Name: Cytométrie en flux à base de purification de S. cerevisiae Zygotes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 9 s
Description: Découvrez une méthode de cytométrie en flux pour purifier des zygotes de levure S. cerevisiae avec une pureté d'environ 90 %. Cette approche permet d'isoler des populations zygotiques hautement pures pour des études de biologie cellulaire et de génétique.

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Nous remercions le Dr R. Michael Sramkoski de l&#39;aide pour la cytométrie en flux, le Dr Purnima Jaiswal et le Dr Di Wu pour entrée tôt et Ilya Aylyarov de l&#39;aide pour les illustrations. Soutenu par des subventions du NIH R01GM089872 et la cytométrie &amp; Imaging Microscopy Facility base du Centre de cas Comprehensive Cancer (P30 CA43703).

1. La croissance des cellules haploïdes <ol><li> Cultivez S. cerevisiae S288C de l&#39;arrière-plan (BY4741) dans des conditions normales 10. </li><li> Transformez haploïdes pour exprimer l&#39;un des deux marqueurs fluorescents visibles 10. Les marqueurs de choix sont la GFP soluble exprimée dans le cytoplasme (pEG220, URA3/YIp, linéarisé avec BglII 11) et une seule protéine ribosomique, RPL25, fusionné avec mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, de A. Johnston). Nous nous attendons à ce que les protocoles de purification équivalent à deux couleurs pourrait utiliser d&#39;autres protéines fluorescentes vives qui sont synthétisées par les cellules haploïdes parentales. Alternativement, la paroi cellulaire pourrait être étiqueté avec des lectines fluorescentes. </li><li> Sur la purification zygote veille, inoculer 5 ml de cultures de chaque type de cellule et les cultiver sous agitation durant la nuit à 23 ° C pour atteindre A600 ne dépassant pas 1,0. Croître les transformants GFP (ATY4442) dans un milieu synthétique complet, y compris 2% de glucose (CSM-glucose) une-RPL25 mCherry transformants (ATY4552) en milieu sélectif dépourvu d&#39;uracile synthétique 10. Maintenir des cultures parallèles de chaque type de cellule sous agitation à la température ambiante. </li></ol> 2. Réalisation d&#39;une croix <ol><li> Régler la densité optique (A600) de chaque échantillon à 1,0 dans un milieu frais. [1 ~ unité de densité optique 3 x 10 7 cellules / ml] </li><li> Mélanger des volumes égaux des deux cultures, vortex brièvement 3 fois, suivies d&#39;une longue vortex pendant 10 sec. </li><li> Préparer CSM-glucose plaques. Les plaques sont identiques à ceux utilisés pour la croissance et la routine ont été séchés 45 min après la coulée et la solidification de la gélose 10. </li><li> Distribuer jusqu&#39;à vingt 40-ml gouttelettes du mélange 1 cm du bord de la surface de plaques CSM-glucose. Lorsque les gouttelettes sont tout d&#39;abord appliqué à la surface démarrer la minuterie pour mesurer le temps écoulé. Une fois que le liquide a été absorbé (environ 30 min), couvrir les plaques et les laisser reposer au rootempérature m. </li></ol> 3. Les préparatifs de récolte <ol><li> Après la récolte des échantillons de 1,75 à 2,5 heure à 23 ° C par des lavages répétés individuels gouttelettes séchées à l&#39;aide de la plaque 150 ml froid CSM-glucose, la tenue des plaques sur de la glace. Laver plusieurs fois le domaine des gouttelettes 10-20 fois avec le même milieu pour maximiser la récupération. Recueillir dans des tubes de 15 ml Falcon sur la glace. </li><li> Sonder soniquer les échantillons à une amplitude de 10x 60% avec un sonicateur Fisher FB120 (120Watt, 120Volt, Freq 20KHz) sur la glace. </li><li> Vérifiez dans un microscope à phase que les agrégats peu ou pas de rester. 15-50% des cellules sont censés avoir formé zygotes à ce stade. </li><li> Laisser le tube de cellules dans une position verticale au repos sur de la glace pendant 10 minutes comme précaution supplémentaire (pour permettre de régler les agrégats). </li><li> Récupérer la plus haute de 90% du volume et de la filtrer à travers un tamis en nylon (tube en polypropylène BD Falcon avec filtre bouchon (Ref 352235)). Dans une expérience typique, 10 7 cellulesrécupéré d&#39;une plaque étaient à ce point diluée dans 4 ml de CSM-glucose. </li></ol> 4. Cytométrie en flux <ol><li> Trier les cellules en utilisant le modèle Sony réflexion ICYT cytomètre de flux, (hautement automatisée Trier parallèle) HAPS1 avec une pointe de 100 microns. Pour l&#39;excitation GFP, utilisez le bleu argon-ion, 250 milliwatt laser à 488 nm. Pour l&#39;excitation mCherry, utilisez le laser de 100 milliwatts à 561 nm. Même si nous n&#39;avons pas d&#39;expérience avec d&#39;autres machines, nous nous attendons à ce que Becton Dickinson FACSAria, Becton Dickson Afflux ou Beckman Coulter MoFlo XDP serait bien s&#39;il est équipé des lasers appropriés. </li><li> Base de paramètres de tri sur un terrain de diffusion vers l&#39;avant vs rentré dans l&#39;ordre à la porte des cellules viables. Établir un complot émission de 615 + / - 30 passe-bande nm filtre (mCherry) par rapport à 525 + / - 25 passe-bande nm filtre (GFP) pour diviser les événements en quatre quadrants, &quot;rouge + vert-&quot;, &quot;rouge + vert +&quot;, &quot;rouge- Green-»et« Rouge-Vert + &quot;(figure S2). Utilisez cellules non fluorescentes comme une norme fou la détermination du &quot;Rouge-Vert-&quot; quadrant. </li><li> Trier les cellules avec une pression de 21,5 psi gaine, une fréquence goutte de 43.400 gouttes / s, et sous une pression de 20,5 psi échantillon. </li><li> Trier initiale (&quot;Recovery Mode&quot;): Prélever des échantillons dans des tubes Eppendorf réfrigérées contenant 250 ml d&#39;eau froide CSM-glucose. Sédiments 10 sec à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse réfrigérée (Tomy MRX-150, 15.000 tours par minute) et aspirer la solution de flux (solution gaine de cytométrie en flux (PBS avec 1 mM d&#39;EDTA) Catalogue BioSure N ° 1027). Remettre en suspension dans 500 ml froid CSM-glucose. </li><li> Trier seconde (mode &quot;Pureté&quot;): Réaliser le genre comme pour le tri initial, en utilisant le mode &quot;pureté&quot; option. Sédiments l&#39;. Cellules purifiées et remettre en suspension les culots dans 500 ml 1,0 ml CSM-glucose Agiter pendant 15 min dans des plaques 24 puits à 23 ° C pour permettre la récupération métabolique. </li></ol> 5. Microscopie DeltaVision <ol><li> Préparer tampons d&#39;agarose comme suit: Apportez une suspension de 1,5% d&#39;agarose (UltraPureAgarose, Invitrogen, catalogue 15510-07) in CSM-glucose à ébullition, homogénéiser brièvement au vortex, puis appliquez échantillons 0,3 ml de la solution d&#39;agarose à la surface des lames de verre horizontaux standard et les couvrir à la fois avec une deuxième lame (sans application d&#39;une pression). </li><li> Après refroidissement pendant 10 minutes, retirez délicatement le chariot supérieur en le faisant glisser horizontalement, en prenant soin de laisser une surface lisse et ne pas perturber la couche d&#39;agarose. (Lorsque le chariot supérieur a été retiré, l&#39;échantillon de cellules doit être appliqué dans les 1-2 min. Lorsqu&#39;il est conservé dans une chambre humide à température ambiante sans enlever le chariot supérieur, plaquettes peuvent être conservées pendant une journée avant de l&#39;utiliser.) </li><li> Des échantillons de sédiments et dépôt aliquotes de 1 ml de la pastille sur des patins d&#39;agarose (sans toucher la surface). Couvrir immédiatement l&#39;échantillon avec un carré n ° 1 lamelle. Coupez l&#39;excès d&#39;agarose avec une lame de rasoir à un seul tranchant. Sceller les préparations avec de la vaseline distribués à partir d&#39;une seringue. </li><li> Image à l&#39;aide Deltavision (Applied Precision) avec un objectif à immersion 100x sans binning (Olympus UPlanApo 100x/1.40; ∞ / 0.17/FN26.5). </li><li> Déconvolutionner z-piles en utilisant le programme Softworx 5.0.0 ( <a href="http://www.api.com/softworx.asp" target="_blank">http://www.api.com/softworx.asp</a> ) et de traiter de façon minimale. Successives z-plans sont généralement collectées à 0,2-0,4 microns intervalles. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Les niveaux d&#39;intensité de fluorescence dans les cellules haploïdes transformées: Le niveau de fluorescence dans les haploïdes est illustré à la Figure S1. Avant la croix, l&#39;examen épifluorescence démontré que pratiquement tous les transformants GFP étaient verts et que tous les transformants mCherry, bien que souvent plus faibles, étaient rouges. Afin de s&#39;assurer que toutes les cellules utilisées pour la croix étaient en effet fluorescent, nous avons utilisé la sous-population la plus brillante signal fluorescent. Rendement: Après le tri initial, le Rouge + Vert + échantillon (figure S2) comporte typiquement 8-20% du nombre de cellules d&#39;entrée et un nombre excessif de cellules haploïdes, peut-être en raison de la persistance adhésion cellule-cellule. Depuis fort enrichissement n&#39;est pas atteint d&#39;une sorte unique, l&#39;échantillon partiellement purifié la sonde doit être traité par ultrasons deux fois à une amplitude de 60% suivie de re-trier. (Sortes de récupération durent généralement entre 1-2 heures, tandis que le deuxième type ne nécessite que 15 min.) Sur les cellules soumises à la seconde espèce, les rouge + vert + échantillons inclus 23-52% des cellules d&#39;entrée. Examen microscopique phase: Examen par microscopie à contraste de phase a montré que la pureté de la préparation finale zygote en moyenne à environ 90% de plus de 21 préparations (allant de 86% à 91%). Les contaminants sont soit des haploïdes vertes ou rouges, ou de paires d&#39;haploïdes ayant été en contact avec l&#39;autre. Figure 3 pour cent de la dépouille qui ont zygotespas de bourgeon, bourgeons médians (Med), les bourgeons latéraux (Latitude) ou des bourgeons terminaux (Term), le nombre de paires haploïdes de la même couleur (&quot;2Same&quot;) ou de couleur différente (&quot;2Hap&quot;), ainsi que haploïdes individuels ( Hap). Lorsque les cellules ont été récoltées après 1,75 h, plus de 50% ont été unbudded et les autres sous-catégories (avec médial, des bourgeons latéraux ou terminaux) étaient également représentés. Après 2,5 h, il y avait à peu près autant de zygotes dans chacune des quatre catégories (unbudded, avec médial, des bourgeons latéraux ou terminaux). Observations microscopiques (figure 4): La structure de zygotes semble pas modifié lors de la purification. Selon la durée de la croix, la population avait des proportions différentes de zygotes unbudded et fleuri, comme expliqué ci-dessus. Puisque les haploïdes vert et rouge ont montré une variation considérable dans l&#39;intensité du signal fluorescent, certains étaient en majorité des zygotes rouge tandis que d&#39;autres étaient à prédominance verte, comme cela est observé par Comparing les images monochromes aux images combinées dans la figure 4. Notez également que la GFP (MW 26 kDa) pénètre dans le noyau et peut être trouvé dans le noyau, même lorsque les noyaux n&#39;ont pas fusionné. Vacuoles se démarquer en tant que noir non fluorescents sphères. Le produit final de purification donne une population diversifiée à différents stades de développement. Zygotes étiquetés Une fusion n&#39;ont pas subi. Type de zygotes B sont unbudded. Type C ont un petit bourgeon. Type D ont une plus grande bourgeon, et zygotes de type E sont sur le point de subir une cytokinèse. Notez également que la plupart des zygotes antérieures présentent encore une ligne non fluorescent division médiale (*), et que la «structure d&#39;héritage&quot; vacuolaire (I) 12 peuvent souvent être vus à s&#39;étendre à partir du zygote dans l&#39;œuf. Dans certains cas, le signal vert a redistribué dans le partenaire dans une mesure beaucoup plus grande que le signal rouge. Cela traduit le retard de transfert, qui est caractéristique des polysomes (Tartakoff, en préparation). 6 zygotes, ce qui est suffisant pour immunoblots nombreux, en utilisant les procédures de détection de chimioluminescence. En utilisant des protocoles d&#39;isolement au phénol-chloroforme on extrait environ 1,5 mg d&#39;ARN à partir de ce nombre de cellules. Depuis les zygotes purifiés ont été refroidie, avant de l&#39;analyser, nous recommandons d&#39;incubation à 23 ° C dans un milieu de croissance. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig1.jpg" /> Figure 1. Chronologie de la formation du zygote. Zygotes comme un intermédiaire entre les haploïdes et diploïdes. Ce diagramme montre l&#39;activation classique (shmooing) des haploïdes, leur fusion, et la formation de l&#39;œuf initial. Bourgeons peut être soit interne (M), latérale (L) ou le terminal (T). <imgalt = &quot;Figure 1&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4197/4197fig2.jpg&quot; /&gt; Figure 2. Schématique du protocole de purification zygote. Après incubation à la surface des plaques de gélose dans un milieu complet avec le glucose, le mélange de cellules est récupéré par lavage et ensuite soumis à un tri initial en mode &quot;récupération&quot; suivi d&#39;un second type de mode de pureté &quot;. &quot; La couleur jaune signifie que les deux mCherry et les signaux de GFP étaient visibles dans les zygotes. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig3.jpg" /> Figure 3. Variétés de zygotes dans les mélanges d&#39;accouplement purifiés fractions. Ont été récoltées après 1,75 ou 2,5 heures pour récupérer des fractions enrichies en zygotes relativement tôt par rapport relativement plus mature. Huit expériences indépendantes, désignées par les couleurs distinctes, ont été réalisées pour chaque point dans le temps. Les graphiques indiquent le nombre relatif de zygotes qui have spatialement modèles distincts de formation des bourgeons. Compte tenu de la courte durée de l&#39;incubation (moins de 2,5 h à température ambiante) tous les bourgeons initiaux observés sont zygotiques événements en herbe. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig4.jpg" /> Figure 4. DeltaVision examen de fractions enrichies. Un domaine typique a été examinée par microscopie Deltavision. Les illustrations montrent soit des couleurs rouges et vertes ou unique. Le rouge correspond à l&#39;étiquette polysomique (Rpl25p-mCherry) et le vert à la GFP cytosolique. Notez le fort enrichissement des zygotes et les caractéristiques subcellulaires désignés: les vacuoles (v), les bourgeons (b), le noyau (n), &quot;structure d&#39;héritage&quot; vacuolaire (i), et la partition (*) qui semble séparer l&#39;parentale domaines de zygotes relativement tôt. Leur couleur variable globale reflète l&#39;intensité relative des haploïdes qui fusionnés. Dans les cas où les deux domaines retiennent parentalesune couleur distincte, l&#39;équilibrage des marqueurs (GFP cytoplasmique, mCherry étiquetées polysomes) était incomplète. Time-lapse études en cours montrent que les redistribue GFP soluble avant polysomes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4197/4197fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . Legends supplémentaires <img alt="Figure S1" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS1.jpg" /> Figure S1. Fluorescence des cellules haploïdes Extrême gauche:. Cellules exprimant polysomes mCherry-marqués ont été examinés pour détecter un signal vert. La fenêtre rectangulaire a été créée pour éviter les cellules négatives. Graphique du milieu: Des cellules exprimant la GFP cytosolique ont été analysés, montrant la population nettement lumineux majeur de points positifs. Extrême droite: Les cellules exprimant polysomes mCherry-marqués ont été analysés. Le rectangle (identique à celle de l&#39;extrême gauche) comprend les plus brillants cellules et permet à tous lesnégatifs à éviter. La désignation «R2» indique le pourcentage de cellules récupérées dans le rectangle indiqué. <img alt="Figure S2" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS2.jpg" /> Figure S2. Répartition des cellules dans le tri premier et deuxième. Ces parcelles de deux couleurs indiquent la proportion de vert + rouge + cellules dans le quadrant supérieur droit (R5). Cette proportion augmente à 52% dans la seconde sorte. Axe horizontal: signal vert. Axe vertical: signal rouge.

<ol><li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHerskowitz%2C+I+%22Control+of+cell+type+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+Mating+type+and+mating-type+interconversion%22">Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion</a>. , Cold Spring Harbor Press. 181-210 (1981).</li>
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<li>Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+fusion+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).</li>
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<li>Ydenberg, C. A., Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mating%3A+a+model+system+for+studying+cell+and+nuclear+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion.</a> Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).</li>
<li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+mating+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synchronous mating in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).</li>
<li>Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+D+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Course+Manual%2C+2005+Edition%22">Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition</a>. , Cold Spring Harbor Press. (2005).</li>
<li>Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUS1+regulates+the+opening+and+expansion+of+fusion+pores+between+mating+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).</li>
<li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelles+on+the+move%3A+insights+from+yeast+vacuole+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La disponibilité des zygotes purifiés devrait faciliter les études biochimiques, y compris la transcriptomique, la protéomique et la lipidomique, ainsi que des enquêtes sur les mécanismes par lesquels les zygotes subissent cycle cellulaire rentrée, remodelage de la paroi cellulaire, caractéristiques en herbe et à l&#39;héritage, etc Alternativement, les zygotes pourraient être générés à partir avec des souches porteuses de mutations caractéristiques dans l&#39;un ou les deux parents. En outre, les zygotes purifiés, comm...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif / équipement </td><td> Source </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, codant pour la GFP cytoplasmique 11) </td><td> E. Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, l&#39;encodage RPL25 fusionnée à mCherry </td><td> A. Johnston </td><td></td></tr><tr><td> Fisher FB120 sonicateur </td><td> Fisher Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Tube en polypropylène avec couvercle passoire </td><td> BD Falcon </td><td> Ref 352235 </td></tr><tr><td> Microcentrifugeuse réfrigérée </td><td> Tomy </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> Solution gaine cytométrie en flux </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> Réflexion ICYT Modèle cytomètre de flux </td><td> Sony </td><td></td></tr><tr><td> Microscope déconvolution DeltaVision </td><td> Applied Precision </td><td></td></tr><tr><td> Microscope droit à épifluorescence </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-07 </td></tr><tr><td> Formulation de glucose CSM Notes: Pour les plaques d&#39;agar agar, il suffit d&#39;inclure 2% (Difco) </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

cytométrie en flux à base de purification de<em&gt; s. cerevisiae</em&gt; zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes sont des intermédiaires essentiels entre les haploïdes et diploïdes états du cycle de vie de nombreux organismes, y compris la levure (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes résultat de la fusion de cellules haploïdes de type sexuel distinct (MATa, MATalpha) et donner lieu à des correspondants diploïdes stables qui génèrent successivement jusqu&#39;à 20 descendance diploïde en raison de leurs divisions mitotiques étonnamment asymétriques 2. Formation Zygote est orchestré par une séquence complexe d&#39;événements: Dans ce processus, les facteurs d&#39;accouplement solubles se lient aux récepteurs apparenté, déclenchant médiés par le récepteur cascades de signalisation qui facilitent l&#39;interruption du cycle cellulaire et aboutir à fusion cellule-cellule. Zygotes peut être considéré comme un modèle pour les progéniteurs ou de la fonction des cellules souches. Même si on a beaucoup appris à propos de la formation des zygotes et bien zygotes ont été utilisés pour étudier les cellules moléculaires des questions d&#39;intérêt général Significance, presque toutes les études ont eu recours à des mélanges d&#39;accouplement dans laquelle sont mélangés des zygotes avec une majorité de la population de cellules haploïdes 3-8. De nombreux aspects de la biochimie de la formation du zygote et la vie continue du zygote restent donc d&#39;une enquête. Rapports de purification des zygotes levure décrire les protocoles basés sur leurs propriétés de sédimentation 9; toutefois, cette procédure basée sur la sédimentation n&#39;a pas donné près de 90% de pureté dans nos mains. En outre, elle présente l&#39;inconvénient que les cellules sont exposées au sorbitol hypertonique. Nous avons donc mis au point un procédé de purification polyvalente. A cet effet, des paires de cellules haploïdes exprimant rouges ou verts protéines fluorescentes ont été co-incubées pour permettre la formation du zygote, récoltées à des moments différents, et les zygotes obtenus ont été purifiés en utilisant un protocole de triage par cytométrie de flux à base de. Cette technique permet une évaluation visuelle pratique de la pureté et de la maturation. La pureté moyennede la fraction est d&#39;environ 90%. Selon le moment de la récolte, les zygotes de différents degrés de maturité peut être récupéré. Les échantillons purifiés fournir un point de départ commode pour les «-omiques» des études, pour la récupération de la descendance initiale, et une enquête systématique de cette cellule souche.

Pour purifier les zygotes de<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;, Les cellules haploïdes de type sexuel opposé ont été modifiées pour exprimer rouges ou verts protéines fluorescentes, co-incubées pour permettre la formation du zygote, et fractionnés en utilisant une cytométrie de flux à base de protocole. La fraction hautement enrichi permet ultérieur &quot;-omiques», les études, la reprise de la descendance initiale, et l&#39;investigation systématique de la morphogenèse zygote.

Cytométrie en flux à base de purification de<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Les zygotes sont des intermédiaires essentiels entre les états haploïde et diploïde dans le cycle de vie de nombreux organismes, dont la levure (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de générer une population purifiée de zygotes de levure. Cela est réalisé en exprimant d'abord une GFP cytoplasmique ou des polyzines marquées M cherry. Dans des cellules haploïdes de type de conjugaison opposé, les cellules sont cultivées jusqu'à la phase logarithmique, puis combinées et co-incubées pour permettre la formation de zygotes.Le mélange de croisement est ensuite récolté et trié par cytométrie en flux en mode récupération afin d'isoler les cellules doublement positives rouge et vert. Cette sous-population comprend à la fois des entités pré-zygotiques et zygotiques. Pour purifier davantage l'échantillon, la population doublement positive rouge et vert est soumise à un deuxième cycle de tri en cytométrie en flux.Utilisation du mode de pureté. Cette procédure permet d'obtenir une pureté moyenne de 90 % de zygotes, selon l'examen visuel et la quantification des cellules par microscopie fluorescente. Les avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la purification par sédimentation, sont les suivants.Tout d'abord, cette technique permet une évaluation visuelle pratique de la pureté et de la maturation des zygotes. Deuxièmement, selon nos observations, la pureté moyenne de la fraction zygotique est d'environ 90 %, bien plus élevée que celle des méthodes existantes. Notre méthode de purification peut aider à répondre à des questions biologiques fondamentales concernant la transition haploïde à diploïde chez les cellules eucaryotes au niveau moléculaire, car il existe une conservation considérable entre les eucaryotes inférieurs et supérieurs.Par conséquent, l'étude des zygotes de levure devrait favoriser une compréhension générale de la biologie des zygotes. On peut soutenir que les zygotes peuvent également être considérés comme un modèle pour la fonction des cellules progénitrices ou souches. Cultivez s. cere, VCA, Matt A et Matt alpha BY 47 41. Isolez les cellules en étalant des stocks congelés de levure sur un milieu de croissance solide contenant de l'agar, puis incubez les boîtes à température ambiante ou à 30 degrés Celsius jusqu'à l'apparition de colonies, la veille de la purification des zygotes. Étiquetez deux tubes coniques de 50 millilitres destinés à la culture de tabloïdes transformés, respectivement avec GFP soluble et RPL 25 M.Cherry. Inoculez une culture avec des tabloïdes transformés exprimant GFP soluble dans le cytoplasme, et une autre avec des tabloïdes transformés exprimant une protéine ribosomale unique.RPL 25 fusionné avec mCherry. Faire croître les cultures avec agitation pendant la nuit à 23 degrés Celsius afin d'atteindre une DO600 n'excédant pas 1,0. Pour réaliser un croisement, commencer par ajuster la densité optique de chaque échantillon à 1,0 dans du milieu frais, correspondant approximativement à trois fois 107 cellules par millilitre.Ensuite, mélanger des volumes égaux des deux cultures dans un milieu frais, dans un tube conique de 50 millilitres. Agiter brièvement trois fois, puis agiter pendant 10 secondes. Placer une fois la pointe d'une pipette à un centimètre au-dessus de la surface d'une pièce.Pétrifilm au glucose CSM à température contrôlée. Déclencher un chronomètre comptant à rebours à partir de 30 minutes et distribuer immédiatement des gouttes de 40 microlitres du mélange de cultures le long de la périphérie de la boîte, réparties sur toute la circonférence. Laisser sécher les boîtes sur le plan de travail, couvercle retiré, pendant environ 30 minutes.Une fois que le liquide a été absorbé, couvrez les boîtes et laissez-les en paix à température ambiante pendant 1,75 à 2,5 heures. Le processus de croissance polarisée crée la morphologie caractéristique en « schmo ». Pendant la phase en « schmo », les deux cellules haid continuent de croître l'une vers l'autre jusqu'à établir un contact cellule-cellule.La fusion ultérieure des cellules conduit à la formation du zygote. Le zygote naissant réentre alors dans le cycle cellulaire mitotique, donnant naissance à son premier bourgeon diploïde. Après l'incubation, placez les boîtes sur de la glace et récoltez les échantillons en lavant individuellement les zones des gouttelettes séchées de 10 à 20 fois avec 150 microlitres de glucose CSM froid.Recueillir la solution de lavage dans des tubes coniques de 15 millilitres sur glace. Ensuite, en maintenant les échantillons sur glace, soniquer chaque tube par sonde 10 fois à une amplitude de 60 %. Après la sonication, vérifier au microscope à contraste de phase qu’il reste peu ou pas d’agrégats ; on s’attend à ce que 15 à 50 % des cellules aient formé des zygotes. À ce stade, laisser le tube de cellules en position verticale, sans perturbation, sur glace pendant 10 minutes, par précaution, afin de permettre à d’éventuels agrégats restants de sedimenter.Récupérez les 90 % supérieurs du volume et filtrez-les à travers un tube en polypropylène à maille en nylon muni d'un bouchon tamis. Dans une expérience typique, on récupère 10 puissance sept cellules à partir d'une plaque et de quatre millilitres de CSM. Le tri des cellules selon le glucose est effectué à l'aide d'un cytomètre en flux Sony Eyesight Reflection muni d'un HAPS doté d'une buse de 100 microns.Commencez par sélectionner les lasers d'excitation dans le logiciel win list 3D pour l'excitation de la GFP. Utilisez le laser bleu à ion Argon de 500 milliwatts à 488 nanomètres pour l'excitation de la M-cherry. Utilisez le laser de 100 milliwatts à 561 nanomètres dans le logiciel de contrôle HAPS.Veillez à ce que le mode de récupération soit sélectionné et que la pression de gaine pour le tri soit réglée à 21,5 livres par pouce carré, avec une fréquence de gouttelettes de 43 400 gouttelettes par seconde et une pression d'échantillon de 20,5 livres par pouce carré. Basez les paramètres de tri sur un graphique de diffusion avant versus diffusion arrière afin de sélectionner les cellules viables. Notez que l'appareil Sony Iysight utilisé ici indique de manière unique le graphique de diffusion latérale comme diffusion arrière, mais cette diffusion arrière est fonctionnellement équivalente à la diffusion latérale. Établissez un graphique d'émission de M cherry versus GFP afin de répartir les événements en quatre quadrants.Rouge, vert positif, rouge négatif, vert positif, rouge positif, vert négatif et rouge négatif, vert positif. Utilisez des cellules non fluorescentes comme standard pour la détermination du quadrant rouge négatif vert négatif. Pour le tri initial.Sélectionnez le mode de récupération et collectez les échantillons dans des tubes de microcentrifugeuse refroidis contenant 250 millilitres de glucose CSM froid. Après la collecte, faites sédimenter les cellules pendant 10 secondes à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse réfrigérée ; après la centrifugation, aspirez la solution d'écoulement et resuspendez-les dans 500 microlitres de glucose CSM froid.Étant donné qu'un enrichissement élevé n'est pas obtenu avec un seul tri, soniquer brièvement l'échantillon partiellement purifié deux fois à une amplitude de 60 %. Trier à nouveau les cellules, cette fois en utilisant l'option de mode pureté en ciblant les cellules viables, puis établir un graphique d'émission de M-cherry en fonction de la sédimentation de la GFP, des cellules purifiées, et resuspendre les culots dans 0,5 à 1,0 millilitre de CSM glucose. Après la centrifugation, transférer 0,5 millilitre dans chaque puits de plaques à 24 puits, puis agiter les cellules pendant 15 minutes.Dans des plaques de 24 puits à 23 degrés Celsius pour permettre une récupération métabolique. Pour préparer les pastilles d'agarose, porter à ébullition une suspension d'agarose à 1,5 % dans du milieu CSM glucose dans un tube conique de 15 millilitres. Vortexer brièvement la solution, puis appliquer des échantillons de 0,3 millilitre de la solution d'agarose sur la surface d'au moins deux à trois lames de verre standard, puis recouvrir immédiatement les lames avec une seconde lame.Ne pas appliquer de pression. Laisser refroidir les lames pendant 10 minutes. Si les tampons aros ne doivent pas être utilisés immédiatement, les placer dans une chambre humidifiée à température ambiante sans retirer la lame supérieure.Ils peuvent être conservés jusqu'à un jour. Ensuite, retirer délicatement la lame supérieure en la faisant glisser horizontalement. Veiller à laisser une surface lisse et à ne pas perturber la couche d'aros ; déposer rapidement, en l'espace d'une à deux minutes, des aliquotes d'un microlitre de cellules sedimentées sur les pastilles d'aros sans toucher la surface.Couvrez immédiatement l'échantillon avec une lame carrée de couverture et taillez l'excédent à l'aide d'une lame de rasoir à bord unique. Utilisez une seringue pour appliquer de la vaseline le long des bords de la lame de couverture afin de sceller l'échantillon. Capturez les images à l'aide du système Delta Vision équipé d'un objectif à immersion huile 100x, sans binning. Un champ idéal présente une monocouche de cellules avec suffisamment d'espace entre elles pour distinguer clairement chaque cellule. Acquérez des images selon des intervalles de 0,2 à 0,4 micron. Une fois l'acquisition terminée,Analyser les Zacks à l'aide du programme Soft Works 5.0 0.0 et traiter de manière minimale avec une déconvolution standard de 20 cycles. Ajuster l'intensité de la fluorescence rouge par rapport à la verte afin de minimiser tout signal de fond dans les images DeVol pour évaluer l'expression des protéines fluorescentes dans les cellules transformées. Les cellules ont été analysées par cytométrie en flux avant et après réalisation d'un croisement, préalablement au croisement. Essentiellement, tous les transformants M cherry étaient rouges et tous les transformants GFP étaient verts.Remarquez que, bien que le signal M cherry soit moins intense que le signal GFP, il a été détecté par cytométrie et par microscopie à fluorescence. Les cellules ont été triées et les cellules les plus brillantes, qui apparaissent dans le quadrant R deux, ont été sélectionnées et mises en culture avec la transformation GFP pendant 2,5 heures, comme on peut le voir ici. L'échantillon positif rouge et vert représentait 8,89 % de la population totale après le croisement.Cela a été enrichi à 52,4 % après le premier tri de récupération, puis davantage enrichi lors du second tri de pureté, lorsque 21 préparations similaires de cellules rouges positives et vertes positives ont été examinées par microscopie en contraste de phase. Pour évaluer le nombre de zygotes, la pureté moyenne était de 90 %. Les contaminants étaient soit des haploïdes verts ou rouges, soit des paires d’haploïdes en contact, afin de déterminer la cinétique de l’émergence initiale des bourgeons zygotiques, ainsi que la fréquence et la répartition des positions médiane, latérale et terminale des bourgeons zygotiques. Les haploïdes ont été croisés pendant 1,75 heure ou 2,5 heures, triés par cytométrie en flux, puis examinés par microscopie épifluorescente.Lorsque les cellules ont été récoltées après 1,75 heure, plus de 50 % étaient non germées et médiales. Les bourgeons latéraux ou terminaux étaient également représentés après 2,5 heures. Cependant, il y avait approximativement un nombre égal de zygotes dans chacune des quatre catégories : non germés avec des bourgeons médiaux, latéraux ou terminaux.La structure des zygotes semble rester inchangée pendant la purification. Remarquez que la GFP pénètre dans le noyau et peut être détectée dans le noyau même lorsque les noyaux ne se sont pas encore fusionnés. Les ES se distinguent comme des sphères noires non fluorescentes.Le produit final de la purification donne une population hétérogène à divers stades de développement. Les zygotes désignés A n'ont pas subi de fusion. Les zygotes de type B ne sont pas fécondés.Les types C présentent un petit bourgeon, les types D un bourgeon plus grand, et les zygotes de type E sont sur le point de subir la cytocinèse ; notez également que de nombreux zygotes précoces exhibent encore une ligne de division médiane non fluorescente et que la structure d'héritage valar peut souvent être observée s'étendant du zygote vers le bourgeon. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'inclure à la fois le tri de récupération et le tri de pureté ultérieur. Nous avons constaté que le second tri est essentiel pour augmenter la pureté des zygotes dans le produit final.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer un croisement, de générer des zygotes purifiés par cytométrie en flux, d'évaluer la pureté par des méthodes microscopiques, ainsi que de monter et de photographier les zygotes à l'aide d'une microscopie fluorescente par déconvolution.

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