Name: Génétique inverse de récupération des norovirus murin médiation infectieuses (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Découvrez deux stratégies de génétique inverse pour récupérer le norovirus murin infectieux (MNV) en culture cellulaire. Ces méthodes permettent d'étudier la réplication et la pathogenèse des norovirus.

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Cette recherche a été financée par une bourse du Wellcome Trust principal décerné à Ian Goodfellow, et une Marie Curie intra European Fellowship (7e PC European Research Council) a décerné à Armando Arias. Nous tenons à remercier Io Hong Cheong, le Dr Rebecca Robey et le Dr Mike Skinner de nous donner la permission d&#39;utiliser leur Bioanalyser Agilent et en aidant à l&#39;exécution des exemples d&#39;ARN.

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<li>McFadden, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+Regulation+of+the+Innate+Immune+Response+and+Apoptosis+Occurs+via+the+Product+of+the+Alternative+Open+Reading+Frame+4%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4.</a> PLoS Pathog. 7, e1002413(2011).</li>
<li>Kormelink, R., van Poelwijk, F., Peters, D., Goldbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+heterogeneous+sequences+at+the+5%27+ends+of+tomato+spotted+wilt+virus+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Non-viral heterogeneous sequences at the 5' ends of tomato spotted wilt virus mRNAs.</a> J. Gen. Virol. 73, 2125-2128 (1992).</li>
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<li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4%5BTitle%5D)+AND+%22E.+EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4.</a> E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).</li>
<li>Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+linked+to+the+genomic+and+subgenomic+mRNAs+of+feline+calicivirus+and+its+role+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation.</a> J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).</li>
<li>Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+genetically+defined+murine+norovirus+in+tissue+culture+by+using+a+fowlpox+virus+expressing+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase.</a> J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).</li>
<li>Ward, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+infectious+murine+norovirus+using+pol+II-driven+expression+of+full-length+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).</li>
<li>Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+optimized+RNA-based+murine+norovirus+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system.</a> J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).</li>
<li>Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+mutants+of+VPg+reveal+new+cytopathology+determinants+in+a+picornavirus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus.</a> PLoS One. 5, e10735(2010).</li>
<li>Werf, S. vander, Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+infectious+poliovirus+RNA+by+purified+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).</li>
<li>Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+substitution+in+the+murine+norovirus+capsid+protein+is+sufficient+for+attenuation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo.</a> J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).</li>
<li>Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+RNA+structures+present+at+the+3%27+extremity+of+the+murine+norovirus+genome%3A+the+variable+polypyrimidine+tract+plays+a+role+in+viral+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence.</a> J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Ici, nous avons illustré deux différentes approches génétiques inverse qui permettent la récupération de MNV infectieuses en culture cellulaire. Les deux approches de manière efficace de contourner l&#39;exigence absolue pour la liaison covalente de VPg à l&#39;extrémité 5 &#39;du génome ARN viral via la génération de transcrits MNV plafonnés, qui sont ensuite reconnus par les ribosomes cellulaires. La transcription in vitro suivie par voie enzymatique de coiffage est plus efficace dans la récupération des NVM infectieuse de la transcription de plasmides infectieuses dans des cellules exprimant l&#39;ARN polymérase T7, dans lequel les transcrits peut être coiffé par les enzymes FPV coiffage. Titres de virus récupérés avec ces systèmes de génétique inverse sont semblables à celles obtenues par transfection de VPg virales liées ARN purifiés à partir de cultures de cellules infectées 17 ans (figure 5). La transfection de l&#39;assiette MNV ARN dans les cellules permissives RAW264.7 rend un titre seul virus de 1 log inférieur expériences impliquant l&#39;transfection de l&#39;ARN total à partir de cellules infectées par le virus contenant des VPg liée ARN (Figure 5). Ce fait encourage de nouvelles investigations pour déterminer si l&#39;ajout d&#39;une molécule VPg à l&#39;extrémité 5 &#39;des transcrits générés par ces systèmes pourrait entraîner des rendements de virus a augmenté ce qui peut révéler des aspects fonctionnels qui sous-tendent l&#39;infectiosité MNV dans les cellules associées à VPg. Néanmoins, nous considérons que ce système de génétique inverse comme un très efficace comparable à d&#39;autres virus à ARN inverser systèmes de génétique actuellement utilisé dans laquelle le transcrit in vitro d&#39;ARN permet la récupération de titres seulement 10-100 inférieurs à ceux des infections réelles avec des virions 19, 20. Dans l&#39;ensemble, les méthodologies actuelles constituent une avancée significative dans le domaine de la biologie moléculaire et norovirus nous fournir les outils nécessaires pour enquêter sur les rôles fonctionnels des protéines et des motifs conservés dans les génomes ARN norovirus. Ces approches ont déjà été combiné avec cmodèle de souris ACTUEL disponibles et ont montré que MNV récupéré à partir d&#39;ADNc infectieux est en mesure de provoquer une infection mortelle de&gt; 80% STAT1-/ - souris en moins de 10 jours 4, 21. Faisant usage de ce système, nous avons récupéré viables mutants norovirus murin de la protéine de capside et d&#39;un tube polypyrimidine impliqué dans la liaison des facteurs de l&#39;hôte différents (PTB et PCBP) qui affichent un peu atténués phénotypes in vivo 21, 22. En outre, nous avons récemment démontré que les virus qui n&#39;ont pas la capacité d&#39;exprimer la protéine VF1 de ORF4 efficacement répliquer en culture cellulaire, mais encore une fois ont réduit la virulence chez la souris par rapport à WT MNV 8. Ces études nous incitent à concevoir des versions atténuées de norovirus humains fondées sur des études MNV qui pourraient être étudiés en tant que candidats vaccins potentiels.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Solution de précipitation au chlorure de lithium </td><td> Ambion </td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> Solution de stockage d&#39;ARN </td><td> Ambion </td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 de script </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap M7G Plafonnement du système </td><td> Biotechnologies Epicentre </td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td> Système de transfection néon </td><td> Invitrogen </td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td> Neon kit système de transfection </td><td> Invitrogen </td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM I </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td></tr><tr><td> Réactif de transfection Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td> Agilent ARN 600 Nano kit </td><td> Agilent </td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 bioanalyzer </td><td> Agilent </td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Illustra GFX PCR de l&#39;ADN et Kit Gel purification Band </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX production à grande échelle du système ARN-T7 </td><td> Promega </td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

génétique inverse de récupération des norovirus murin médiation infectieuses

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Norovirus humains sont responsables de la plupart des cas de gastro-entérite humaine (GE) dans le monde entier et sont des problèmes récurrents dans des environnements où près de personne à personne de contact ne peuvent pas être évitées 1, 2. Au cours des dernières années une augmentation de l&#39;incidence des épidémies dans les hôpitaux a été signalée, ce qui provoque d&#39;importantes perturbations de leur capacité opérationnelle ainsi que d&#39;importantes pertes économiques. L&#39;identification de nouvelles approches antivirales a été limitée en raison de l&#39;incapacité des norovirus humains pour compléter une infection productive dans 3 culture cellulaire. L&#39;isolement récent d&#39;un norovirus murin (MNV), étroitement liée à norovirus humain 4, mais qui peut se propager dans les cellules 5 a ouvert de nouvelles voies pour l&#39;enquête de ces agents pathogènes 6, 7. Les résultats de réplication MNV dans la synthèse de génomique nouveau sens positif et des molécules d&#39;ARN sous-génomique, celui-ci correspond à la dernière thie du génome viral (figure 1). MNV contient quatre différents cadres de lecture ouverts (ORF), dont ORF1 occupe la majeure partie du génome et code sept protéines non structurales (NS1-7) libérés à partir d&#39;un précurseur de polyprotéine. ORF2 et ORF3 sont contenus dans la région sub-génomique de l&#39;ARN et coder les protéines de capside (VP1 et VP2, respectivement) (figure 1). Récemment, nous avons déterminé que l&#39;ORF4 supplémentaires chevauchement ORF2, mais dans un cadre de lecture différent est fonctionnel et code pour un facteur de virulence localisée mitochondrial (VF1) 8. La réplication des virus à ARN positif pour le sens, y compris les norovirus, se déroule dans le cytoplasme aboutissant à la synthèse de nouveaux génomes ARN non plafonnés. Pour promouvoir la traduction virale, les virus profitent de différentes stratégies visant à recruter la machinerie de synthèse protéique cellulaire 9-11. Fait intéressant, la traduction norovirus est entraîné par le multifonctionnel protéine virale VPg-primaireliée de manière covalente à l&#39;extrémité 5 &#39;de deux ARN génomique et subgénomique 12-14. Ce mécanisme sophistiqué de la traduction est susceptible d&#39;être un facteur majeur dans l&#39;efficacité limitée de la reprise virale par les approches conventionnelles de génétique inverse. Nous rapportons ici deux stratégies différentes basées sur la génération de souris norovirus-1 (dénommé ci-joint MNV) transcriptions plafonnées à l&#39;extrémité 5 &#39;. Une des méthodes consiste à la fois la synthèse in vitro et le plafonnement de l&#39;ARN viral, tandis que la seconde approche implique la transcription de MNV ADNc dans des cellules exprimant la T7 RNA polymérase. La disponibilité de ces systèmes de génétique inverse pour l&#39;étude de MNV et un petit modèle animal a fourni une capacité sans précédent à disséquer le rôle de séquences virales dans la réplication et la pathogenèse 15-17.

Les norovirus sont une cause majeure de gastro-entérite encore des techniques moléculaires pour leur caractérisation sont encore relativement nouvelle. Nous rapportons ici deux différentes approches de génétique inverse pour la récupération efficace des norovirus murin (MNV), le seul membre de ce genre qui peuvent être propagées en culture cellulaire.

Génétique inverse de récupération des norovirus murin médiation infectieuses

Les norovirus humains sont responsables de la majorité des cas de gastroentérite (GE) humaine à travers le monde et représentent un problème récurrent dans les environnements où la proximité...

L'objectif général de cette procédure est de récupérer un muœovirus neuro-infectieux en utilisant deux systèmes génétiques inverses. Bonjour, je suis Armando Arias du service de virologie de l'Imperial College de Londres. Dans notre équipe, nous nous intéressons à l'analyse des mécanismes moléculaires sous-jacents à la réplication des neurovirus.Les norovirus sont une cause majeure de gastro-entérite. Dans le monde entier, les techniques moléculaires avancées pour leur caractérisation sont encore relativement récentes. L'identification de nouvelles approches antivirales et la compréhension du cycle de vie du norovirus ont été limitées par leur incapacité à réaliser une infection productive en culture cellulaire.L'isolement récent d'un antiviral capable d'infester des souris et de se propager en culture cellulaire, à savoir le miroir neurovirus, a ouvert de nouvelles voies pour l'étude de ces pathogènes importants. Dans ce rapport, nous démontrerons deux stratégies permettant la génération d'isolats de neurovirus génétiquement définis en culture cellulaire. Les deux stratégies reposent sur la génération de transcrits viraux coiffés à l'extrémité cinq prime.La première consiste en la synthèse *in vitro* de l'emboutissage de l'ARN viral avant la transfection dans des cellules. La deuxième approche implique la transcription du virus MI neuro, de l'ADNc à l'intérieur de cellules exprimant la polymérase ARN T7. Aperçu de la procédure. Le protocole de récupération du norovirus neuro à partir de transcrits d'ARN coiffés débute par une linéarisation.Le plasmide contenant le CD NA de MV pour mmv un. Cette étape est réalisée à l'aide de l'enzyme de restriction NHE un. L'ADN est ensuite transcrit in vitro en ARN en utilisant la polymérase ARN T sept.Par la suite, l'ARN-MMV est coiffé in vitro et transféré dans des cellules afin de permettre la récupération d'un MNV infectieux. Pour la récupération directe d'un MNV infectieux à l'aide du virus FAL PX exprimant la polymérase ARN T7 pour la récupération de l'MMV à partir de clones d'ADNc directement transfectés, les cellules sont d'abord infectées par un virus FAL PX recombinant exprimant la polymérase ARN T7. L'infection par le FAL PX entraîne l'expression de la polymérase ARN T7 ainsi que des enzymes de coiffage de l'ARN viral, qui peuvent coiffer une partie de l'ARN synthétisé. L'ADNc-MMV est ensuite transfecté dans les cellules infectées par le FAL PX par transfection médiée par des lipides. La polymérase ARN T7 produit alors l'ARN-MMV, dont une partie peut être coiffée par le système de coiffage de l'ARN du FAL PX.Une séquence ribozyme garantit que chaque transcrit d'ARN contient une extrémité trois prime définie. Les transcrits de MMV coiffés seront ensuite traduits en protéines avant la réplication, conduisant à la production de nouvelles particules infectieuses. Protocole de transcription et de coiffage de l'ARN pour la récupération de transcrits de MMV coiffés et infectieux.Tout d'abord, mélangez les réactifs suivants : tampon de transcription, nucléotides, eau et plasmide linéarisé contenant l'ADN M-M-V-C-D-N-A. Ajoutez ensuite l'ARN et la polymérase ARN T7 au mélange réactionnel. De nombreux kits commerciaux sont disponibles à cet effet et offrent une méthode reproductible de synthèse de l'ARN.La réaction de transcription est réalisée en incubant le mélange à 37 degrés Celsius pendant au moins deux heures. Analyser un petit aliquot de cette réaction de transcription sur un gel d'agarose non dénaturant. Tout d'abord, nettoyer l'équipement pour gel avec du détergent et rincer à l'eau exempte de RNAses avant utilisation.Veillez à ce que les gels d'agarose soient préparés à l'aide de réactifs exempts de RNases. L'ARN-M-V-R-N-A migrera à environ trois paires de bases sur un gel d'agarose non dénaturant. En outre, un bioanalyseur Agilent peut être utilisé pour fournir une méthode rapide d'analyse de l'intégrité de l'ARN.L'ARN doit ensuite être purifié pour éliminer les nucléotides non incorporés. De nombreuses méthodes sont disponibles ; toutefois, dans ce protocole, nous purifions l'ARN par précipitation au chlorure de lithium, une alternative économique qui forme un culot d'ARN par centrifugation à vitesse maximale pendant 15 minutes. Retirer le surnageant en prenant soin de ne pas perturber le culot translucide, puis rincer avec de l'éthanol à 70 %.Resuspendre le transcrit MMV dans une solution de stockage d'ARN et s'assurer qu'il est complètement dissous. Chauffer l'ARN à 65 degrés C peut faciliter ce processus ultérieurement. Quantifier l'ARN par spectrométrie.Analysez l'intégrité de l'ARN en faisant migrer une petite aliquote sur un gel d'agarose non dénaturant à 1 %. Comme vous pouvez le constater, l'intégrité de l'ARN après précipitation par chlorure de lithium doit rester identique afin d'améliorer l'efficacité de la coiffure. Chauffez une aliquote d'ARN à 65 degrés pendant 10 minutes.Placer immédiatement le tube sur de la glace. Pour éviter la dégradation ou le repliement, préparer un mélange de réaction d'ajout de coiffe selon les recommandations du fabricant. Nous ajoutons généralement environ 60 microgrammes de M-N-V-R-N-A à une réaction finale de 100 microlitres.Bien que la réaction puisse être réduite, mélanger soigneusement et incuber à 37 degrés pendant une heure, puis purifier l'ARN par précipitation au chlorure de lithium comme précédemment. Il est essentiel de vérifier à nouveau l'intégrité de l'ARN avant de procéder à la transfection. Protocole étape par étape pour la récupération de MMV par électroporation d'ARN dans des cellules brutes. Resus.Suspendez les cellules brutes dans du DMEM. Veillez à obtenir une suspension monocellulaire. Déterminez la concentration de cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre en utilisant l’exclusion au bleu de trypan. Centrifuger les cellules et les resuspendre soigneusement dans des aliquotes de milieu frais sans antibiotique, à raison de 8 millions de cellules par transfection, puis les centrifuger dans une microcentrifugeuse. Éliminer le milieu et laver les cellules dans 500 microlitres de PBS, centrifuger à nouveau, éliminer le PBS, puis resuspendre les cellules dans 130 microlitres à température ambiante.Solution de suspension Neon pour la reprise. Ajoutez la quantité appropriée d'ARN coiffé, généralement 1,3 microgramme par 130 microlitres de cellules, ce qui équivaut à un microgramme d'ARN par 6 millions de cellules. Les cellules mélangées aux transcrits sont recueillies dans la pointe de transfection Neon de 100 microlitres.Il convient d'apporter le plus grand soin pour ne pas introduire de bulles à ce stade. Ensuite, effectuez une électroporation en appliquant une impulsion unique de 1700 volts pendant 25 millisecondes. Relâchez les cellules dans un tube Eppendorf contenant un millilitre de milieu sans antibiotique.Répartir les cellules du tube dans des puits indépendants contenant du DMEM sans antibiotique avec 10 % de FCS, puis incuber les cellules à 37 degrés pendant 24 à 72 heures. La récupération du MMV par transfection lipidique d'ARN dans des cellules BSR T7 s'effectue comme précédemment. Les transcrits MMV sont générés par linéarisation du plasmide MMV CDNA, transcription in vitro par la polymérase T7 et capage in vitro. Les transcrits sont ensuite transférés par voie lipidique dans des cellules BSR T7. Traiter au trypsine une monocouche de cellules BSR T7 et ensemencer 7,5 × 10⁵ cellules viables dans des boîtes de plaque de 6 puits.Incuber les cellules à 37 degrés pendant toute la nuit. Retirer le milieu des cellules et le remplacer par trois millilitres de milieu frais sans antibiotiques. Pour assurer une efficacité maximale de la transfection, mélanger un à deux microgrammes d'ARNm M-M-V-R-N-A coiffé avec 100 microlitres d'OptiMEM.On mélange également quatre microlitres de lipectomy 2000 avec 100 microlitres d'optimum. Combiner les échantillons contenant l'ARN et le lipectomy et mélanger soigneusement en aspirant et en expulsant 15 fois à l’aide d’une pipette. Laisser le mélange à température ambiante pendant 20 minutes.Ensuite, ajoutez les complexes de transfection contenant les ARNm MMV coiffés de manière goutte à goutte sur la monocouche cellulaire. Agitez la plaque dans des directions perpendiculaires. Incubez les cellules pendant 24 à 72 heures.Protocole de récupération directe de MMV infectieux à partir d'ADNc dans des cellules exprimant la polymérase ARN T7, tel que décrit précédemment. Ce protocole repose sur l'expression de la polymérase ARN T7 et des enzymes de coiffage virales oxx dans des cellules infectées par un virus auxiliaire oxx. L'ADNc de M-N-V-C-D-N-A, sous contrôle d'un promoteur T7, est ensuite transfecté dans les cellules.Tout d'abord, retirez le milieu de culture cellulaire et ajoutez dans chaque puits 700 microlitres de virus F pox dilué dans un milieu sans antibiotique. On utilise généralement une multiplicité d'infection d'environ 0,5 PFU par cellule, agitez délicatement les plaques perpendiculairement et incubez une heure à 37 degrés. Ensuite, ajoutez deux milles de milieu sans antibiotique et incubez les cellules une heure supplémentaire à 37 degrés pour permettre l'expression de la polymérase ARN T7. Après transfection MNV CG NNA, retirez le milieu des cellules infectées et ajoutez trois milles de milieu frais sans antibiotique.Préparez un mélange d'un microgramme d'ADN-M-M-V-C et de lipectamine comme expliqué dans la section précédente. Mélangez soigneusement en faisant des mouvements de bas en haut. Incubez le tube à température ambiante pendant 20 minutes, puis mélangez à nouveau et ajoutez goutte à goutte le mélange sur la monocouche cellulaire.Agiter doucement la plaque dans des directions perpendiculaires. Incuber les cellules à 37 degrés pendant 24 à 72 heures afin de confirmer la récupération du MMV infectieux par les différentes approches de génétique inverse présentées au cours de cette vidéo. Libérer la variante infectieuse des cellules par des cycles répétés de congélation-décongélation. Déterminer la quantité dans chaque échantillon selon des procédures classiques telles que le TCID50 ou un dosage par plaques, résultats représentatifs.La disponibilité de ces systèmes de génétique inverse pour étudier le mi Neurovirus a offert une capacité sans précédent d'analyser le rôle des séquences virales dans la réplication du neurovirus et sa pathogenèse chez l'hôte naturel. Les deux approches de génétique inverse décrites dans cette vidéo sont très efficaces pour la récupération de neuro et de neurovirus infectieux en culture cellulaire. Comme illustré sur cette figure.Des titres infectieux de MMV, dépassant 10 à la puissance cinq TCID 50 par mL, sont récupérés après la transfection de transcrits de MMV coiffés dans des cellules RAW ou des cellules BSRT7. La transfection de MMV-ADN dans des cellules BSRT7 préalablement infectées à l’aide du virus helper FLP conduit à des titres viraux supérieurs à 10 à la puissance quatre TCID 50 par mL. Les titres viraux obtenus par des approches de génétique inverse sont comparables à ceux récupérés après transfection avec de l’ARN isolé de virus infectieux, soulignant ainsi l’efficacité élevée des systèmes de génétique inverse décrits ici.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

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