Un protocole simple pour extraire l'hémocytes de chenilles sauvages

L’objectif global de cette procédure est d’extraire, de visualiser et de compter les cytes des chenilles sauvages. Pour ce faire, on anesthésie d’abord la chenille en la plaçant sur de la glace, en lui injectant une solution tampon contenant un anticoagulant et en renvoyant la chenille dans la glace pour permettre aux cytes de rentrer dans la circulation avant l’extraction. La deuxième étape consiste à faire une incision peu profonde à l’extrémité postérieure de la chenille à l’aide d’un scalpel propre.

Ensuite, la chenille est doucement pressée à l’aide d’une pince douce. Ensuite, la solution tampon de mélange d’hémolymphe est aspirée à l’aide d’une micro-pipette et recueillie dans un micro-tube à centrifuger. La dernière étape consiste à mélanger doucement la solution d’hémolymphe avec un volume égal de solution tampon et à transférer 10 microlitres de la solution sur un hémocytomètre pour visualiser et compter le nombre de cytes.

En fin de compte, cette méthode d’extraction des hémocytes peut être utilisée comme une méthode rapide et efficace pour compter les cytes de diverses espèces de chenilles et conserver comme outil pour examiner les aspects physiologiques de la réponse immunitaire cellulaire des insectes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour extraire les hémogrammes de chenilles à proximité très réduite. D’autres modèles de chenilles sont saignés en coupant l’un des pros, en extrayant les cytes du liquide qui en sort.

De plus, cette technique peut être utilisée pour extraire l’hémotype d’autres espèces d’insectes. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le domaine de l’éco-immunologie, telles que la façon dont la réponse immunitaire cellulaire des insectes varie avec la qualité de l’alimentation, le stade de développement ou l’exposition à différents agents pathogènes. Pour commencer cette procédure, anesthésez les larves de l’avant-dernier stade en les refroidissant sur de la glace pendant 20 minutes avant l’extraction des hémocytes.

Après cela, insérez l’extrémité émoussée d’une aiguille capillaire propre de calibre 16 dans le tube relié à une seringue en verre de 20 millilitres. Laissez le tube contenant la solution de prélèvement ouvert sur la paillasse du laboratoire. Remplissez lentement le capillaire avec un tampon d’environ 10 à 15 microlitres.

Posez ensuite l’aiguille sur une boule d’argile qui est placée à côté du microscope de dissection. Placez la chenille dans une boîte de Pétri. L’insecte doit être positionné sur le côté de manière à ce que les sphères soient clairement visibles.

Lors de l’observation au microscope à dissection, maintenez la chenille en place à l’aide d’une pince et placez l’aiguille près de l’une des sphères où la cuticule de l’insecte est généralement plus molle. Appuyez ensuite doucement l’aiguille capillaire contre le corps de l’insecte. Une fois que l’aiguille a pénétré dans la cuticule, injectez le volume total de solution dans la chenille.

Le corps de la chenille gonflera suite à l’injection, mais il ne doit pas éclater ou suinter. Remettez la chenille dans la boîte de Pétri glacée. Positionnez l’insecte dorsalement pour éviter que le tampon ne s’échappe de la plaie.

Répétez les injections pour chaque chenille utilisée pour l’extraction de l’hémorro-molle. Laissez ensuite tous les insectes refroidir sur de la glace pendant 30 minutes. Maintenant, placez la chenille dans une boîte de Pétri sous le microscope à dissection.

Faites soigneusement une incision peu profonde d’environ deux à trois millimètres de long dans la région postérieure de la chenille, à l’aide d’un scalpel stérile sans endommager l’intestin ou d’autres organes internes. Ensuite, pressez doucement la chenille à l’aide d’une paire de pinces en plastique flexible tout en recueillant environ 10 à 20 microlitres du mélange d’hémorragie molle avec une pointe de pipette de 10 microlitres. Encore une fois, veillez à ne pas blesser les tissus internes.

Après cela, jetez les restes de chenilles. Collectez l’hémorragie de chaque chenille dans des microtubes à centrifuger siliconés de 0,5 millilitre étiquetés séparément. Ajoutez ensuite environ 10 à 20 microlitres de solution d’incubation à chaque échantillon d’hémorbo-molle prélevé sur une chenille individuelle.

Gardez les échantillons d’hémolymphe sur la glace en tout temps à cette étape. Mélangez l’échantillon d’hémolymphe et la solution d’incubation immédiatement avant de compter. Il cyte.

Ce traitement permet une bonne séparation des cytes et empêche l’agglutination. À l’aide d’une pointe de pipette propre, transférez 10 microlitres d’échantillon d’hémolymphe mélangé à la solution d’incubation sur un cytomètre hémologique. Ensuite, à l’aide d’un microscope composé, comptez et enregistrez le nombre de cytes dans au moins 15 des grands carrés de la grille centrale de l’hémocytomètre.

Additionnez ces valeurs pour obtenir la somme totale du nombre d’hémocytes dans les 15 carrés. Ensuite, rincez abondamment l’hémocytomètre et sa lame de couverture à l’aide d’un flacon toilette avec de l’eau distillée et déminéralisée. Ensuite, essuyez-le avec des lingettes Kim.

Répétez les procédures pour le reste des échantillons d’hémo-mollesse et calculez le nombre moyen de cytes par millilitre de volume hémo-mou pour chaque chenille. L’image de microscopie à fond clair montre les cytes extraits des chenilles du nucule hin ai à un grossissement de 20 x. À la suite de cette procédure, les hémocytes collectés pourraient être utilisés pour étudier la réponse immunitaire cellulaire et mettre en place des tests tels que la phagocytose et la coiffe, l’encapsulation sélective et l’activité de la pH-oxydase.

De plus, le R-N-A-D-N-A et la protéine peuvent être collectés sans être utilisés pour d’autres tests afin d’étudier cette réponse immunitaire cellulaire chez les insectes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’injecter des chenilles dans le but d’extraire l’hémolymphe et de la façon de collecter l’hémolymphe contenant des hémocytes vivants.