Une méthode mise à jour EPA 1623 qui utilise tangentielle débit à fibres creuses d'ultrafiltration et de chaleur étapes de dissociation pour la détection de voie d'eau

L'objectif général de cette procédure est de détecter et de visualiser les espèces de cryptosporidium et de giardia présentes dans l'eau. Cela est réalisé en premier lieu en concentrant l'échantillon d'eau à l'aide d'une filtration tangentielle à flux radial, par fibres creuses et ultrafiltration. La deuxième étape consiste à éluer les organismes et à retenir les débris provenant du filtre après une étape de centrifugation.

La séparation immunomagnétique permet une séparation sélective des parasites à partir des débris concentrés. Les billes magnétiques sont détachées des parasites par dissociation thermique et éliminées à l’aide d’un aimant. Les kystes et les O kystes sont ensuite déposés sur une lame, et l’échantillon est coloré pour visualisation par microscopie en immunofluorescence.

L'avantage principal de la filtration hofi par rapport aux techniques existantes est que le filtre ultra est nettement moins coûteux et permet de capturer plusieurs micro-organismes en plus de Cryptosporidium et Giardia, tels que les virus et les bactéries. En général, les personnes novices en immunoséparation seront confrontées à la quantité et au type de débris associés à différents échantillons provenant de conditions climatiques très variées. Commencez par monter l'appareil de filtration ultra dans une cabine de sécurité biologique.

Une fois assemblé, l'appareil fonctionne de la manière suivante : l'échantillon d'eau pénètre dans le système en passant par le raccord en T noir et circule à travers la tête de pompe, le manomètre, puis dans le filtre à fibres creuses. L'eau filtrée s'écoule sur le côté du filtre vers le récipient de déchets. L'eau retenue, contenant les organismes, est dirigée vers la bouteille de rétention et recirculée dans le système jusqu'à ce que le volume d'eau soit réduit. Pour commencer la procédure, retirez le bouchon de ventilation et ouvrez toutes les pinces, sauf la pince n°2, qui doit rester fermée afin que la bouteille de rétention se remplisse d'eau. Réglez le sens de la pompe de sorte que l'échantillon d'eau circule vers le filtre.

Ensuite, réglez la vitesse de la pompe à 25 % et mettez la pompe en marche lorsque la bouteille de rejet est remplie aux deux tiers. Fermez la pince deux et scellez rapidement la bouteille hermétiquement à l’aide du bouchon de ventilation. Vérifiez tous les tuyaux et raccords pour vous assurer qu’il n’y a aucune fuite.

Ensuite, augmentez lentement la vitesse de la pompe jusqu'à environ 1,5 litre par minute à l'aide d'un cylindre gradué et d'un chronomètre ou d'un débitmètre, et vérifiez que le débit du filtrat, c'est-à-dire le débit de l'eau sortant par la ligne d'effluent, est effectivement de 1,5 litre par minute. Surveillez le processus de filtration en vous assurant que le flacon de rétention ne se vide jamais, bien que le volume puisse légèrement augmenter ou diminuer. Si le volume descend en dessous d'un tiers, retirez le bouchon de ventilation et fermez la pince de serrage numéro deux.

À nouveau, laissez le volume dans la bouteille augmenter jusqu’aux deux tiers. Ensuite, remettez fermement le bouchon de ventilation en place et rouvrez à nouveau la pince n°2. Une fois que le récipient d’échantillon est vide, fermez immédiatement la pince n°1, réduisez la vitesse de la pompe à 20 %. Retirez le bouchon de ventilation de la bouteille de rétention et fermez la pince de régulation reliant le tube d’effluent de la colonne de filtration au réservoir de déchets.

Serrer ou desserrer le collier de serrage pour ajuster le volume dans la bouteille de rétention à environ 200 millilitres. Ensuite, serrer le collier de serrage pour l'élution afin d'éluer l'échantillon. Ajouter d'abord 500 millilitres de solution d'élution au récipient contenant l'échantillon, en rinçant au passage l'intérieur du récipient.

Ensuite, placer la pipette de 10 millilitres reliée à la ligne d'aspiration de l'échantillon dans le récipient contenant la solution d'élution. Ouvrir brièvement la pince à écrasement n°1 et fermer la pince à écrasement n°2 pour aspirer la solution d'élution. Une fois que toute la solution a été chargée, fermer la pince à écrasement n°1, ouvrir la pince à écrasement n°2 et laisser la solution circuler pendant cinq minutes à une vitesse de pompe de 20 %. Serrer ou desserrer la pince de réglage pour ajuster le volume d'échantillon dans le flacon de renat à environ 100 millilitres.

Ensuite, serrer complètement l'attache de la rampe et laisser l'échantillon recirculer pendant une minute. À ce stade, inverser le sens de la pompe pendant 20 secondes. Cela entraînera l'accumulation d'environ 225 millilitres d'échantillon dans la bouteille Tate.

Ensuite, éteignez la pompe. Retirez le tube du rotor de la pompe et le tube sortant du filtre, puis maintenez le tube au-dessus du flacon Tate pour forcer tout échantillon restant à s'écouler dans le flacon. Déconnectez ensuite tous les tubes du flacon et remplacez le bouchon ventilé par un bouchon non ventilé.

Transférez l'échantillon concentré dans un tube conique de centrifugation de 250 millilitres. Rincez le flacon de percolat deux fois avec 10 millilitres d'eau réactif et transférez les eaux de rinçage dans le tube de centrifugation. Centrifugez l'échantillon à un minimum de 1500 ×g pendant 15 minutes.

Ne pas utiliser de frein pour arrêter la centrifugation. Après la centrifugation, aspirer soigneusement le surnageant jusqu'à cinq millilitres au-dessus du culot. Il convient de prendre des précautions particulières pour rester en surface du niveau liquide et éviter d'aspirer les kystes O et les kystes présents dans le culot.

Vortexez le tube pour resuspendre complètement le culot. Transférez ensuite l'échantillon dans un tube Dyal L 10 à parois plates contenant un millilitre de tampon A 10 X SL et un millilitre de tampon B. Rincez le tube de centrifugation deux fois avec 2,5 millilitres d'eau réactif et ajoutez les solutions de rinçage dans le tube Dyal L 10. Pour obtenir un volume final de 12 millilitres, ajoutez 100 microlitres de chacun des anticorps conjugués à des billes magnétiques anti-cryptosporidium et anti-giardia dans le tube.

Ensuite, faire tourner le tube à 18 tr/min pendant une heure à température ambiante sur un mélangeur rotatif. Placer le côté plat du tube contre l'aimant MP six et balancer doucement le tube pendant deux minutes sans retirer le tube de l'aimant. Garder le côté plat vers le haut et décanté le surnageant.

En prenant soin de ne pas perturber les billes retenues sur le côté plat du tube près de l'aimant. Retirer le tube échantillon de l'aimant et rincer le côté plat du tube trois fois avec 500 microlitres de tampon A en évitant les débris situés sur le côté arrondi du tube. Transférer chaque volume de rinçage dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre placé à l'intérieur d'un aimant MPCS.

Avec l'aimant en position verticale, fermez le tube et agitez doucement pendant une minute. Ensuite, avec l'aimant en place, aspirez le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur positionnée au fond du tube, puis ajoutez doucement un millilitre de PBS dans le tube.

Prenez soin de ne pas perturber le culot de billes. Fixez-vous à la paroi du tube adjacente à l'aimant. Retirez la bande magnétique et agitez doucement le tube jusqu'à ce que les billes soient remises en suspension.

Replacer la bande magnétique en position verticale. Agiter doucement le tube pendant une minute, puis aspirer le surnageant en éliminant autant que possible les débris sans perturber les billes. Après ce lavage, retirer l'aimant et ajouter 50 microlitres d'eau réactive directement sur la palette de billes.

Vortexez le tube à pleine vitesse pendant 50 secondes pour resuspendre les billes. Incubez ensuite l'échantillon à 80 degrés Celsius pendant 10 minutes, ce qui permet aux kystes de Giardia et aux kystes de cryptosporidium de se dissocier des billes. Après l'incubation, vortexez l'échantillon pendant 30 secondes. Placez ensuite la bande magnétique dans le MPCS en utilisant la position inclinée afin de séparer les billes des kystes et des O kystes en suspension.

Transférez le surnageant contenant les kystes et les O kystes vers une lame porte-cavité. Répétez une deuxième fois les étapes d'ajout d'eau, de vortex et de dissociation thermique, en ajoutant le surnageant à la même lame. Placez ensuite la lame sur un réchauffeur de lames à 37 degrés Celsius pour faire sécher la suspension.

Commencez par appliquer 50 microlitres de méthanol sur la lame afin de fixer l'échantillon, puis laissez sécher à température ambiante. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de solution DPI et incubez la lame pendant deux minutes à température ambiante. Pour colorer les noyaux, utilisez un essuie-tout Kim pour évacuer délicatement le DPI du puits en prenant soin de ne pas toucher le puits.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres de colorant facile à la préparation pour colorer la paroi cellulaire des kystes de Giardia et des kystes d'oocystes de Cryptosporidium. Incubez l'échantillon à 35 degrés Celsius pendant 30 minutes. Retirez le colorant à l’aide du chiffon Kim comme précédemment.

Ensuite, ajoutez lentement 300 microlitres de tampon de fixation easy stain froid en plaçant soigneusement la pointe de pipette à l'extérieur du puits et en laissant le liquide pénétrer dans le puits. Incubez la lame pendant deux minutes à température ambiante. Puis retirez le tampon à l’aide d’un essuie-tout kim et appliquez 10 microlitres de milieu de montage ; placez délicatement une lamelle sur l’échantillon, en éliminant toute bulle, puis scellez la lamelle avec du vernis à ongles transparent. À l’aide d’un microscope à fluorescence, examinez la lame avec un grossissement de 200 x à 1000 x et un filtre fse puis DPI à un grossissement de 200 x ; les kystes et les O kystes apparaissent comme des structures ovoïdes fluorescentes d’un vert pomme brillant, aux contours fortement marqués.

Les kystes de Cryptosporidium sont ronds et mesurent entre quatre et six micromètres. Les kystes de Giardia sont plus grands, avec une largeur de cinq à quinze micromètres et une longueur de huit à dix-huit micromètres, et peuvent être ronds ou ovoïdes à un grossissement de 1000 x. Grâce au filtre DPI, la structure interne des kystes et des CYS peut être mieux appréciée.

Généralement, jusqu'à quatre sporozoïtes, apparaissant comme des noyaux colorés en bleu ciel par la coloration DPI, sont visibles au sein des oocystes de *Cryptosporidium* et des kystes de *Giardia*. La microscopie en contraste interférentiel (DIC) peut également faciliter l'identification correcte des parasites, car d'autres caractéristiques morphologiques peuvent être observées. Les sporozoïtes de *Cryptosporidium* peuvent être visibles en DIC. Les kystes de *Giardia* présentent souvent une ou plusieurs structures internes nettement visibles, telles que des noyaux, des organites en forme de croissant appelés corps médians, et des structures flagellaires internes appelées axones.

Il est important de noter que la procédure de filtration ultrafine des fibres holo est capable de capturer plusieurs micro-organismes. En outre, d'autres tests de détection tels que la QPCR et le génotypage peuvent être appliqués aux échantillons concentrés, ce qui rend cette méthode plus souple et plus adaptable à vos applications. Merci d'avoir regardé et n'hésitez pas à nous faire part de vos questions.