à travers le cœur. Installez le système cardiaque fonctionnel en raccordant d'abord le cœur au bloc aortique.

Approchez le raccord selon un angle oblique et laissez goutter doucement le Perfuse eight du raccord vers la canule pendant qu'elle est fixée. Cela empêche l'air d'entrer dans l'aorte, évitant ainsi les embolies coronaires pendant que le cœur est perfusé sous pression constante. Mode L endorf.

Retirez la graisse et le tissu conjonctif, puis repérez les vaisseaux suivants : la veine cave inférieure et supérieure, la veine azygos, l'artère pulmonaire et les veines pulmonaires. Ensuite, ligaturez la veine cave supérieure.

Couper l'artère pulmonaire juste en dessous du point où elle se divise en artères pulmonaires droite et gauche. Les vaisseaux restants sont les veines pulmonaires. Les regrouper entre le cœur et les poumons et les ligaturer tous à l’aide d’un seul point de suture.

Cela est crucial pour deux raisons. Premièrement, ligaturer les vaisseaux reliés aux poumons permettra d'éviter toute fuite une fois la canulation terminée. Deuxièmement, il est important d'isoler les deux veines caves pour la canulation ultérieure.

Retirez maintenant les poumons. Faites un trou de taille appropriée dans le coin de l’appendice auriculaire gauche et assurez-vous qu’il est rempli abondamment de perfusat huit. Ensuite, canulez l’appendice tout en veillant à ce que la canule soit complètement remplie de perfusat huit.

Ensuite, tout en maintenant le tissu, suturer la canule à l'appendice. Le tissu de l'appendice auriculaire gauche est extrêmement délicat et peut facilement se déchirer. Il est donc essentiel de canuler l'oreillette gauche du premier coup, faute de quoi cela pourrait devenir impossible.

Mettez en marche la pompe numéro deux pour assurer un débit vers l'oreillette gauche. Réglez la précharge entre deux et six tor tout au long de l'expérience. La pression peut nécessiter un ajustement.

Conservez-le à moins de deux millimètres du niveau de pression cible. Passez maintenant le cœur en mode cœur fonctionnel en désactivant momentanément la pompe numéro un, la pompe de Langendorff. Diminuez la pression aortique jusqu'à 10 torr, puis augmentez-la lentement jusqu'à atteindre une valeur comprise entre 80 et 100 torr.

Cela permet à la valve aortique de s'ouvrir et de fonctionner comme elle le ferait dans des conditions physiologiques normales. Régler la pression finale de post-charge à une valeur d’environ 20. Tore inférieure à la pression ventriculaire gauche maximale, à l’aide d’une canule directement fixée au système.

Canuler l'oreillette droite par la veine cave inférieure et suturer la canule à la veine. Éviter d'introduire des bulles d'air. Mettre en marche la pompe numéro trois, la pompe du côté droit, afin d'assurer un débit vers l'oreillette droite.

Régler la pression à environ trois torr. Enfin, canuler le ventricule droit sans laisser entrer d'air et suturer la canule à l'artère pulmonaire. Ceci achève la canulation biventriculaire.

Procédez maintenant à l'acquisition du signal. Insérez soigneusement le cathéter du transducteur de pression dans l'aorte par l'intermédiaire de la canule aortique. Guidez-le délicatement à travers la valve aortique et dans le VD.

Le signal de pression du VG apparaîtra comme prévu lorsque la pointe du cathéter est correctement positionnée. Ensuite, appuyez doucement l'électrode du potentiel d'action monophasique contre l'épicarde ventriculaire. Un léger artefact de mouvement dans le signal de l'électrode est normal.

Placez ensuite une électrode de stimulation bipolaire sur l'oreillette droite afin de stimuler le cœur selon la position définie par le protocole expérimental. Et focalisez la caméra CCD sur la région d'intérêt du cœur. Un filtre d'émission doit être fixé à la caméra.

Pour faire apparaître la fluorescence du NADH, éteignez les lumières ambiantes afin d'illuminer de manière uniforme l'épicarde avec une source de lumière UV au poste de travail auquel la caméra est fixée. Réglez le logiciel pour acquérir des images à raison de deux images par seconde. Ensuite, sélectionnez le mode de mise à jour en direct pour surveiller l'intensité moyenne des pixels dans la région d'intérêt.

Si la perfusion était adéquate, les niveaux de NADH, représentés par la fluorescence, devraient être faibles et stables sur toute la surface épicrodique. Lancez maintenant l'expérience lorsque celle-ci est terminée. Retirez le cœur.

Drainez le PERFUSE huit et les tubulures et chambres du système avec de l'eau purifiée. Rincez périodiquement le système avec une solution TM muqueuse ou une solution d'eau oxygénée diluée en suivant le protocole décrit. Les cœurs ont été stimulés à des longueurs de cycle comprises entre 200 et 400 battements par minute.

La PTV diastolique se situait généralement entre 0 et 10 tor ; la pression aortique diastolique minimale était d’environ 60 tor. La PTV systolique maximale dépendait de la pression de remplissage et de la contractilité, et devait idéalement se situer entre 60 et 80 tor. La pression aortique maximale et la PTV maximale devaient être très proches. Les potentiels d'action monophasiques typiques du cœur de lapin présentent une phase de dépolarisation rapide et une phase de repolarisation caractéristique. Les potentiels d'action ont été facilement enregistrés à partir des préparations, mais présentaient généralement un petit artefact de mouvement durant la diastole.

Les valeurs moyennes de NADH fluorescent issues d'une région d'intérêt dans le cadre rouge ont été mesurées afin de suivre les modifications de l'état redox mitochondrial au cours de trois cycles de stimulation électrique à des longueurs de cycle de 300, 200 et 150 millisecondes, lorsque la fréquence de stimulation était proche du rythme sinusal. Le niveau de NADH de base restait relativement constant lorsque la longueur du cycle diminuait. En dessous de 300 millisecondes, les niveaux de base de NADH augmentaient, avec une augmentation maximale à 150 millisecondes ; le signal oscille en phase avec la contraction, et la fréquence des oscillations correspond à la fréquence cardiaque.

L'amplitude de ces oscillations était toujours inférieure à celle des tendances à plus long terme causées par l'ischémie ou l'hypoxie. L'imagerie fluorescente haute résolution du NADH sur toute la surface antérieure à 200 battements par minute était constante et spatialement homogène à 400 battements par minute. Les niveaux de NADH augmentaient considérablement dans tout l'épicarde.

Une hétérogénéité spatiale importante a été observée, les augmentations les plus marquées se produisant dans les régions septales du VD et du VG une fois la maîtrise acquise. Cette technique peut être réalisée en moins de 45 minutes si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à empêcher toute bulle d'air d'entrer dans l'aorte ou dans l'oreillette gauche après cette procédure.

Des méthodes supplémentaires, telles que le chargement du cœur avec un colorant sensible à la tension, peuvent être utilisées pour répondre à d'autres questions, comme établir un lien entre l'activité électrique et métabolique à la surface du cœur lors de scénarios pathologiques tels qu'une ischémie locale après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en physiologie cardiaque pour étudier le métabolisme cardiaque et les troubles de la conduction durant des conditions pathologiques, en utilisant un modèle plus pertinent sur le plan physiologique.