Nanotopology d'adhésion cellulaire sur Microscopie à angle variable de fluorescence à réflexion interne totale (VA-TIRFM)

L'objectif général de cette procédure est de mesurer la topologie de l'adhérence cellulaire sur un substrat avec une précision nanométrique. Cela est réalisé en cultivant d'abord des cellules sur des lames de verre transparentes, puis en les incubant avec un marqueur fluorescent. Ensuite, la position angulaire du miroir réglable du microscope est étalonnée et cette position est enregistrée dans le programme de positionnement du miroir.

L'étape suivante consiste à enregistrer les images de fluorescence après irradiation selon environ 10 angles différents. La dernière étape consiste à calculer les distances entre la cellule et le substrat avec une précision de quelques nanomètres. Enfin, les résultats concernant la topologie de l'adhésion cellulaire sur le substrat sont utilisés pour mettre en évidence les différences d'adhésion entre différentes lignées cellulaires, par exemple, les cellules cancéreuses et les cellules moins malignes.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la microscopie confocale est que la résolution réelle se situe dans une gamme de seulement quelques nanomètres. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les membranes cellulaires, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme de petites vésicules ou des nanomatériaux.

Notre post-doctorante Petra, qui préparera les échantillons cellulaires, et notre ingénieur Michael Wagner, qui réalisera l'expérience, vont démontrer l'expérimentation. Pour préparer les cellules en vue d'une microscopie de fluorescence par réflexion totale à angle variable, ensemencez individuellement les cellules à une densité de 100 cellules par millimètre carré sur une lame de verre dans un milieu de culture enrichi avec 10 % de sérum de veau fœtal et des antibiotiques. Incubez les cellules pendant 72 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Ensuite, appliquez aux cellules le marqueur membranaire fluorescent six D, décane deux, diméthylamino naphtalène ou lorane à une concentration de 8 µmol/L dans le milieu de culture, puis incubez pendant 60 minutes avant la microscopie de fluorescence. Lavez les cellules avec du PBS en pipetant la solution tampon sur la lame porte-objet pour éliminer le milieu, puis essuyez la solution tampon sur l'arrière de la lame porte-objet. Un microscope droit, tel qu'un Zeiss Axio plan, équipé d'une caméra E-M-C-C-D à éclairage rétrodiffusé et/ou à exon, est utilisé pour l'observation à angle variable.

La microscopie T-I-R-F-M remplace son condenseur par un dispositif d'illumination personnalisé comportant un prisme en verre hémicylindrique couplé optiquement à la lame porte-objet. Le faisceau laser arrive depuis une fibre monomode collimatée ; après avoir été dirigé par le prisme en verre et d'autres composants optiques, il forme à nouveau un faisceau parallèle à la surface de l'échantillon. Veillez à ce que le vecteur du champ électrique soit polarisé perpendiculairement au plan d'incidence.

Cette position est marquée sur le coupleur de sortie de la fibre. Utilisez un miroir ajustable situé à l'intérieur du condenseur, qui est projeté dans le plan de l'échantillon et éclaire l'échantillon sous un angle variable d'incidence ou de rayon objet. Le miroir ajustable peut être actionné par un moteur pas à pas, contrôlé par un logiciel.

Chaque position correspond à un angle d'incidence bien défini, déterminé par des mesures procédées de manière géométrique. Pour étalonner la position angulaire du miroir ajustable, utilisez un colorant fluorescent tel qu'un flavine nucléotide à une concentration d'un millimolaire, dissous dans l'eau. Pour visualiser l'angle critique lors de la variation de l'angle d'incidence, utilisez l'angle critique de 61,3 degrés pour une transition verre-eau comme valeur fixe ; la position angulaire du miroir pour laquelle l'angle d'incidence égale l'angle critique est enregistrée dans le programme de positionnement du miroir.

À l'aide du logiciel de la caméra, réglez les paramètres de la caméra E-M-C-C-D, notamment la température, le gain, le temps d'enregistrement et la vitesse de décalage. Utilisez de l'huile d'immersion pour assurer un contact optique adéquat avec l'échantillon. À l'aide d'un prisme en verre, sélectionnez un objectif de grossissement approprié pour les cellules et d'ouverture numérique modérée.

Pour visualiser l'objet au microscope, utilisez un filtre passe-long ou passe-bande approprié pour la détection de la fluorescence. Enregistrez des images de fluorescence d'échantillons identiques en faisant varier l'angle d'illumination. Les angles d'incidence doivent être égaux ou supérieurs à l'angle critique.

Étant donné que l'angle critique correspond à 64,5 degrés pour une interface verre-cellule, il est recommandé d'utiliser une plage angulaire de 66 à 74 degrés par pas de 0,5 degré ou d'un degré. Pour commencer l'analyse des données, utilisez le programme LabVIEW afin de lire les images enregistrées à différents angles ainsi que les paramètres de la caméra, la longueur d'onde d'excitation et les indices de réfraction. Pour le verre, dont l'indice est de 1,52, et les cellules, dont l'indice est de 1,37, les paramètres sont importés afin d'assurer une évaluation correcte des données.

Pour chaque ensemble de paramètres, la profondeur de pénétration et le facteur de transmission sont calculés automatiquement pour la réussite de la procédure. Il est important que les images soient soigneusement enregistrées et sélectionnées pour l'analyse. Sélectionnez les images utilisées pour l'évaluation des distances cellule-substrat selon l'équation.

Pour un marqueur membranaire, des images individuelles présentant une illumination homogène, comme celle illustrée dans cet exemple, peuvent être exclues. Calculez les images de la topologie du substrat cellulaire et sélectionnez un code de couleurs approprié pour l'affichage durant l'évaluation. Les profils de pixels individuels peuvent être affichés comme illustré sur cette figure.

Ces profils peuvent être utilisés comme indicateur de la qualité de l'ajustement. Enfin, enregistrez le protocole d'évaluation. Cette figure montre des images de réflexion totale interne de cellules de glioblastome U2 51 mg avec un gène suppresseur de tumeur TP 53 activé.

Après incubation avec la luane enregistrée à divers angles d'incidence, 66 degrés correspondent à une profondeur de pénétration du champ électromagnétique évanescent d'environ 140 nanomètres, 69 degrés, correspondant à une profondeur de pénétration de 75 nanomètres, et 73 degrés correspondant à une profondeur de pénétration de 60 nanomètres avec une pénétration décroissante. L'intensité de la fluorescence diminue avec la profondeur et provient de sites plus superficiels des cellules, tels que les contacts focaux situés sur leurs bords. Les distances cellule-substrat sont représentées dans le panneau D par un code couleur allant de zéro à 600 nanomètres, comme indiqué ici.

Les distances entre la cellule et le substrat varient considérablement d'une cellule à l'autre, allant de seulement quelques nanomètres, représentés en blanc à jaune, à 250 à 300 nanomètres, représentés en rouge foncé. Cela indique que les contacts focaux et les plus grandes distances entre la cellule et le substrat se trouvent à proximité immédiate. Une variation similaire des distances entre la cellule et le substrat est calculée pour les cellules de glioblastome U251MG avec un gène suppresseur de tumeur P10 activé.

En revanche, les distances entre les cellules et le substrat sont plutôt constantes pour les cellules témoins U2 51 mg, représentées en jaune, et les cellules de type sauvage, représentées en orange à rouge, après leur développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la topologie cellulaire-substrat pour explorer les cellules tumorales et les changements morphologiques induits par la thérapie au laser. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de visualiser des surfaces avec une résolution réelle dans la gamme du nanomètre, et ce avec une faible exposition à la lumière, bien tolérable pour les organismes vivants.