Name: Cytométrie en flux à base de purification de S. cerevisiae Zygotes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 9 s
Description: Découvrez une méthode de cytométrie en flux pour purifier des zygotes de levure S. cerevisiae avec une pureté d'environ 90 %. Cette approche permet d'isoler des populations zygotiques hautement pures pour des études de biologie cellulaire et de génétique.

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Nous remercions le Dr R. Michael Sramkoski de l&#39;aide pour la cytométrie en flux, le Dr Purnima Jaiswal et le Dr Di Wu pour entrée tôt et Ilya Aylyarov de l&#39;aide pour les illustrations. Soutenu par des subventions du NIH R01GM089872 et la cytométrie &amp; Imaging Microscopy Facility base du Centre de cas Comprehensive Cancer (P30 CA43703).

1. La croissance des cellules haploïdes <ol><li> Cultivez S. cerevisiae S288C de l&#39;arrière-plan (BY4741) dans des conditions normales 10. </li><li> Transformez haploïdes pour exprimer l&#39;un des deux marqueurs fluorescents visibles 10. Les marqueurs de choix sont la GFP soluble exprimée dans le cytoplasme (pEG220, URA3/YIp, linéarisé avec BglII 11) et une seule protéine ribosomique, RPL25, fusionné avec mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, de A. Johnston). Nous nous attendons à ce que les protocoles de purification équivalent à deux couleurs pourrait utiliser d&#39;autres protéines fluorescentes vives qui sont synthétisées par les cellules haploïdes parentales. Alternativement, la paroi cellulaire pourrait être étiqueté avec des lectines fluorescentes. </li><li> Sur la purification zygote veille, inoculer 5 ml de cultures de chaque type de cellule et les cultiver sous agitation durant la nuit à 23 ° C pour atteindre A600 ne dépassant pas 1,0. Croître les transformants GFP (ATY4442) dans un milieu synthétique complet, y compris 2% de glucose (CSM-glucose) une-RPL25 mCherry transformants (ATY4552) en milieu sélectif dépourvu d&#39;uracile synthétique 10. Maintenir des cultures parallèles de chaque type de cellule sous agitation à la température ambiante. </li></ol> 2. Réalisation d&#39;une croix <ol><li> Régler la densité optique (A600) de chaque échantillon à 1,0 dans un milieu frais. [1 ~ unité de densité optique 3 x 10 7 cellules / ml] </li><li> Mélanger des volumes égaux des deux cultures, vortex brièvement 3 fois, suivies d&#39;une longue vortex pendant 10 sec. </li><li> Préparer CSM-glucose plaques. Les plaques sont identiques à ceux utilisés pour la croissance et la routine ont été séchés 45 min après la coulée et la solidification de la gélose 10. </li><li> Distribuer jusqu&#39;à vingt 40-ml gouttelettes du mélange 1 cm du bord de la surface de plaques CSM-glucose. Lorsque les gouttelettes sont tout d&#39;abord appliqué à la surface démarrer la minuterie pour mesurer le temps écoulé. Une fois que le liquide a été absorbé (environ 30 min), couvrir les plaques et les laisser reposer au rootempérature m. </li></ol> 3. Les préparatifs de récolte <ol><li> Après la récolte des échantillons de 1,75 à 2,5 heure à 23 ° C par des lavages répétés individuels gouttelettes séchées à l&#39;aide de la plaque 150 ml froid CSM-glucose, la tenue des plaques sur de la glace. Laver plusieurs fois le domaine des gouttelettes 10-20 fois avec le même milieu pour maximiser la récupération. Recueillir dans des tubes de 15 ml Falcon sur la glace. </li><li> Sonder soniquer les échantillons à une amplitude de 10x 60% avec un sonicateur Fisher FB120 (120Watt, 120Volt, Freq 20KHz) sur la glace. </li><li> Vérifiez dans un microscope à phase que les agrégats peu ou pas de rester. 15-50% des cellules sont censés avoir formé zygotes à ce stade. </li><li> Laisser le tube de cellules dans une position verticale au repos sur de la glace pendant 10 minutes comme précaution supplémentaire (pour permettre de régler les agrégats). </li><li> Récupérer la plus haute de 90% du volume et de la filtrer à travers un tamis en nylon (tube en polypropylène BD Falcon avec filtre bouchon (Ref 352235)). Dans une expérience typique, 10 7 cellulesrécupéré d&#39;une plaque étaient à ce point diluée dans 4 ml de CSM-glucose. </li></ol> 4. Cytométrie en flux <ol><li> Trier les cellules en utilisant le modèle Sony réflexion ICYT cytomètre de flux, (hautement automatisée Trier parallèle) HAPS1 avec une pointe de 100 microns. Pour l&#39;excitation GFP, utilisez le bleu argon-ion, 250 milliwatt laser à 488 nm. Pour l&#39;excitation mCherry, utilisez le laser de 100 milliwatts à 561 nm. Même si nous n&#39;avons pas d&#39;expérience avec d&#39;autres machines, nous nous attendons à ce que Becton Dickinson FACSAria, Becton Dickson Afflux ou Beckman Coulter MoFlo XDP serait bien s&#39;il est équipé des lasers appropriés. </li><li> Base de paramètres de tri sur un terrain de diffusion vers l&#39;avant vs rentré dans l&#39;ordre à la porte des cellules viables. Établir un complot émission de 615 + / - 30 passe-bande nm filtre (mCherry) par rapport à 525 + / - 25 passe-bande nm filtre (GFP) pour diviser les événements en quatre quadrants, &quot;rouge + vert-&quot;, &quot;rouge + vert +&quot;, &quot;rouge- Green-»et« Rouge-Vert + &quot;(figure S2). Utilisez cellules non fluorescentes comme une norme fou la détermination du &quot;Rouge-Vert-&quot; quadrant. </li><li> Trier les cellules avec une pression de 21,5 psi gaine, une fréquence goutte de 43.400 gouttes / s, et sous une pression de 20,5 psi échantillon. </li><li> Trier initiale (&quot;Recovery Mode&quot;): Prélever des échantillons dans des tubes Eppendorf réfrigérées contenant 250 ml d&#39;eau froide CSM-glucose. Sédiments 10 sec à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse réfrigérée (Tomy MRX-150, 15.000 tours par minute) et aspirer la solution de flux (solution gaine de cytométrie en flux (PBS avec 1 mM d&#39;EDTA) Catalogue BioSure N ° 1027). Remettre en suspension dans 500 ml froid CSM-glucose. </li><li> Trier seconde (mode &quot;Pureté&quot;): Réaliser le genre comme pour le tri initial, en utilisant le mode &quot;pureté&quot; option. Sédiments l&#39;. Cellules purifiées et remettre en suspension les culots dans 500 ml 1,0 ml CSM-glucose Agiter pendant 15 min dans des plaques 24 puits à 23 ° C pour permettre la récupération métabolique. </li></ol> 5. Microscopie DeltaVision <ol><li> Préparer tampons d&#39;agarose comme suit: Apportez une suspension de 1,5% d&#39;agarose (UltraPureAgarose, Invitrogen, catalogue 15510-07) in CSM-glucose à ébullition, homogénéiser brièvement au vortex, puis appliquez échantillons 0,3 ml de la solution d&#39;agarose à la surface des lames de verre horizontaux standard et les couvrir à la fois avec une deuxième lame (sans application d&#39;une pression). </li><li> Après refroidissement pendant 10 minutes, retirez délicatement le chariot supérieur en le faisant glisser horizontalement, en prenant soin de laisser une surface lisse et ne pas perturber la couche d&#39;agarose. (Lorsque le chariot supérieur a été retiré, l&#39;échantillon de cellules doit être appliqué dans les 1-2 min. Lorsqu&#39;il est conservé dans une chambre humide à température ambiante sans enlever le chariot supérieur, plaquettes peuvent être conservées pendant une journée avant de l&#39;utiliser.) </li><li> Des échantillons de sédiments et dépôt aliquotes de 1 ml de la pastille sur des patins d&#39;agarose (sans toucher la surface). Couvrir immédiatement l&#39;échantillon avec un carré n ° 1 lamelle. Coupez l&#39;excès d&#39;agarose avec une lame de rasoir à un seul tranchant. Sceller les préparations avec de la vaseline distribués à partir d&#39;une seringue. </li><li> Image à l&#39;aide Deltavision (Applied Precision) avec un objectif à immersion 100x sans binning (Olympus UPlanApo 100x/1.40; ∞ / 0.17/FN26.5). </li><li> Déconvolutionner z-piles en utilisant le programme Softworx 5.0.0 ( <a href="http://www.api.com/softworx.asp" target="_blank">http://www.api.com/softworx.asp</a> ) et de traiter de façon minimale. Successives z-plans sont généralement collectées à 0,2-0,4 microns intervalles. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Les niveaux d&#39;intensité de fluorescence dans les cellules haploïdes transformées: Le niveau de fluorescence dans les haploïdes est illustré à la Figure S1. Avant la croix, l&#39;examen épifluorescence démontré que pratiquement tous les transformants GFP étaient verts et que tous les transformants mCherry, bien que souvent plus faibles, étaient rouges. Afin de s&#39;assurer que toutes les cellules utilisées pour la croix étaient en effet fluorescent, nous avons utilisé la sous-population la plus brillante signal fluorescent. Rendement: Après le tri initial, le Rouge + Vert + échantillon (figure S2) comporte typiquement 8-20% du nombre de cellules d&#39;entrée et un nombre excessif de cellules haploïdes, peut-être en raison de la persistance adhésion cellule-cellule. Depuis fort enrichissement n&#39;est pas atteint d&#39;une sorte unique, l&#39;échantillon partiellement purifié la sonde doit être traité par ultrasons deux fois à une amplitude de 60% suivie de re-trier. (Sortes de récupération durent généralement entre 1-2 heures, tandis que le deuxième type ne nécessite que 15 min.) Sur les cellules soumises à la seconde espèce, les rouge + vert + échantillons inclus 23-52% des cellules d&#39;entrée. Examen microscopique phase: Examen par microscopie à contraste de phase a montré que la pureté de la préparation finale zygote en moyenne à environ 90% de plus de 21 préparations (allant de 86% à 91%). Les contaminants sont soit des haploïdes vertes ou rouges, ou de paires d&#39;haploïdes ayant été en contact avec l&#39;autre. Figure 3 pour cent de la dépouille qui ont zygotespas de bourgeon, bourgeons médians (Med), les bourgeons latéraux (Latitude) ou des bourgeons terminaux (Term), le nombre de paires haploïdes de la même couleur (&quot;2Same&quot;) ou de couleur différente (&quot;2Hap&quot;), ainsi que haploïdes individuels ( Hap). Lorsque les cellules ont été récoltées après 1,75 h, plus de 50% ont été unbudded et les autres sous-catégories (avec médial, des bourgeons latéraux ou terminaux) étaient également représentés. Après 2,5 h, il y avait à peu près autant de zygotes dans chacune des quatre catégories (unbudded, avec médial, des bourgeons latéraux ou terminaux). Observations microscopiques (figure 4): La structure de zygotes semble pas modifié lors de la purification. Selon la durée de la croix, la population avait des proportions différentes de zygotes unbudded et fleuri, comme expliqué ci-dessus. Puisque les haploïdes vert et rouge ont montré une variation considérable dans l&#39;intensité du signal fluorescent, certains étaient en majorité des zygotes rouge tandis que d&#39;autres étaient à prédominance verte, comme cela est observé par Comparing les images monochromes aux images combinées dans la figure 4. Notez également que la GFP (MW 26 kDa) pénètre dans le noyau et peut être trouvé dans le noyau, même lorsque les noyaux n&#39;ont pas fusionné. Vacuoles se démarquer en tant que noir non fluorescents sphères. Le produit final de purification donne une population diversifiée à différents stades de développement. Zygotes étiquetés Une fusion n&#39;ont pas subi. Type de zygotes B sont unbudded. Type C ont un petit bourgeon. Type D ont une plus grande bourgeon, et zygotes de type E sont sur le point de subir une cytokinèse. Notez également que la plupart des zygotes antérieures présentent encore une ligne non fluorescent division médiale (*), et que la «structure d&#39;héritage&quot; vacuolaire (I) 12 peuvent souvent être vus à s&#39;étendre à partir du zygote dans l&#39;œuf. Dans certains cas, le signal vert a redistribué dans le partenaire dans une mesure beaucoup plus grande que le signal rouge. Cela traduit le retard de transfert, qui est caractéristique des polysomes (Tartakoff, en préparation). 6 zygotes, ce qui est suffisant pour immunoblots nombreux, en utilisant les procédures de détection de chimioluminescence. En utilisant des protocoles d&#39;isolement au phénol-chloroforme on extrait environ 1,5 mg d&#39;ARN à partir de ce nombre de cellules. Depuis les zygotes purifiés ont été refroidie, avant de l&#39;analyser, nous recommandons d&#39;incubation à 23 ° C dans un milieu de croissance. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig1.jpg" /> Figure 1. Chronologie de la formation du zygote. Zygotes comme un intermédiaire entre les haploïdes et diploïdes. Ce diagramme montre l&#39;activation classique (shmooing) des haploïdes, leur fusion, et la formation de l&#39;œuf initial. Bourgeons peut être soit interne (M), latérale (L) ou le terminal (T). <imgalt = &quot;Figure 1&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4197/4197fig2.jpg&quot; /&gt; Figure 2. Schématique du protocole de purification zygote. Après incubation à la surface des plaques de gélose dans un milieu complet avec le glucose, le mélange de cellules est récupéré par lavage et ensuite soumis à un tri initial en mode &quot;récupération&quot; suivi d&#39;un second type de mode de pureté &quot;. &quot; La couleur jaune signifie que les deux mCherry et les signaux de GFP étaient visibles dans les zygotes. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig3.jpg" /> Figure 3. Variétés de zygotes dans les mélanges d&#39;accouplement purifiés fractions. Ont été récoltées après 1,75 ou 2,5 heures pour récupérer des fractions enrichies en zygotes relativement tôt par rapport relativement plus mature. Huit expériences indépendantes, désignées par les couleurs distinctes, ont été réalisées pour chaque point dans le temps. Les graphiques indiquent le nombre relatif de zygotes qui have spatialement modèles distincts de formation des bourgeons. Compte tenu de la courte durée de l&#39;incubation (moins de 2,5 h à température ambiante) tous les bourgeons initiaux observés sont zygotiques événements en herbe. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig4.jpg" /> Figure 4. DeltaVision examen de fractions enrichies. Un domaine typique a été examinée par microscopie Deltavision. Les illustrations montrent soit des couleurs rouges et vertes ou unique. Le rouge correspond à l&#39;étiquette polysomique (Rpl25p-mCherry) et le vert à la GFP cytosolique. Notez le fort enrichissement des zygotes et les caractéristiques subcellulaires désignés: les vacuoles (v), les bourgeons (b), le noyau (n), &quot;structure d&#39;héritage&quot; vacuolaire (i), et la partition (*) qui semble séparer l&#39;parentale domaines de zygotes relativement tôt. Leur couleur variable globale reflète l&#39;intensité relative des haploïdes qui fusionnés. Dans les cas où les deux domaines retiennent parentalesune couleur distincte, l&#39;équilibrage des marqueurs (GFP cytoplasmique, mCherry étiquetées polysomes) était incomplète. Time-lapse études en cours montrent que les redistribue GFP soluble avant polysomes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4197/4197fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . Legends supplémentaires <img alt="Figure S1" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS1.jpg" /> Figure S1. Fluorescence des cellules haploïdes Extrême gauche:. Cellules exprimant polysomes mCherry-marqués ont été examinés pour détecter un signal vert. La fenêtre rectangulaire a été créée pour éviter les cellules négatives. Graphique du milieu: Des cellules exprimant la GFP cytosolique ont été analysés, montrant la population nettement lumineux majeur de points positifs. Extrême droite: Les cellules exprimant polysomes mCherry-marqués ont été analysés. Le rectangle (identique à celle de l&#39;extrême gauche) comprend les plus brillants cellules et permet à tous lesnégatifs à éviter. La désignation «R2» indique le pourcentage de cellules récupérées dans le rectangle indiqué. <img alt="Figure S2" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS2.jpg" /> Figure S2. Répartition des cellules dans le tri premier et deuxième. Ces parcelles de deux couleurs indiquent la proportion de vert + rouge + cellules dans le quadrant supérieur droit (R5). Cette proportion augmente à 52% dans la seconde sorte. Axe horizontal: signal vert. Axe vertical: signal rouge.

<ol><li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHerskowitz%2C+I+%22Control+of+cell+type+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+Mating+type+and+mating-type+interconversion%22">Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion</a>. , Cold Spring Harbor Press. 181-210 (1981).</li>
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<li>Ydenberg, C. A., Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mating%3A+a+model+system+for+studying+cell+and+nuclear+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion.</a> Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).</li>
<li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+mating+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synchronous mating in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).</li>
<li>Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+D+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Course+Manual%2C+2005+Edition%22">Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition</a>. , Cold Spring Harbor Press. (2005).</li>
<li>Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUS1+regulates+the+opening+and+expansion+of+fusion+pores+between+mating+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).</li>
<li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelles+on+the+move%3A+insights+from+yeast+vacuole+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La disponibilité des zygotes purifiés devrait faciliter les études biochimiques, y compris la transcriptomique, la protéomique et la lipidomique, ainsi que des enquêtes sur les mécanismes par lesquels les zygotes subissent cycle cellulaire rentrée, remodelage de la paroi cellulaire, caractéristiques en herbe et à l&#39;héritage, etc Alternativement, les zygotes pourraient être générés à partir avec des souches porteuses de mutations caractéristiques dans l&#39;un ou les deux parents. En outre, les zygotes purifiés, comm...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif / équipement </td><td> Source </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, codant pour la GFP cytoplasmique 11) </td><td> E. Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, l&#39;encodage RPL25 fusionnée à mCherry </td><td> A. Johnston </td><td></td></tr><tr><td> Fisher FB120 sonicateur </td><td> Fisher Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Tube en polypropylène avec couvercle passoire </td><td> BD Falcon </td><td> Ref 352235 </td></tr><tr><td> Microcentrifugeuse réfrigérée </td><td> Tomy </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> Solution gaine cytométrie en flux </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> Réflexion ICYT Modèle cytomètre de flux </td><td> Sony </td><td></td></tr><tr><td> Microscope déconvolution DeltaVision </td><td> Applied Precision </td><td></td></tr><tr><td> Microscope droit à épifluorescence </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-07 </td></tr><tr><td> Formulation de glucose CSM Notes: Pour les plaques d&#39;agar agar, il suffit d&#39;inclure 2% (Difco) </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

cytométrie en flux à base de purification de<em&gt; s. cerevisiae</em&gt; zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes sont des intermédiaires essentiels entre les haploïdes et diploïdes états du cycle de vie de nombreux organismes, y compris la levure (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes résultat de la fusion de cellules haploïdes de type sexuel distinct (MATa, MATalpha) et donner lieu à des correspondants diploïdes stables qui génèrent successivement jusqu&#39;à 20 descendance diploïde en raison de leurs divisions mitotiques étonnamment asymétriques 2. Formation Zygote est orchestré par une séquence complexe d&#39;événements: Dans ce processus, les facteurs d&#39;accouplement solubles se lient aux récepteurs apparenté, déclenchant médiés par le récepteur cascades de signalisation qui facilitent l&#39;interruption du cycle cellulaire et aboutir à fusion cellule-cellule. Zygotes peut être considéré comme un modèle pour les progéniteurs ou de la fonction des cellules souches. Même si on a beaucoup appris à propos de la formation des zygotes et bien zygotes ont été utilisés pour étudier les cellules moléculaires des questions d&#39;intérêt général Significance, presque toutes les études ont eu recours à des mélanges d&#39;accouplement dans laquelle sont mélangés des zygotes avec une majorité de la population de cellules haploïdes 3-8. De nombreux aspects de la biochimie de la formation du zygote et la vie continue du zygote restent donc d&#39;une enquête. Rapports de purification des zygotes levure décrire les protocoles basés sur leurs propriétés de sédimentation 9; toutefois, cette procédure basée sur la sédimentation n&#39;a pas donné près de 90% de pureté dans nos mains. En outre, elle présente l&#39;inconvénient que les cellules sont exposées au sorbitol hypertonique. Nous avons donc mis au point un procédé de purification polyvalente. A cet effet, des paires de cellules haploïdes exprimant rouges ou verts protéines fluorescentes ont été co-incubées pour permettre la formation du zygote, récoltées à des moments différents, et les zygotes obtenus ont été purifiés en utilisant un protocole de triage par cytométrie de flux à base de. Cette technique permet une évaluation visuelle pratique de la pureté et de la maturation. La pureté moyennede la fraction est d&#39;environ 90%. Selon le moment de la récolte, les zygotes de différents degrés de maturité peut être récupéré. Les échantillons purifiés fournir un point de départ commode pour les «-omiques» des études, pour la récupération de la descendance initiale, et une enquête systématique de cette cellule souche.

Pour purifier les zygotes de<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;, Les cellules haploïdes de type sexuel opposé ont été modifiées pour exprimer rouges ou verts protéines fluorescentes, co-incubées pour permettre la formation du zygote, et fractionnés en utilisant une cytométrie de flux à base de protocole. La fraction hautement enrichi permet ultérieur &quot;-omiques», les études, la reprise de la descendance initiale, et l&#39;investigation systématique de la morphogenèse zygote.

Cytométrie en flux à base de purification de<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Les zygotes sont des intermédiaires essentiels entre les états haploïde et diploïde dans le cycle de vie de nombreux organismes, dont la levure (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de générer une population purifiée de zygotes de levure. Cela est réalisé en exprimant d'abord une GFP cytoplasmique ou des polyzines marquées M cherry. Dans des cellules haploïdes de type de conjugaison opposé, les cellules sont cultivées jusqu'à la phase logarithmique, puis combinées et co-incubées pour permettre la formation de zygotes.Le mélange de croisement est ensuite récolté et trié par cytométrie en flux en mode récupération afin d'isoler les cellules doublement positives rouge et vert. Cette sous-population comprend à la fois des entités pré-zygotiques et zygotiques. Pour purifier davantage l'échantillon, la population doublement positive rouge et vert est soumise à un deuxième cycle de tri en cytométrie en flux.Utilisation du mode de pureté. Cette procédure permet d'obtenir une pureté moyenne de 90 % de zygotes, selon l'examen visuel et la quantification des cellules par microscopie fluorescente. Les avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la purification par sédimentation, sont les suivants.Tout d'abord, cette technique permet une évaluation visuelle pratique de la pureté et de la matur

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Une méthode efficace pour obtenir des fractions hautement purifiées viables méiotiques de la souris testicule est décrit, qui combine un cadre raffiné dissociation cellulaire protocole avec le tri de cellules fluorescentes (FACS). Cette méthode tire parti des différences dans le contenu en ADN et de la densité nucléaire de fractions distinctes méiotique.

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Nous décrivons une stratégie de tri pour les spermatides de souris à l’aide de la cytométrie en flux. Les spermatides sont classées en quatre populations très pures : rondes (étapes 1 à 9 de la spermiogenèse), allongées précoces (étapes 10 à 12 de la spermiogenèse), allongées tardives (étapes 13 et 14 de la spermiogenèse) et spermatides allongées (étapes 15 et 16 de la spermogenèse). La coloration de l’ADN, la taille et la granulosité sont utilisées comme paramètres de sélection.

-Étape spécifique de tri Spermatides souris par cytométrie en flux

Ce protocole décrit une méthode pour isoler des cellules uniques à partir d’embryons de poisson-zèbre, enrichir pour des cellules d’intérêt, capturer des cellules de poisson-zèbre dans des systèmes de multiplexage de cellules uniques basés sur la microfluidique, et évaluer l’expression génique à partir de cellules uniques.

Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d&#39;embryons de poisson zèbre

Alors que les macrophages infiltrés sont continuellement recrutés sur les tissus adultes à partir de précurseurs circulants, les macrophages résidents sement leurs tissus pendant le développement, où ils sont maintenus sans autre contribution des progéniteurs. Les ancêtres des macrophages résidents ont récemment été identifiés. Ici, nous présentons des méthodes pour la cartographie du devenir génétique des progéniteurs résidents de macrophages.

Identification des progéniteurs érythromyélidiens et de leur descendance dans l&#39;embryon de souris par cytométrie de flux

Ce travail décrit la standardisation d'une méthode pour obtenir des populations de cellules germinales purifiées à partir d'un tissu testiculaire de différentes espèces de mammifères. C'est un protocole simple qui combine la dissociation des testicules mécaniques, la coloration avec Hoechst-33342 et l'iodure de propidium, et le triage FACS, avec de larges applications dans des études comparatives de la biologie de la reproduction masculine.

Une approche standardisée pour la purification multispécifique des cellules germinales masculines de mammifères par dissociation mécanique des tissus et cytométrie de flux

Cet article décrit un protocole de cytométrie de flux basé sur FRET pour quantifier l'auto-assemblage de protéine dans les deux cellules de S. cerevisiae et de HEK293T.

Détection et caractérisation de l'auto-assemblage des protéines in Vivo par la cytométrie des flux

Cet essai est une méthode simple pour quantifier les cellules hématopoïétiques dans le développement du poisson zèbre embryonnaire. Les cellules sanguines du poisson zèbre dissocié sont soumises à l’analyse de cytométrie de flux. Cela permet la détection de défauts sanguins chez les animaux mutants et après modification génétique.

Utilisation de la cytométrie du débit pour détecter et quantifier la formation de sang altérée chez le poisson zèbre en développement

Cet article présente un protocole d’isolement de la membrane plasmique à petite échelle pour la caractérisation de la protéine Cdr1 Cdr1 de Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), surexprimée dans Saccharomyces cerevisiae. Une double étiquette mGFPHis clivable C-terminale avec un linker de 16 résidus entre Cdr1 et l’étiquette a été conçue pour faciliter la purification et le criblage détergent de Cdr1.

Préparation de membrane plasmique à petite échelle pour l’analyse de Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Ici, nous décrivons une nouvelle méthode de cytométrie en flux pour l’isolement prospectif des progéniteurs érythroïdes unitaires formant des éclatements précoces (BFU-e) et érythroïdes formant colonie (CFU-e) directement à partir de moelle osseuse et de rate fraîches de souris. Ce protocole, développé sur la base de données transcriptomiques unicellulaires, est le premier à isoler tous les progéniteurs érythroïdes du tissu avec une grande pureté.

Identification et isolement de progéniteurs érythroïdes unitaires formant des éclatements et unités formant colonies à partir de tissus murins par cytométrie en flux

Découvrez une méthode de cytométrie en flux pour purifier des zygotes de levure S. cerevisiae avec une pureté d'environ 90 %. Cette approche permet d'isoler des populations zygotiques hautement pures pour des études de biologie cellulaire et de génétique.

Cytométrie en flux à base de purification de

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