Name: La transfection danticorps dans les neurones comme outil pour étudier la pathogenèse des maladies (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Découvrez la transfection d'anticorps fluorescents dans les neurones pour étudier la pathogenèse des maladies neurologiques. Cette méthode permet de visualiser les effets des autoanticorps sur la fonction neuronale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail est soutenu par le Bureau de la recherche et du développement, de la recherche médicale Service, Department of Veterans Affairs. Cette étude a été financée par une bourse de l&#39;examen du mérite VA (à MCL) et à l&#39;Université du Tennessee Health Science Center de la sclérose multiple Fonds de recherche.

1. Marquage de l&#39;anticorps (figure 1) <ol><li> Assurez 0,1 M de tampon NaHCO 3: <ul type="circle"><li> 8,4 g de NaHCO 3 </li><li> 29,2 g de NaCl </li><li> 1 litre H 2 O </li></ul></li><li> Amener le tampon à un pH de 8,4 avec cette solution (10,6 g Na 2 CO 3, 29,2 g de NaCl, 1 litre H 2 0). </li><li> Ajouter 35 ul Atto550 NHS à 70 ul anti-hnRNPA1 et 500 pi de tampon NaHCO 3 et tourner pendant 1 heure à température ambiante. Après la rotation d&#39;une heure, l&#39;injection du mélange dans un appareil de dialyse et dialyse dans 2 litres de PBS pendant une nuit. </li><li> Le lendemain, concentrer les Atto550 dialysés NHS anti-hnRNPA1 l&#39;aide d&#39;une colonne de centrifugation (Amicon Ultra 0,5). </li><li> Après NHS Atto550 les anticorps anti-anticorps hnRNPA1 a été concentré, nano-goutte d&#39;échantillon pour déterminer la concentration. </li></ol> 2. La transfection d&#39;anticorps (figure 2) <ol><li> Seed 10 5 cellules / puits dans 500 ul de Dulbecco Eagle modifié Moyen (DMEM/F12 +10% SVF + 1% d&#39;antibiotiques) dans un 8 diapositive 24 h et avant la transfection. Confluence cellulaire doit être d&#39;au moins 70%. </li><li> Vingt-quatre heures après l&#39;ensemencement, ajouter 2 pi de Ab-DeliverIN réactif dans un tube Eppendorf. </li><li> Ensuite, ajoutez 2 pg de Atto550 NHS des anticorps anti-anticorps hnRNPA1 (0,5 pg / pl) dans le même tube Eppendorf et incuber 10-15 min à température ambiante. </li><li> Pendant l&#39;incubation, aspirer les médias et ajouter 394 ul de DMEM frais de support pour les cellules. </li></ol> Remarque: Ajouter 500 ul de DMEM à une chambre de cellules intactes pour agir à titre de témoin. <ol start="5"><li> Après incubation, ajouter 100 ul de DMEM le mélange d&#39;anticorps, mélanger par pipetage de haut en bas, et d&#39;ajouter aux cellules dans du DMEM pour un volume total de 500 ul. </li><li> Changer les médias après 48 heures de la livraison d&#39;anticorps. </li></ol> Remarque: le protocole a été répété avec marqué au FITC Rigg comme témoin positif. 3. Imagerie en direct et fixes pour déterminer l&#39;efficacité <ol><li> Cellules d&#39;image en direct à 48 h à l&#39;aide des Cy3 filtre sur un microscope à fluorescence à l&#39;image des Atto550 transfectées NHS anticorps marqués. </li><li> Après imagerie en temps réel a été achevée, aspirer les médias et les cellules fixes. </li><li> Après médias aspiration, traiter les cellules avec du paraformaldéhyde 0,4% pendant 15 min à température ambiante. Laver les cellules 4 x 5 min à chaque fois avec du PBS. Ensuite, montez les cellules avec un milieu de montage contenant réactif DAPI et lamelle fixe. Mesurer l&#39;efficacité de transfection des cellules fixes avec AxioVision logiciel. Si AxioVision logiciel n&#39;est pas à portée de main, il suffit de compter les événements de votre image en main les résultats et le brancher sur le calcul en 3.7. Sinon, le logiciel ImageJ peut être utilisée pour ces calculs. </li><li> Tout d&#39;abord, utiliser le &quot;Evénements&quot; de mesure de compter le nombre total de cellules dans votre image de son choix à un grossissement de 20x. </li><li> Ensuite, utilisez la &quot;Evénements&quot; de mesure de compter les cellules qui ne sont pastransfecté avec succès avec des anticorps dans le même 20x de grossissement d&#39;image. </li><li> Pour accéder aux mesurées &quot;Evénements&quot; dans un format de style Excel, cliquez sur &quot;Propriétés&quot;, cliquez sur &quot;Mesure&quot; onglet, puis cliquez sur pour afficher «Comme le tableau.&quot; </li><li> Enfin, faites le calcul suivant pour déterminer votre efficacité de la transfection en comparant les deux événements précédemment mesurés: ((cellules totales - Cellules non transfectées) / cellules totales) x 100 = efficacité de la transfection. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Les images en direct de non transfectées (figure 3A) par rapport aux transfectées (figure 3B) neurones montrent que le marquage des anticorps (rouge ou vert dans chaque figure) est clairement observé dans les cellules (figure 3B, C, D). Suite à l&#39;aspiration et de lavage avec support pour éliminer les anticorps ou entre adhérentes à la surface des cellules, des anticorps marqués sont encore présents dans les neurones (figure 3C, D).<html> Pour calculer l&#39;efficacité de la transfection, utilisez le logiciel AxioVision pour calculer nombre total de cellules par rapport aux cellules qui n&#39;ont pas été transfectées avec succès. Ces valeurs ont été entrées dans une formule d&#39;efficacité de transfection pour acquérir l&#39;efficacité de transfection en pourcentage du nombre total de cellules (figure 4). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma des procédures utilisées à des anticorps étiquette avec l&#39;ester NHS 550 Atto suivie par des étapes nécessaires pour concentrer les anticorps marqués. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4154/4154fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig2.jpg" /> Figure 2. Schéma des procédures utilisées pour transfecter des anticorps marqués dans les cellules vivantes en culture.arge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir la figure. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig3.jpg" /> Figure 3. Les images en direct des neurones transfectés 48 heures après la transfection. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig4.jpg" /> Figure 4. Correction d&#39;images et rincés avec les événements en compte afin de déterminer l&#39;efficacité de transfection.

<ol><li>Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope-specific+recognition+of+type+II+collagen+by+rheumatoid+arthritis+antibodies+is+shared+with+recognition+by+antibodies+that+are+arthritogenic+in+collagen-induced+arthritis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse.</a> Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).</li>
<li>Chester, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambert-Eaton+syndrome+antibodies%3A+reaction+with+membranes+from+a+small+cell+lung+cancer+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft.</a> J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).</li>
<li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTLV-1+induced+molecular+mimicry+in+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).</li>
<li>Reeves, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lupus+erythematosus.+Antibodies+to+DNA%2C+DNA-binding+proteins%2C+and+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Rheum.+Dis.+Clin.+North+Am%22%5BJournal%5D)">Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones.</a> Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).</li>
<li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+due+to+molecular+mimicry+as+a+cause+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease.</a> Nat. Med. 8, 509-513 (2002).</li>
<li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+that+recognize+functional+domains+of+hnRNPA1+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease.</a> Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).</li>
<li>Kalume, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mimicry%3A+cross-reactive+antibodies+from+patients+with+immune-mediated+neurologic+disease+inhibit+neuronal+firing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing.</a> J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).</li>
<li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reactivity+between+immunodominant+human+T+lymphotropic+virus+type+I+tax+and+neurons%3A+implications+for+molecular+mimicry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry.</a> J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).</li>
<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+link+between+autoimmunity+and+neurodegeneration+in+immune-mediated+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).</li>
<li>Smeenk, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+antibodies%3A+cause+of+disease+or+caused+by+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease.</a> Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).</li>
<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+glycosylation+of+target+proteins+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+HTLV-1+associated+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).</li>
<li>Reisinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+transfection+of+CHO+cells+with+chemically+defined+transfection+systems+and+investigation+of+their+potential+for+transient+and+stable+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection.</a> Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).</li>
<li>Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-mediated+intracellular+delivery+of+antibodies+into+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells.</a> Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).</li>
<li>Radic, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+P2+is+an+autoantibody+target+in+mice+deficient+for+Mer%2C+Axl%2C+and+Tyro3+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases.</a> J. Immunol. 176, 68-74 (2006).</li>
<li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+%27passive+transfer%27+of+paraneoplastic+stiff+person+syndrome+with+antibodies+to+an+intracellular+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen.</a> Brain. 133, 3164-3165 (2010).</li>
<li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff%2C+twitchy+or+wobbly%3A+are+GAD+antibodies+pathogenic%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic.</a> Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).</li>
<li>Magrys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+anti-alpha-enolase+autoantibodies+in+pathogenicity+of+autoimmune-mediated+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy.</a> J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).</li>
<li>Geis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff+person+syndrome-associated+autoantibodies+to+amphiphysin+mediate+reduced+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition.</a> Brain. 133, 3166-3180 (2010).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Afin de tester des hypothèses sur des molécules spécifiques et de leur expression, des gènes et d&#39;autres vecteurs sont couramment transfecté dans des cellules. L&#39;aspect unique de cette procédure est la possibilité de facilement transfecter des anticorps dans les cellules cibles. Nous avons effectué cette méthode dans cinq expériences séparées, chacune en double. Résultats d&#39;efficacité de transfection étaient similaires chez toutes les expériences. Surtout, le procédé permet l&#39;entrée d&#39;anticorps dans ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Fluorescent Microscope AxioObserver A1 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> AxioVision version 4.2 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rhnRNPA1 </td><td> Abcam </td><td> Ab4791 </td></tr><tr><td> Marqué au FITC anti-Rigg </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> Atto550 ester de NHS </td><td> Sigma </td><td> 92835 </td></tr><tr><td> Ab-DeliverIN </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 +10% FBS antibiotiques +1% </td><td> Gibco </td><td> 11320-033 </td></tr><tr><td> Poly-D-Lysine diapositives Culture de 8 puits </td><td> BD </td><td> 354632 </td></tr><tr><td> Multi-Purpose Rotator </td><td> Scientifique Industries Inc </td><td> Modèle 151 </td></tr><tr><td> DAPI Montage des médias </td><td> Millipore </td><td> S7113 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Ambion </td><td> 9626 </td></tr><tr><td> Dialyseur </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 66380 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-0.5 </td><td> Millipore </td><td> UFC501096 </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde (solution à 4%) </td><td> Sciences microscopie électronique </td><td></td></tr><tr><td> Nano-Drop </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

la transfection d&#39;anticorps dans les neurones comme outil pour étudier la pathogenèse des maladies

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Anticorps offrir la possibilité d&#39;acquérir un nouvel aperçu de divers événements qui se déroulent dans les systèmes vivants. La capacité à produire des anticorps hautement spécifiques à des protéines cibles a permis de très précis des questions biologiques à traiter. Surtout, les anticorps ont été impliqués dans la pathogenèse de plusieurs maladies humaines, notamment le lupus érythémateux systémique (LES), la polyarthrite rhumatoïde (PR), les syndromes paranéoplasiques, la sclérose en plaques (MS) et humaine de type virus T-lymphotrope 1 (HTLV-1) myélopathie associée / paraparésie spastique tropicale (TSP / HAM) 1-9. Comment anticorps provoquent la maladie est un domaine de recherche en cours et les données suggèrent que les interactions entre les anticorps et les différentes molécules intracellulaires résultats dans l&#39;inflammation, modifié cellulaire de messagerie, et l&#39;apoptose 10. Il a été montré que les patients atteints de SEP et TSP / HAM produire des anticorps contre la protéine intracellulaire d&#39;ARN hétérogène protéine de liaison ribonuclear A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Des données récentes indiquent que les anticorps à la fois intra-neuronale et antigènes de surface sont pathogènes 3, 5-9, 11. Ainsi, une procédure qui permet l&#39;étude des anticorps intracellulaire: les interactions entre protéines donnerait une grande perspicacité dans la pathogenèse des maladies. Les gènes sont souvent transfecté dans des cellules primaires et les lignées cellulaires en culture, mais la transfection d&#39;anticorps dans les cellules a été entravée par la modification de la structure d&#39;anticorps ou de l&#39;efficacité de transfection pauvres 12. D&#39;autres méthodes de transfection comprennent la transfection d&#39;anticorps à base de liposomes cationiques (composés de DOTAP / DOPE) et polyéthylèneimines (PEI), tous deux ce qui a entraîné une diminution de dix fois dans la transfection d&#39;anticorps par rapport aux témoins 12. Le procédé mis en oeuvre dans notre étude est similaire à lipide cationique à médiation méthodes et utilise un mécanisme à base de lipides pour former des complexes non covalents avec des anticorps à travers électrostatique et hydrinteractions ophobic 13. On utilise Ac-DeliverIN réactif, qui est une formulation de lipide capable de capturer des anticorps par des interactions non covalentes électrostatiques et hydrophobes et les délivrer à l&#39;intérieur des cellules. Ainsi, chimiques et génétiques raccords ne sont pas nécessaires pour la livraison des anticorps fonctionnels dans les cellules vivantes. Cette méthode nous a permis d&#39;effectuer des anticorps différents traçage et expériences de localisation de protéines, ainsi que les analyses des conséquences moléculaires de l&#39;anticorps intracellulaire: interactions protéiques 9. Dans ce protocole, nous allons montrer comment pour transfecter des anticorps dans les neurones rapide, reproductible et avec un haut degré d&#39;efficacité de la transfection. A titre d&#39;exemple, nous allons utiliser des anticorps anti-hnRNP A1 et anti-IgG. Pour la quantification facile d&#39;efficacité de la transfection, nous avons utilisé des anticorps anti-hnRNP A1 étiquetés avec Atto-550-NHS et marqué au FITC IgG. Atto550 NHS est un nouveau label avec absorption moléculaire élevé et quantique yield. Source d&#39;excitation et des filtres à fluorescence pour Atto550 sont similaires à Cy3 (Ex. 556 Em. 578). En outre, Atto550 a photostabilité élevée. Marqué au FITC IgG ont été utilisés comme contrôle pour montrer que cette méthode est polyvalent et se teignait pas dépendant. Cette approche et les données qui sont générées aidera à comprendre le rôle que les anticorps à des antigènes cibles intracellulaires pourrait jouer dans la pathogenèse des maladies humaines.

Une réponse rapide pour étudier les interactions et les effets sur les mécanismes moléculaires liés à la présence d&#39;anticorps dans un environnement intracellulaire est décrite. Le procédé comprend la transfection d&#39;anticorps dans des cellules vivantes à l&#39;aide d&#39;une formation de complexe non covalent sur la base d&#39;une formulation de lipide. La technique est adaptable à des lignées de cellules immortalisées et des cellules primaires.

La transfection d&#39;anticorps dans les neurones comme outil pour étudier la pathogenèse des maladies

Les anticorps permettent d'acquérir de nouvelles connaissances sur divers événements se produisant dans les systèmes vivants. La capacité de produire des anticorps hautement spécifiques...

L'objectif de cette procédure est de fournir une approche rapide et reproductible pour étudier les anticorps, les mécanismes moléculaires auto-immuns liés à la fonction neuronale et la pathogenèse des maladies neurologiques. Dans un premier temps, les anticorps sont marqués avec un fluorochrome ATO five 50 NHS. Ensuite, les anticorps sont mélangés au réactif de transfection, puis transférés dans des cellules neuronales.En culture, 48 heures après la transfection, les neurones sont fixés et montés avec un milieu DPI, puis visualisés par microscopie d'immunofluorescence. L'efficacité de la transfection peut être calculée à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en neurosciences et en neuro-immunologie, telles que la manière dont les auto-anticorps modifient les mécanismes moléculaires liés à la fonction neuronale et à la pathogenèse des maladies neurologiques d'origine immunitaire.L'idée de cette méthode est née lorsque nous souhaitions tester l'hypothèse selon laquelle les anticorps dirigés contre h et RPA un, ainsi que contre la protéine liant l'ARN surexprimée dans les neurones, contribuaient au mécanisme de neurodégénérescence. La procédure sera démontrée par Josh Douglas, étudiant diplômant. Avant de commencer la procédure, assurez-vous que des cellules neuronales intactes de haute qualité, ensemencées à raison de 100 000 cellules par puits et présentant une confluence d'au moins 80 %, sont disponibles la veille des expériences. Le jour du test, observez les cellules afin de vous assurer qu'elles sont en bon état.Commencez par préparer 0,1 mil de tampon de bicarbonate de sodium en mélangeant 8,4 grammes de bicarbonate de sodium et 29,2 grammes de chlorure de sodium dans un litre d'eau. Ajustez ensuite le pH du tampon à 8,4 pour 500 microlitres de tampon. Ajoutez 70 microlitres de l'anticorps à transfecter, dans ce cas l'anti H-N-R-N-P-A un, et 35 microlitres du réactif de marquage ici à oh cinq 50 NHS.Faites tourner la solution à température ambiante pendant une heure, puis injectez-la dans un dialyseur et effectuez la dialyse dans deux litres de PBS à quatre degrés Celsius toute la nuit. Le lendemain, utilisez une colonne de concentration par centrifugation pour concentrer l'anticorps marqué dialysé. Enfin, déterminez la concentration en anticorps à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop.Dans une lame à huit puits, placer 10 000 cellules par puits dans un volume de 500 microlitres de DMEM complet. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius toute la nuit ou jusqu'à ce que la confluence cellulaire atteigne au moins 70 %. Une fois les cellules confluentes à 70 %, commencer la procédure en mélangeant deux microlitres d'anticorps, en ajoutant les réactifs de transfection et deux microgrammes d'anticorps marqué à 0,5 microgramme par microlitre dans un eppendorf, puis incuber la solution pendant 10 à 15 minutes à température ambiante.Entre-temps, retirez le milieu natum des puits de culture cellulaire et remplacez-le par exactement 394 microlitres par puits d'un milieu frais. Une fois la solution de transfection prête, ajoutez 100 microlitres de DMEM et mélangez en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Ajoutez ensuite exactement 106 microlitres du mélange de transfection dans chaque puits contenant des cellules, afin d'obtenir un volume final de 500 microlitres par puits.Veillez à inclure un puits témoin négatif NON TRANSFECTÉ auquel du DMEM est ajouté au lieu d'anticorps. Incubez les cellules pendant 48 heures à 37 degrés Celsius. Après cette période d'incubation, remplacez le milieu par du DMEM frais et effectuez un examen en temps réel à l'aide d'un microscope à fluorescence 48 heures après le marquage.Pour visualiser cinq anticorps marqués NHS ATO 50, utilisez le filtre SI trois après avoir effectué l'imagerie en direct ; aspirez ensuite le milieu et fixez les cellules en ajoutant du paraformaldéhyde à 4 % et en incubant la lame pendant 15 minutes à température ambiante. Une fois les cellules fixées, lavez-les quatre fois dans du PBS en prévoyant une période d'incubation de cinq minutes dans le PBS pour chaque lavage. Puis éliminez le PBS et ajoutez une goutte de milieu de montage contenant du DPI.Pour chaque échantillon, placez délicatement une lame couvre-objet au-dessus des cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence. Commencez l’imagerie des cellules. Dans cette expérience, nous avons réalisé avec succès l’imagerie en temps réel par fluorescence de neurones vivants transfectés avec des anticorps anti-H-N-R-N-P-A1 marqués ATO cinq 50 NHS.Cette image montre des anticorps au sein des cellules neuronales, y compris les prolongements cytoplasmiques neuronaux, ainsi que la fixation et la coloration du noyau. L'utilisation du DPI, représenté ici en bleu, permet de déterminer l'efficacité de transfection en divisant le nombre de cellules transfectées par le nombre total de cellules. Dans ce cas, l'efficacité est de 50 % après cette procédure.D'autres méthodes telles que l'immunocytochimie, l'extraction d'ARN, l'analyse par microréseau et les immunotests de type western blot peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la colocalisation d'anticorps au sein d'organites cellulaires, ainsi que les modifications de la fonction et de l'intégrité neuronales liées à la spécificité de l'anticorps pour l'antigène cible. Dans cette vidéo, nous avons montré comment marquer des anticorps avec un marqueur fluorescent, préparer un complexe entre un réactif de transfection et des anticorps marqués de manière fluorescente, transfecter des neurones et calculer l'efficacité de la transfection. Cette méthode est utile pour évaluer l'impact des autoanticorps sur des fonctions cellulaires telles que la viabilité, l'apoptose, le transport neuronal, ainsi que sur les mécanismes moléculaires liés à la fonction neuronale et à la pathogenèse des maladies neurologiques.

antibody-transfection-into-neurons-as-tool-to-study-disease

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Cette vidéo démontre le processus de transduction de cellules neuronales humaines avec un lentivirus codant pour une protéine tau humaine mutante marquée avec une protéine fluorescente jaune (YFP) pour étudier l’agrégation de protéines. Il décrit les étapes de l’entrée virale à l’expression de la protéine tau mutante, aboutissant à la formation d’agrégats cytoplasmiques visibles de tau dans les neurones.

Transduction des neurones humains à médiation lentivirale pour l’analyse de l’agrégation de protéines tau

Ici, nous démontrons une technique de transduction neuronale généralisée par injection intraventriculaire d’un virus adéno-associé dans le cerveau de souris néonatale.  Cette méthode offre un moyen rapide et facile d’obtenir l’expression à vie des transgènes délivrés par le virus.

Injection virale intracérébro du cerveau de souris nouveau-né pour la transduction neuronale persistante et généralisée

Le contrôle de l’expression des protéines est non seulement essentiel à chaque organisme vivant, mais constitue également une stratégie importante pour étudier les fonctions des protéines dans des modèles cellulaires. Le protocole présenté montre l’application de l’interférence des anticorps dans les cellules de mammifères, y compris les neurones primaires de l’hippocampe, et démontre l’utilisation de reconstructions tridimensionnelles dans l’étude de la fonction des protéines.

Etudier la fonction des protéines et le rôle de Altered Expression des protéines par les interférences des anticorps et des reconstructions tridimensionnelles

Ce manuscrit décrit comment l’administration locale de gènes par vecteur viral offre un moyen attrayant d’exprimer des transgènes dans le système nerveux central.  Le protocole décrit toutes les étapes cruciales pour effectuer une injection de vecteur viral dans la substance noire du rat afin de développer un modèle animal basé sur un vecteur viral pour la maladie de Parkinson.

Élaboration d&#39;un modèle de rat à base alpha-synucléine pour la maladie de Parkinson par injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral adéno-associé recombinant

Intrarachidienne de recombinase dépendant adeno-associated virus recombinant (rAAV) peut être utilisée pour manipuler n’importe quel type de cellules génétiquement marquées dans la moelle épinière. Ici, nous décrivons comment transmettre des neurones de la corne dorsale de la moelle épinière lombaire. Cette technique permet d’interrogatoire fonctionnelle du sous-type neurone manipulé.

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression dans les neurones de la moelle épinière génétiquement définies

Le but du présent protocole est de fournir un système de base de cellules qui réplique la formation d’alpha-synucléine aggregates in vivo. Des inclusions intracellulaires alpha-synucléine sont ensemencées dans des neurones primaires par l’internalisation et propagation d’exogène administrée natif associées aux microsomes alpha-synucléine agrégats isolés de souris transgénique alpha-synucléine malades.

Administration exogène d’Alpha-synucléine Microsomes associées aux agrégats de neurones primaires comme un modèle de cellulaire puissant de la Formation de fibrilles

L’objectif de cette technique consiste à préparer une culture fortement enrichie des motoneurones primaires (MNs) de moelle épinière murine. Afin d’évaluer les conséquences des mutations responsables de maladies MN, nous décrivons ici l’isolement de ces isolés MNs et leur transfection par magnétofection.

Maladie de Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro de modélisation par transfectants souris primaire motoneurones

Ce protocole détaille une procédure dans laquelle les cultures neuronales humaines sont transproduites avec des constructions Lentivirales codant pour le tau humain mutant. Les cultures transproduites présentent des agrégats Tau et des pathologies associées.

Un modèle in vitro pour étudier l’agrégation de Tau à l’aide de la transduction à médiation Lentivirale des neurones humains

L’encéphalite auto-immune est une nouvelle catégorie de maladies du système nerveux central médiées par les anticorps. Les neurones de l’hippocampe peuvent être utilisés pour découvrir et caractériser ces anticorps. Cet article fournit un protocole pour la culture cellulaire primaire et l’immunomarquage afin de déterminer les autoanticorps dans le sérum et le liquide céphalorachidien des patients.

Cultures neuronales hippocampiques pour détecter et étudier de nouveaux anticorps pathogènes impliqués dans l’encéphalite auto-immune

Ici, nous démontrons comment combiner la transfection des neurones primaires de rongeurs de l’hippocampe avec l’imagerie confocale de cellules vivantes pour analyser les effets induits par les protéines pathologiques sur le transport axonal et identifier les voies mécanistes médiant ces effets.

Utilisation de l’imagerie de cellules vivantes pour mesurer les effets de protéines pathologiques sur le transport axonal dans les neurones primaires de l’hippocampe

Découvrez la transfection d'anticorps fluorescents dans les neurones pour étudier la pathogenèse des maladies neurologiques. Cette méthode permet de visualiser les effets des autoanticorps sur la fonction neuronale.

La transfection d'anticorps dans les neurones comme outil pour étudier la pathogenèse des maladies

Explorer plus de vidéos