Un protocole simple pour extraire l'hémocytes de chenilles sauvages

L'objectif général de cette procédure est d'extraire, de visualiser et de compter les hémocytes à partir de chenilles sauvages. Cette opération s'effectue tout d'abord en anesthésiant la chenille en la plaçant sur de la glace, en l'injectant avec une solution tampon contenant un anticoagulant, puis en replaçant la chenille sur la glace afin de permettre aux hémocytes de réintégrer la circulation avant l'extraction. La deuxième étape consiste à pratiquer une incision superficielle à l'extrémité postérieure de la chenille à l'aide d'un scalpel propre.

Ensuite, la chenille est délicatement pressée à l’aide de pinces douces. Puis, le mélange de lymphe hémorragique et de solution tampon est aspiré à l’aide d’une micropipette et recueilli dans un tube microcentrifuge. La dernière étape consiste à mélanger délicatement la solution de lymphe hémorragique avec un volume équivalent de solution tampon, puis à transférer 10 microlitres de la solution sur un hémocytomètre afin de visualiser et de compter le nombre de hématocytes.

En fin de compte, cette méthode d'extraction d'hémocytes peut être utilisée comme une méthode rapide et efficace pour dénombrer les hémocytes provenant de diverses espèces de chenilles, et servir d'outil pour examiner les aspects physiologiques de la réponse immunitaire cellulaire des insectes. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'extraire des hémocytes de chenilles présentant une région prothoracique très réduite. D'autres modèles de chenilles sont saignés en coupant l'une des prothèses, permettant ainsi d'extraire les hémocytes du liquide qui s'écoule.

En outre, cette technique peut être utilisée pour extraire des hémocytes d'autres espèces d'insectes. Cette méthode permet de répondre à des questions fondamentales dans le domaine de l'écologie immunitaire, telles que la manière dont la réponse immunitaire cellulaire des insectes varie en fonction de la qualité du régime alimentaire, du stade de développement ou de l'exposition à différents agents pathogènes. Pour commencer cette procédure, anesthésiez les larves de l'avant-dernier stade en les refroidissant sur de la glace pendant 20 minutes avant l'extraction des hémocytes.

Ensuite, insérez l'extrémité émoussée d'une aiguille capillaire propre de calibre 16 dans le tube relié à une seringue en verre de 20 millilitres. Laissez le tube contenant la solution de collecte ouvert sur la paillasse du laboratoire. Remplissez lentement le capillaire avec environ 10 à 15 microlitres de tampon.

Ensuite, poser l'aiguille sur une boule d'argile placée à côté du microscope stéréoscopique. Placer la chenille dans une boîte de Pétri. L'insecte doit être positionné sur le côté afin que les sphérités soient clairement visibles.

En observant au microscope stéréoscopique, maintenez le chenillon en place à l’aide d’une pince et placez l’aiguille près de l’une des sphères où la cuticule de l’insecte est généralement plus molle. Ensuite, appuyez doucement l’aiguille capillaire contre le corps de l’insecte. Une fois l’aiguille pénétrée à travers la cuticule, injectez le volume total de solution dans le chenillon.

Le corps de la chenille gonflera après l'injection, mais il ne devrait pas éclater ni suinter. Remettez la chenille dans la boîte de Pétri glacée. Placez l'insecte en position dorsale pour éviter que le tampon ne s'écoule par la plaie.

Répétez les injections pour chaque chenille utilisée pour l'extraction de l'hémolymphe. Ensuite, laissez tous les insectes refroidir sur de la glace pendant 30 minutes. Placez maintenant la chenille dans une boîte de Pétri sous le microscope stéréoscopique.

Effectuez soigneusement une incision superficielle d’environ deux à trois millimètres de long dans la région postérieure de la chenille, à l’aide d’un scalpel stérile, sans endommager l’intestin ni les autres organes internes. Ensuite, comprimez délicatement la chenille à l’aide d’une pince en plastique souple tout en recueillant environ 10 à 20 microlitres du mélange hémolymphe à l’aide d’une pipette de 10 microlitres. Veillez à nouveau à ne pas blesser les tissus internes.

Ensuite, éliminez les restes des chenilles. Recueillez l'hémolymphe de chaque chenille dans des tubes microcentrifugeurs en silicium, étiquetés, de 0,5 millilitre. Puis ajoutez environ 10 à 20 microlitres de la solution d'incubation à chaque échantillon d'hémolymphe prélevé d'une chenille individuelle.

Gardez les échantillons d'hémolymphe sur de la glace en tout temps lors de cette étape. Mélangez l'échantillon d'hémolymphe et la solution d'incubation immédiatement avant le comptage. He cytes.

Ce traitement permet une séparation adéquate des hémocytes et empêche l'agglutination. Utilisez une pointe de pipette propre pour transférer 10 microlitres d'échantillon d'hémolymphe mélangé à la solution d'incubation sur un hémocytomètre. Ensuite, à l'aide d'un microscope composé, comptez et enregistrez le nombre d'hémocytes présents dans au moins 15 des grandes cases de la grille centrale de l'hémocytomètre.

Ajoutez ces valeurs pour obtenir la somme totale du nombre de cellules sanguines présentes dans les 15 carrés. Ensuite, rincez soigneusement le compteur de cellules sanguines et sa lame de couverture à l’aide d’un flacon pulvérisateur contenant de l’eau distillée et déionisée. Puis essuyez-les avec des lingettes Kim.

Répétez les procédures pour les autres échantillons d’hémolymphe et calculez le nombre moyen d’hémocytes par millilitre de volume d’hémolymphe pour chaque chenille. L’image en microscopie à champ clair montre les hémocytes extraits de chenilles de *Nucleopolyhedrovirus* observés à un grossissement de 20 x. Après cette procédure, les hémocytes collectés peuvent être utilisés pour étudier la réponse immunitaire cellulaire et mettre en place des tests tels que la phagocytose, la CAP, l’encapsulation sélective et l’activité de la phénol oxydase.

En outre, l'ARN, l'ADN et les protéines peuvent être collectés sans être utilisés pour des analyses supplémentaires afin d'étudier ces réponses immunitaires cellulaires chez les insectes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment injecter des chenilles afin de prélever de l'hémolymphe et comment recueillir de l'hémolymphe contenant des hémoctyes vivants.