Profilage global de régulation de la dopamine dans la substance noire et aire tegmentale ventrale

L'objectif général de cette procédure est de maximiser l'information fournie par les lectures moléculaires associées à la régulation de la dopamine à partir d'une seule dissection tissulaire provenant des régions somato-dendritiques du cerveau moyen. Cela est réalisé en effectuant d'abord une dissection précise permettant de séparer la substance noire de la zone ventrale tegmentale. La deuxième étape consiste à traiter les tissus afin d'analyser la dopamine par HPLC, puis à soumettre les protéines endogènes précipitées à des analyses complémentaires.

Ensuite, le traitement de la protéine précipitée pour la teneur totale en protéines permet de déterminer quelles protéines régulatrices de la dopamine ou quelles phosphorylations protéiques peuvent être mesurées conjointement avec le dosage de la teneur tissulaire en dopamine dans l'échantillon. En définitive, les analyses de la dopamine et de ses protéines régulatrices dans les régions discrètes du mésencéphale, ainsi que dans les régions somato-dendritiques, permettent de tirer des conclusions sur les mécanismes moléculaires associés à la régulation de la dopamine.

Les monoamines influencent de nombreux comportements, et en effet, les chercheurs dans les domaines de l'addiction, de la biologie et des troubles de la locomotion, notamment dans la maladie de Parkinson, s'intéressent vivement à la manière dont des monoamines comme la dopamine, que nous étudions dans mon laboratoire, affectent les comportements. Mais l'importance de l'étude des monoamines peut être encore approfondie si nous comprenons comment elles sont régulées au niveau moléculaire. L'avantage de notre technique est que, à partir d'un seul échantillon obtenu à partir de tissu du système nerveux central, nous pouvons obtenir plusieurs lectures issues de ce même échantillon, ce qui nous permet d'obtenir une évaluation complète de la manière dont les événements moléculaires affectent la dysrégulation des monoamines.

Nous pouvons prendre ces données puis les replacer dans le contexte de l'impact sur le comportement. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car la détermination des protéines et de la phosphorylation exige de connaître la quantité totale de protéine nécessaire pour obtenir un résultat précis, selon les anticorps choisis par l'expérimentateur. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle.

Les techniques de dissection et la détermination des mono avec les protéines régulatrices constituent une approche relativement nouvelle pour analyser la régulation in vivo. Pour commencer cette procédure, refroidissez la matrice cérébrale de rongeur, une boîte de Pétri contenant cinq lames de rasoir et un scalpel de numéro 11 sur un lit de glace fondante. Prérefroidissez également autant de tubes que nécessaire pour la dissection sur de la glace sèche.

Ensuite, après avoir sacrifié un rat, retirez son cerveau et placez-le à l’envers de sorte que le cervelet latéral s’insère dans les encoches de la matrice glacée. Après une minute, insérez les lames de rasoir froides dans le cerveau refroidi, en commençant à environ deux millimètres en avant (rostal) par rapport au chiasma optique pour l’analyse du striatum et du noyau accumbens. Puis continuez à insérer les lames de rasoir froides tous les un millimètre jusqu’au milieu des pédoncules, puis décalez légèrement la position de chaque lame afin de faciliter son retrait ultérieur de la matrice.

Lorsque vous retirez les lames, recherchez le début de l'hippocampe, car il constitue le meilleur repère pour s'assurer de la présence de la substance noire (SN) et de l'aire tegmentale ventrale (VTA) à l'endroit où l'hippocampe entoure complètement le mésencéphale. Effectuez des coupes à l'aide d'une lame de scalpel n°11 pour disséquer d'abord la SN à partir de la VTA. Retirez le cortex et l'hippocampe situés en superficie.

Ensuite, effectuez une incision verticale séparant la région pigmentée de la SN du VTA, en veillant à ce que le rasoir soit constamment en contact avec la glace pilée durant la dissection. Puis, réalisez une incision horizontale au niveau ou près de la ligne médiane, juste au-dessus de la partie dorsale et latérale la plus élevée du SN. Enfin, détachez délicatement la SN du reste du tronc cérébral.

Une fois que la SN a été retirée, séparez le VTA du reste du mésencéphale. Placez immédiatement les tissus disséqués dans des tubes microfuge prérefroidis. Conservez ensuite les tissus à moins 80 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être traités.

Dans cette procédure, homogénéisez délicatement le tissu immédiatement après son retrait de la glace sèche à l’aide d’une solution d’acide perchlorique 0,1 molaire contenant de l’EDTA, refroidie sur glace. Ensuite, remettez l’échantillon sur de la glace sèche. Puis, centrifugez les échantillons à 12 000 tr/min pour provoquer la sédimentation.

Le culot protéique destiné à être utilisé pour les déterminations par immunotransfert, aspirer ensuite les surnageants dans le flacon HPLC. Placer les culots protéiques précipités, encore congelés, issus du traitement par le tampon HPLC, sur de la glace pilée pour les décongeler et s'assurer que tout le tampon a été complètement éliminé et archivé. Pour le traitement bilatéral de la SN, ajouter 300 microlitres de SDS 1 % contenant 5 millimolaire de triss et 1 millimolaire de EDTA au culot, puis soniquer ; pour le traitement bilatéral du VTA, 200 microlitres de SDS 1 % suffisent.

Ensuite, placez les échantillons dans l'eau bouillante pendant environ cinq minutes pour terminer la dénaturation des protéines. Laissez-les ensuite refroidir à température ambiante et assurez-vous que les bouchons sont bien fermés à cette étape. Utilisez ensuite le dosage BCA avec une courbe standard de protéines comprise entre deux et 40 microgrammes de protéine.

Pour déterminer la concentration en protéines dans les échantillons de cinq microlitres, utilisez la valeur médiane obtenue à partir d'une analyse en triplicat afin de déterminer la quantité de protéines par rapport à la courbe standard. Divisez le résultat par le volume de l'échantillon pour obtenir la concentration en protéines. Ensuite, préparez les échantillons avec le tampon d'échantillonnage contenant DIO trois etol pour une électrophorèse SDS réductrice sur gel d'acrylamide à 10 %, si nécessaire, comme indiqué par la couleur du tampon d'échantillonnage.

Changez en jaune, ajoutez une solution basique de Tris à un molaire, pH 8,2, par incréments de 10 microlitres au prélèvement jusqu’à l’apparition d’une couleur bleue. Pour garantir un pH correct, séparez la quantité appropriée de protéines totales par électrophorèse SDS-PAGE sur gel d’acrylamide à 10 %, puis transférez les protéines sur une membrane de nitrocellulose de 0,45 micron de diamètre de pore. Réglez le bloc électrophorétique sur au moins 27 volts et laissez le transfert s’effectuer toute la nuit.

Le lendemain, faites sécher la membrane pendant au moins 30 minutes. Ensuite, coloriez-la avec la solution poncho S pendant environ cinq minutes. Après cela, rincez-la énergiquement avec une solution d'acide chlorhydrique à 0,2 % jusqu'à ce que les bandes protéiques individuelles soient bien définies et que la coloration du fond soit éliminée.

Ensuite, obtenir une image de la coloration du poncho S à l'aide d'ImageJ afin de quantifier davantage les charges relatives en protéines dans chaque puits et de normaliser les résultats de l'hydroxylase de la tyrosine, du transporteur de la dopamine ou du transporteur vésiculaire de l'amine monoamine deux. Voici le western blot de l'hydroxylase de la tyrosine phosphorylée sur la sérine 31 de rat dans les échantillons de la substance noire de rat. La courbe standard calibrée de l'hydroxylase de la tyrosine phosphorylée sur la sérine 31 s'étend de 0,3 nanogramme à 2,0 nanogrammes et se situe dans la plage linéaire de détection. Voici le western blot de l'hydroxylase de la tyrosine phosphorylée sur la sérine 40 dans les échantillons de la région tegmentale ventrale de rat.

La courbe standard de la tyrosine hydroxylase phosphorylée SN 40 étalonnée s'étend de 0,2 à 1,5 nanogrammes et se situe dans la plage linéaire de détection. Il est important de maintenir une température adéquate ainsi que d'étiqueter correctement les tubes. Il est également essentiel de normaliser les protéines afin de réduire la variance de vos résultats.

Ce protocole, lorsqu'il est suivi rigoureusement, peut fournir aux chercheurs spécialisés dans le fonctionnement locomoteur et les comportements liés à l'addiction des données moléculaires approfondies sur la régulation des monoamines et du cerveau, en particulier de la dopamine, qui est au cœur de notre intérêt. En conséquence, ces données permettent une analyse très détaillée et complète des conséquences comportementales. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'optimiser les données relatives à la régulation des monoamines dans la substance noire et l'aire tegmentale ventrale à partir d'une seule dissection tissulaire.