Mesure quantitative de invadopodes la protéolyse matrice extracellulaire dans des contextes simples et multicellulaire

Cette technique standard permet d'obtenir des lamelles recouvertes de gélatine marquée par un fluorochrome, adaptées aux dosages quantitatifs de la dégradation de la matrice par les invadopodes. Après avoir marqué les lamelles avec de la gélatine fluorescente, ensemencez les cellules et cultivez-les pour provoquer la dégradation de la matrice. Ensuite, fixez les cellules et coloriez-les de manière fluorescente pour les protéines marqueurs des invadopodes, acquérez les images et quantifiez la dégradation de la matrice.

Les résultats typiques permettent de quantifier les différences de dégradation de la matrice médiée par les invépodia entre des cellules ayant subi une modulation différentielle de gènes sélectionnés ou un traitement par des agents pharmacologiques. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la préparation de lamelles recouvertes de gélatine présentant une fluorescence homogène est difficile à obtenir en raison d’un dépôt inégal de la gélatine fluorescente ou d’une manipulation inappropriée des lamelles recouvertes de gélatine. La procédure sera démontrée par la professeure adjointe de recherche Karen Martin, l’associée postdoctorale Mandy Ammer et les étudiants diplômants Elise Walk, Karen Hayes et Steve Markwell.

Pour préparer la solution mère de gélatine-saccharose à 5 % non marquée, mélanger la gélatine et le saccharose dans du PBS et dissoudre complètement à 37 degrés Celsius. Conserver ensuite à quatre degrés Celsius. Passer ensuite à la purification des lamelles de verre.

Répartir un coverslip individuel dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire en plastique de 24 puits, ajouter 500 microlitres d'acide nitrique à 20 % dans chaque puits et incuber pendant 30 minutes. Après élimination de la solution d'acide nitrique, laver les coverslips trois fois avec de l'eau déionisée. Ensuite, recouvrir.

Chaque lame couvre-objet avec 500 microlitres de 50 microgrammes par millilitre de polyol, de lycine, et incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Éliminer la solution de polylysine et rincer trois fois avec du PBS. Le revêtement de poly-L-lysine facilite un revêtement uniforme et l'adhérence du gélatine marquée superposée. Placer les plaques à 24 puits sur de la glace et ajouter 500 microlitres de glutaraldehyde 0,5 % fraîchement préparé à chacun.

Incuber soigneusement les plaques sur de la glace pendant 15 minutes. Effectuer trois lavages avec du PBS froid, puis aspirer toutes les traces de PBS avant le revêtement à la gélatine. Entre-temps, durant l'incubation au glutaraldéhyde, reconstituer la gélatine marquée à l'Oregon Green 488.

Suivant le protocole du fabricant, réchauffez-le ainsi que la solution mère de gélatine-saccharose à 5 % non marquée à 37 degrés Celsius. Ensuite, diluez 500 microlitres de gélatine marquée dans quatre millilitres de gélatine non marquée. Appliquez au pipetage 100 microlitres du mélange de gélatine 488 diluée sur chaque lame.

Utiliser suffisamment de gélatine pour recouvrir la lame sans étalage manuel. Il est important de maintenir le mélange de gélatine diluée 488 à 37 degrés pendant la procédure de revêtement afin d'éviter une solidification prématurée. En outre, à partir de cette étape, garder les lames à l'abri de la lumière le plus possible pour éviter un éventuel photoblanchiment.

Une fois que tous les lamelles sont recouverts dans une même plaque, inclinez la plaque et retirez le retrait excédentaire de gélatine de chaque puits par aspiration sous vide. Incubez ensuite les lamelles recouverts à l’abri de la lumière pendant 10 minutes à température ambiante. Après avoir lavé les lamelles trois fois avec du PBS, ajoutez 500 microlitres de borohydrure de sodium, borohydrure de sodium.

L'hydrure est effervescent et de petites bulles seront visibles sur et autour de chaque lamelle ; incuber pendant 15 minutes à température ambiante pour réduire et inactiver le glutaraldéhyde résiduel. Retirer la solution de borohydrure de sodium par aspiration sous vide en effectuant un mouvement rapide et circulaire autour de l'extérieur de chaque puits, en prenant soin de ne pas aspirer les lamelles flottantes qui se seraient détachées du fond de la plaque de culture pendant le traitement au borohydrure de sodium. Après trois lavages au PBS, incuber les lamelles dans de l'éthanol à 70 % pendant 30 minutes à température ambiante.

En utilisant une technique stérile, transférez la lame porteuse contenant les plaques vers une hotte à flux laminaire de type II pour culture de cellules B, puis rincez les lames trois fois avec du PBS stérile à l’aide d’une aiguille stérile et de pinces. Transférez soigneusement les lames vers un puits vide d’une nouvelle plaque de 24 puits pour équilibrer les lames avec le milieu de culture adapté au type cellulaire spécifique en cours d’acidification.

Ensuite, ensemencez directement les cellules sur les lamelles après un temps d'incubation approprié. Traitez les échantillons pour l'imagerie en immunofluorescence afin de les monter. Déposez une goutte de réactif antifade prolongé gold ou d'un réactif similaire sur une lame de microscope et positionnez délicatement la lamelle retournée ; acquérez ensuite les images pour analyse.

Cette analyse fournit la surface de dégradation de la matrice normalisée par rapport à la surface des cellules ou au nombre de cellules. Elle est utile pour analyser des champs microscopiques complets contenant plusieurs cellules ayant été traitées collectivement avec des facteurs de croissance irna ou des agents thérapeutiques. Pour cette analyse, des images sont acquises à un grossissement inférieur suffisant pour recueillir efficacement des informations sur des populations cellulaires.

Ouvrez l'image dans ImageJ. Vérifiez les informations d'échelle et sélectionnez les mesures. Choisissez la zone et définissez les options de seuil. Calculez la surface de dégradation à l'aide de l'image de gélatine fluorescente, en corrigeant l'illumination inégale à travers la gélatine en soustrayant le seuil du fond, puis ajustez les valeurs d'intensité des pixels inférieures et supérieures de l'image.

Dans les images suivantes. Utilisez le bouton « définir » dans la fenêtre de seuil pour appliquer le même seuil à toutes les images, comme moyen objectif de sélectionner la zone de dégradation. Utilisez la fonction « analyser les particules » pour mesurer le seuil aux zones de dégradation de la matrice.

Choisissez une taille de particule supérieure à zéro pour éliminer le bruit dans la sélection. Affichez les contours afin d'identifier les régions d'intérêt. Ensuite, cochez « Afficher les résultats » et « Résumer » pour visualiser les mesures, si le dessin a délimité précisément toutes les zones de dégradation.

Copiez la mesure de la surface totale dans un tableur ; si d'autres objets ont été sélectionnés, tels que des débris, enregistrez uniquement les surfaces des régions d'intérêt pertinentes. Ensuite, pour calculer la surface cellulaire, ouvrez le fichier et appliquez le seuil de l'image colorée afin de définir les valeurs d'intensité des pixels supérieure et inférieure de manière à ce que les contours des cellules soient sélectionnés sur les images suivantes. Utilisez le bouton « définir » dans la fenêtre de seuil pour appliquer le même seuil à toutes les images.

Comme moyen objectif pour sélectionner la zone cellulaire. Utilisez la fonction d'analyse des particules pour mesurer le seuil de la surface des cellules. Choisissez une taille de particule supérieure à zéro afin d'éliminer le bruit de la sélection.

Afficher les contours pour identifier les régions à analyser, vérifier les résultats affichés et résumer pour afficher les mesures d'aire. Ne pas cocher. Inclure les trous s'il existe des espaces entre les cellules et un agrégat.

Choisissez maintenant. Copiez les résultats des zones pour les régions d’intérêt pertinentes dans un tableur et calculez la surface de dégradation de la gélatine par rapport à la surface totale des cellules. Une approche alternative consiste à normaliser la surface de dégradation au nombre de cellules, déterminé par le comptage des noyaux colorés au DAP e.

Ceci est important si les manipulations modifient la surface moyenne des cellules. Pour cette approche, utilisez le greffon de comptage des noyaux pour dénombrer automatiquement les noyaux. Ajustez les options afin d'optimiser le traitement pour vos images. Si les noyaux se chevauchent largement, le comptage automatique peut ne pas fournir une énumération précise dans ce cas.

Le comptage manuel peut être facilité à l'aide du module complémentaire de comptage cellulaire lorsqu'il est correctement effectué. Les lamelles sont uniformément recouvertes de gélatine conjuguée à l'Oregon Green 488. Plusieurs artefacts peuvent survenir lors du revêtement et du traitement des lamelles recouvertes de gélatine.

Par exemple, un revêtement irrégulier résulte d'une couverture inadéquate de la lame lors du processus de revêtement, due à un mélange insuffisant, à une répartition manuelle ou à une solidification partielle du mélange de gélatine. Les rayures indiquent le retrait de la matrice revêtue par grattage avec des aiguilles ou des pinces pendant la manipulation. Le dessèchement de la surface de la lame pendant de longues périodes de stockage peut entraîner un aspect en pavé. Cette zone reflète le blanchiment photo de la surface fluorescente de la gélatine pendant l'acquisition d'images, dû à une exposition prolongée ou intense à la lumière.

Remarquez comment une lamelle bien préparée affiche une fluorescence homogène lorsqu'elle est visualisée par microscopie. Les matrices minces obtenues au cours de cette procédure fournissent un moyen sensible d'évaluer la capacité des cellules à dégrader la MEC. Par exemple.

Ces images illustrent l'activité de dégradation de la matrice du podium envahie par une cellule cancéreuse de la tête et du cou OSC 19. Ici, les cellules ont été cultivées sur un coverslip de gélatine conjuguée à Oregon Green 4 88 et observées en microscopie fluorescente, comme le montrent les images en 2D et en 3D. Ces cellules OSC 19 cultivées sur des coverslips de gélatine conjuguée à Oregon Green 4 88 ont été marquées avec de la phalloïdine conjuguée à R domine et des anticorps anti-cort-actine, visualisés à l’aide d’un anticorps secondaire ANOR 6 47, et colorées artificiellement en vert pour représenter l’invasion.

Les podia sont visibles dans l'image fusionnée sous forme de concentrations cytoplasmiques ponctuelles d'actine F et de cortanine qui se superposent aux zones de dégradation du gélatine dans le volume rempli. La visualisation montre comment les podia envahissants pénètrent dans le sous-volume d'ECMA, créé pour révéler un bord à l'intérieur de la cellule où sont présents les podia invasifs. La vue en coupe dorsale montre les podia invasifs insérés dans le gélatine sous-jacent.

La vue en coupe du bord ventral montre des protrusions des podia de Veda et des zones de dégradation de la gélatine sous la lamelle comme des régions rouges apparaissant sur la matrice verte. Ces images illustrent certaines des étapes importantes pour la quantification de la dégradation normalisée de la matrice de gélatine par les cellules sur l'ensemble d'une image microscopique. Toutes les images de fluorescence ont été converties en niveaux de gris afin de mieux afficher le seuillage rouge et les marquages des régions d'intérêt.

Cette image de gélatine conjuguée à Oregon Green 488 montre les zones sombres où une dégradation s'est produite. Le seuillage de l'image de gélatine met en évidence les zones de dégradation, à partir desquelles des régions d'intérêt sélectionnées sont mesurées pour déterminer la surface de dégradation. Cette image montre une rumine, un foid et une coloration de l'actine F comme attendu.

Le seuil appliqué à l'image de l'actine met en évidence la surface totale de la cellule à partir de laquelle sont sélectionnées les surfaces cellulaires à mesurer. De même, cette technique peut être appliquée à l'étude d'images de noyaux cellulaires colorés au DAPI. Ce panneau illustre certaines étapes clés de la quantification de la dégradation fluorescente de la gélatine par des cellules individuelles au sein d'une population cellulaire mixte.

Cette quantification simple concerne une seule cellule OSC 19 transfectée surexprimant la cortactine recombinante fusionnée à une étiquette d'épitope flag. Remarquez comment la dégradation de la matrice par les cellules transfectées peut également être analysée au sein d'une population mixte de cellules transfectées et non transfectées. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder plusieurs éléments à l'esprit.

Tout d'abord, assurez-vous que vos marqueurs fluorescents cellulaires ne se chevauchent pas avec la couleur de la gélatine fluorescente. Lors de la collecte d'images, il est important de choisir des champs en fonction de la présence de cellules. N'allez pas préférentiellement chercher des zones de dégradation, car cela pourrait biaiser les données en raison de la variabilité entre les lignées cellulaires et leurs réponses à divers agents thérapeutiques.

Des facteurs tels que le temps de dégradation du nombre de sièges et le choix des protéines pour le marquage immunofluorescent doivent être optimisés pour votre expérience particulière. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment produire des lamelles uniformément recouvertes de gélatine fluorescente à partir de tests d'hydrolyse médiée par les podia bêta, ainsi que les méthodes de quantification de la dégradation de la matrice.