Les petits extraits nucléaires pour les dosages fonctionnels de l'expression génétique Machineries

L’objectif général de l’expérience suivante est d’analyser l’expression des gènes à l’aide de machines nucléaires fonctionnelles extraites de cellules. Ceci est réalisé en récoltant d’abord dans le gonflement des cellules hela. Ensuite, les cellules sont lacées par descente, puis centrifugées pour granuler les noyaux dans la troisième étape.

Les noyaux sont extraits au sel, concentrés et dialysés afin d’obtenir des machines d’expression génique solubles et fonctionnelles. En fin de compte, la fonctionnalité des extraits nucléaires peut être évaluée en fonction de leurs activités de transcription et d’épissage, telles qu’évaluées avec une ARN polymérase couplée à un système de transcription et d’épissage. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la préparation d’extraits de nuclées en vrac, est qu’avec cette technique, une petite quantité de cellules peut être utilisée pour préparer l’extrait de noyaux.

Commencez par placer les cellules hela sur trois plaques de 150 millimètres avec un milieu DMEM complété par du FBS et des antibiotiques, cultivez les cultures dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 jusqu’à ce que les cellules atteignent une fluidité de 90 % de Co à ce stade, aspirez le milieu des cultures de cellules HELOC et lavez-les une fois avec 13 millilitres à température ambiante. PBS par plaque puis aspirer. Le PBS place chaque plaque sur le côté pendant quelques secondes et aspire le reste du PBS.

Ensuite, utilisez un lève-cellule pour gratter les cellules jusqu’au bord inférieur de chaque plaque, puis tirez les cellules dans un tube einor de 1,5 millilitre. Enfin, granulez les cellules dans une micro-fuge pendant cinq minutes à cent fois G et à quatre degrés Celsius. Aspirez maintenant le PBS de la pastille cellulaire et estimez le volume de la cellule garnie ou PCV en regardant la gradation sur le tube.

Ajoutez ensuite deux fois le volume de tampon hypotonique que le PCV à la pastille cellulaire. Secouez doucement le tube pour le remettre en suspension. Les cellules pipetent doucement la suspension cellulaire de haut en bas avec une pipette de 1000 microlitres pour déloger les amas de cellules si nécessaire.

Ensuite, granulez les cellules dans les mêmes conditions de centrifugation qu’auparavant. Après la centrifugation, aspirez soigneusement la couche tampon hypotonique. Les cellules auront commencé à gonfler et le volume cellulaire aura augmenté à environ 750 à 1000 microlitres.

Ajoutez un nouveau tampon hypotonique à un volume final de 1,5 millilitre et remettez les cellules en suspension dans le tampon. Encore. Enfin, incubez les cellules gonflées remises en suspension sur de la glace pendant 10 minutes pendant que les cellules refroidissent. Rincez un homogénéisateur de duvet avec un tampon hypotonique, puis placez-le sur de la glace avec les cellules.

Ensuite, à l’aide d’un essuie-glace délicat tel qu’une lingette Kim, séchez le pilon. Utilisez une pointe de micro-pipette allongée de 1000 microlitres pour retirer le tampon des duvets. Utilisez maintenant la pipette pour transférer les cellules gonflées réfrigérées dans le duvet duvet.

C’est la partie la plus délicate de cette procédure pour une entrée réussie Vérifiez la lyse. Après chaque descente au microscope, déplacez lentement le pilon serré des duvet de haut en bas cinq fois pour époux les cellules en prenant soin d’éviter les bulles. Ensuite, transférez un Eloqua de cinq microlitres de suspension de cellules lys dans un tube einor et ajoutez 10 microlitres de bleu trian et 15 microlitres d’un XPBS.

Ajoutez la solution cellulaire à une lame et examinez les cellules au microscope optique pour la lyse, les noyaux des cellules lys apparaîtront bleus après trois onces. Il n’y a pas assez de lyse car de nombreuses cellules vivantes sont visibles. Après cinq onces, il y a suffisamment de lyse.

Enfin, transférez les cellules lys dans le tube einor pré-refroidi et faites tourner la suspension cellulaire pendant cinq minutes dans une micro-fuge à 1500 fois G et quatre degrés Celsius. Transférez ensuite soigneusement le super natin dans un nouveau tube sans perturber la pastille. Maintenant, estimez le volume nucléaire du patch ou PNV en regardant la gradation sur le tube.

Remplissez une pointe de micro-pipette avec un tampon à faible teneur en sel à la moitié de la PNV. Insérez ensuite la pointe de la micro-pipette dans les noyaux au fond du tube einor. Injecter lentement le tampon dans les noyaux tout en mélangeant doucement.

Agitez doucement le tube pour vous assurer que la pastille est complètement remise en suspension. Ensuite, ajoutez un tampon à haute teneur en sel à la moitié du PNV et mélangez rapidement une fois en inversant le tube. Faites pivoter le tube pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

Enfin, faites tourner les noyaux dans la micro-fugue pendant 15 minutes à 18 000 fois G et quatre degrés Celsius. Commencez par transférer 500 microlitres de surnageant dans des micro-compresses réfrigérés. Faites tourner l’extrait nucléaire à haute teneur en sel pendant 15 minutes à 14 000 fois G et quatre degrés Celsius après la centrifugation, retournez le mini racon et placez-le dans un nouveau tube EOR individuel.

Après avoir tourné pendant deux minutes à 1000 fois G et quatre degrés Celsius, l’extrait nucléaire à haute teneur en sel sera concentré à environ 115 microlitres. Transférez maintenant 45 aliquotes de 45 microlitres d’extrait nucléaire à haute teneur en sel dans des mini-SLI de dialyse. Assurez-vous que le bas de la glissière est avec le bas du flotteur.

Placez ensuite les SLI dans 500 millilitres de tampon de dialyse réfrigéré. Enfin, remuez les aliquotes pendant une à deux heures à quatre degrés Celsius, l’extrait nucléaire apparaîtra trouble après dialyse. Cette figure montre des données représentatives comparant une réaction couplée d’ARN polymérase à deux transcription et de tranchage dans un extrait nucléaire à petite échelle par rapport à un extrait nucléaire en vrac.

Lorsque la construction A-C-M-V-D-N-A a été incubée dans les extraits en vrac ou à petite échelle, des niveaux similaires de pré-ARNm naissants ont été synthétisés au point temporel de cinq minutes suivant l’ajout d’alpha et de manine pour bloquer la transcription ultérieure, les intermédiaires d’épissage et les produits d’épissage se sont accumulés au fil du temps avec une cinétique similaire dans les deux types d’extraits. Ces résultats représentatifs confirment que les efficacités du système couplé de transcription et d’épissage de l’ARN polymérase deux sont similaires dans les extraits nucléaires en vrac et à petite échelle. Pour démontrer l’utilité de l’extrait à petite échelle, des extraits de méthode ont été préparés à partir de cellules hela traitées avec l’inhibiteur d’épissage E 7 1 0 7 ou le composé témoin négatif Platy analy F, puis un test de transcription et d’épissage couplé à ARN polymérase deux a été effectué comme le montre cette figure. Cellules.

En revanche, l’épissage s’est produit normalement dans l’extrait préparé à partir des cellules traitées analytiquement F, mais a été aboli dans les cellules traitées E 7 1 0 7. Ces données fournissent une preuve de concept pour l’utilisation des extraits nucléaires à petite échelle pour le traitement spécial des cellules à petite échelle. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de cinq heures.