Nanotopology d'adhésion cellulaire sur Microscopie à angle variable de fluorescence à réflexion interne totale (VA-TIRFM)

L’objectif global de cette procédure est de mesurer une topologie d’adhésion cellulaire sur un substrat avec une précision nanométrique. Pour ce faire, on cultive d’abord des cellules sur des lames de verre transparent et on les incube à l’aide d’un marqueur fluorescent. Ensuite, la position angulaire du miroir orientable du microscope est calibrée et la position est enregistrée dans le programme de positionnement du miroir.

L’étape suivante consiste à enregistrer les images de fluorescence lors de l’irradiation sous environ 10 angles différents. La dernière étape consiste à calculer les distances entre les substrats cellulaires avec une précision de quelques nanomètres. En fin de compte, les résultats de la topologie de l’adhésion cellulaire sur substrat sont utilisés pour montrer les différences d’adhésion entre diverses lignées cellulaires, par exemple, les cellules cancéreuses et les cellules moins malignes.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la microscopie confocale est que la résolution réelle est de l’ordre de quelques nanomètres seulement. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des membranes cellulaires. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que de petites vésicules ou des nanomatériaux.

La démonstration de l’expérience sera assurée par notre postdoctorante Petra, qui préparera les échantillons de cellules, et notre ingénieur, Michael Wagner, qui dirigera l’expérience pour préparer les cellules à l’angle variable et à la réflexion interne totale. La microscopie à fluorescence ensemence des cellules individuelles à une densité de 100 cellules par millimètre carré sur une lame de verre dans un milieu de culture complété par 10 % de veau fœtal, du sérum et des antibiotiques. Faites pousser des cellules pendant 72 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Ensuite, appliquez sur les cellules la membrane fluorescente, le marqueur six D, le décano deux, le diméthylamino naphtalène ou le lorane à une concentration de huit micromolaires en culture, incubez pendant 60 minutes avant la microscopie à fluorescence. Lavez les cellules avec une pipette PBS, appliquez la solution tampon sur la lame de l’objet pour retirer le fluide, puis essuyez la solution tampon à l’arrière de la lame de l’objet. Un microscope droit tel qu’un plan Zeiss Axio, équipé d’une caméra rétroéclairée et/ou exon E-M-C-C-D est utilisé pour un angle variable.

T-I-R-F-M remplace son condenseur par un dispositif d’éclairage sur mesure avec un prisme en verre cylindrique hémisphérique couplé optiquement à la glissière de l’objet. Le faisceau laser est incident à partir d’une fibre monomode assemblée, ce qui, après imagerie par le prisme de verre et d’autres composants optiques, aboutit à nouveau à un faisceau parallèle à la surface de l’échantillon. Veillez à ce que le vecteur champ électrique soit polarisé, perpendiculaire au plan des incidents.

Cette position est marquée sur le coupleur de sortie de la fibre. Utilisez un miroir réglable situé à l’intérieur du condenseur, qui est imagé dans le plan de l’échantillon et éclaire l’échantillon sous un angle variable d’incidents ou de rayons d’objet. Le miroir réglable peut être entraîné par un moteur pas à pas, qui est contrôlé par un logiciel.

Chaque position correspond à un angle d’incidents bien défini tel que déterminé par des mesures métriques effectuées. Pour calibrer la position angulaire du miroir réglable, utilisez un colorant fluorescent tel qu’un nucléotide de flavine millimolaire, dissous dans l’eau. Pour visualiser l’angle critique lors de la variation de l’angle d’incident, utilisez l’angle critique de 61,3 degrés pour une transition d’eau de verre comme valeur fixe, la position angulaire du miroir à laquelle l’angle d’incidents est égal à l’angle critique est stockée dans le programme de positionnement du miroir.

À l’aide du logiciel de l’appareil photo, réglez les paramètres de l’appareil photo E-M-C-C-D, y compris le gain de température, la durée d’enregistrement et la vitesse de décalage. Utilisez de l’huile d’immersion pour assurer le contact optique de l’échantillon. À l’aide d’un prisme en verre, choisissez une lentille d’objectif dont le grossissement est approprié pour les cellules et dont l’ouverture numérique est modérée.

Pour visualiser l’objet dans le microscope, utilisez un filtre passe-long ou passe-bande approprié pour la détection de fluorescence. Enregistrer des images de fluorescence d’échantillons identiques lors de la variation de l’angle d’éclairage. Les angles des incidents doivent être identiques ou supérieurs à l’angle critique.

Avec l’angle critique correspondant à 64,5 degrés pour une interface en verre de cellule, une plage angulaire de 66 degrés à 74 degrés avec des pas de 0,5 degré ou d’un degré est recommandée. Pour commencer l’analyse des données, utilisez le programme lab view pour lire les images enregistrées sous différents angles ainsi que les paramètres de la caméra, la longueur d’onde d’excitation et les indices de réfraction. Pour le verre, qui est de 1,52, et les cellules, qui est de 1,37, les paramètres sont importés pour une évaluation correcte des données.

Pour chaque ensemble de paramètres, la profondeur de pénétration et le facteur de transmission sont calculés automatiquement pour le succès de la procédure. Il est important que les images soient soigneusement enregistrées et sélectionnées pour l’analyse. Sélectionner les images utilisées pour l’évaluation des distances entre les substrats cellulaires selon l’équation.

Pour un marqueur à membrane, des images individuelles dans un éclairage homogène, comme le montre cet exemple, peuvent être exclues. Calculez les images de la topologie du substrat cellulaire et sélectionnez un code couleur approprié pour l’affichage lors de l’évaluation. Les profils de pixels individuels peuvent être affichés comme illustré dans cette figure.

Ces profils peuvent être utilisés comme indicateur de la qualité de l’ajustement. Enfin, conservez le protocole d’évaluation. Cette figure représente des images de réflexion interne totale de cellules de glioblastome U2 51 mg avec un gène suppresseur de tumeur TP 53 activé.

Lors de l’incubation avec luan enregistré à différents angles d’incidents, 66 degrés correspondant à une profondeur de pénétration du champ électromagnétique évanescent d’environ 140 nanomètres, 69 degrés, correspondant à une profondeur de pénétration de 75 nanomètres et 73 degrés correspondant à une profondeur de pénétration de 60 nanomètres avec pénétration décroissante. La fluorescence en profondeur diminue en intensité et provient de sites plus superficiels des cellules, tels que les contacts focaux sur leurs bords. Les distances entre les substrats cellulaires sont représentées dans le panneau D par un code couleur allant de zéro à 600 nanomètres, comme on le voit ici.

Les distances entre les substrats cellulaires varient considérablement d’une cellule à l’autre, entre quelques nanomètres seulement représentés par du blanc à du jaune et 250 à 300 nanomètres représentés par du rouge foncé. Cela indique que les contacts focaux et les plus grandes distances entre les substrats cellulaires sont à proximité. Une variation similaire des distances entre les substrats cellulaires est calculée pour les cellules de glioblastome U2 51 mg avec un gène suppresseur de tumeur activé P 10.

En revanche, les distances entre les substrats cellulaires sont plutôt constantes pour les cellules témoins U2 51 mg représentées par le jaune et les cellules de type sauvage représentées par l’orange au rouge après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la topologie des substrats cellulaires pour explorer les cellules tumorales et les changements morphologiques lors de la thérapie laser. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser des surfaces avec une résolution réelle de l’ordre du nanomètre à une faible exposition à la lumière, ce qui est bien tolérable pour les organismes vivants.