Name: Une nouvelle approche chirurgicale pour ladministration intratrachéale dagents bioactifs dans un modèle de souris fœtale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Découvrez une technique chirurgicale innovante pour l'administration intratrachéale d'agents bioactifs chez les fœtus de souris. Cette méthode améliore le ciblage pulmonaire et évite la dilution observée avec l'injection intra-amniotique.

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MC et AVDP doctorants sont pris en charge par des subventions de l&#39;Institut pour la promotion de l&#39;innovation par la science et la technologie en Flandre (IWT-Vlaanderen). JT est titulaire d&#39;une bourse à temps partiel de recherche clinique (KOOR) de l&#39;UZ Leuven. DV est un doctorant financé par une subvention de la KU Leuven, DBOF/10/062. MMDC est un doctorant financé par une subvention du Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) et Erasmus Mundus. La recherche a été financée par l&#39;IWT-Vlaanderen, par le DIMI subvention de la CE (LSHB-CT-2005-512146) et par l&#39;imagerie moléculaire in vivo groupe de recherche (IMIR) de la KU Leuven. Nous tenons à remercier le Core Vecteur UPenn fondée par James M. Wilson pour leur aimable don de l&#39;emballage AAV6.2 plasmide pour la production de vecteurs rAAV.

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<li>Waddington, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+phenotypic+correction+of+hemophilia+B+in+immunocompetent+mice+by+prenatal+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Permanent phenotypic correction of hemophilia B in immunocompetent mice by prenatal gene therapy.</a> Blood. 104, 2714-2721 (2004).</li>
<li>Senoo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+in+utero+gene+transfer+in+mice+and+guinea+pigs%3A+tissue+distribution+of+recombinant+adenovirus+determined+by+quantitative+TaqMan-polymerase+chain+reaction+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Metab%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated in utero gene transfer in mice and guinea pigs: tissue distribution of recombinant adenovirus determined by quantitative TaqMan-polymerase chain reaction assay.</a> Mol. Genet. Metab. 69, 269-276 (2000).</li>
<li>Carlon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+mouse+lung+by+fetal+intratracheal+injection+of+rAAV2%2F6.2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2.</a> Mol. Ther. 18, 2130-2138 (2010).</li>
<li>Schmiedl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+injury+is+more+pronounced+in+fetal+transgenic+ErbB4-deleted+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced injury is more pronounced in fetal transgenic ErbB4-deleted lungs.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol. 301, L490-L499 (2011).</li>
<li>Buckley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+adenovirus-mediated+airway+transduction+in+fetal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Factors influencing adenovirus-mediated airway transduction in fetal mice.</a> Mol. Ther. 12, 484-492 (2005).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les étapes critiques <ul><li> La souche de souris, nous avons choisi de travailler avec des souris NMRI est parce qu&#39;ils ont un nombre abondant de chiots (portée moyenne 14,4 ± 1,8, propres données), de tolérer des interventions bien et ont de bonnes caractéristiques maternelles. </li><li> Placer le cordon de bourse à travers la paroi de l&#39;utérus et les membranes fœtales est une étape critique que vous ne souhaitez pas exposer la tête du foetus et non les épaules, sinon repositionnement est presque impossible s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Souris NMRI </td><td> Janvier, Le Genest St Isle, France </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L&#39;isoflurane </td><td> Isoba, Intervet / Schering-Plough Animal Health, Milton Keynes, Royaume-Uni </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Prolene 6-0 </td><td> Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgique </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vicryl 5-0 </td><td> Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgique </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 pl Hamilton Seringue en verre, Modèle 1710.5 TLLX SYR </td><td> Hamilton, Reno, NV, États-Unis </td><td> 5495-20 </td><td></td></tr><tr><td> Aiguille 30G forte </td><td> Hamilton, Reno, NV, États-Unis </td><td> 7762-03 </td><td></td></tr><tr><td> Xylocaïne 2% </td><td> AstraZeneca, Zoetermeer, Pays-Bas </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

une nouvelle approche chirurgicale pour l&#39;administration intratrachéale d&#39;agents bioactifs dans un modèle de souris fœtale

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prénatale administration pulmonaire de cellules, gènes ou des agents pharmacologiques pourrait servir de base à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour une variété de maladies génétiques et acquises. En dehors des anomalies congénitales ou héréditaires avec l&#39;exigence d&#39;expression à long terme du gène livré, plusieurs organisations non héritées des affections périnatales, où l&#39;expression des gènes à court terme ou une intervention pharmacologique est suffisante pour obtenir des effets thérapeutiques, sont considérées comme des indications potentielles futures de cette type d&#39;approche. Maladies candidates à l&#39;application de la thérapie à court terme prénatal pourrait être la carence néonatale transitoire de la protéine B tensioactif provoque néonatale 1,2 respiratoire syndrome de détresse ou de blessures hyperoxiques du poumon néonatal 3. Maladies candidates pour la correction permanente thérapeutique sont la fibrose kystique (FK) 4, les variantes génétiques de 5 tensioactifs carences et α1-antitrypsine 6. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; En règle générale, un avantage important de la thérapie génique prénatale est la capacité à amorcer une intervention thérapeutique précoce dans le développement, au niveau ou même avant les manifestations cliniques chez le patient, évitant ainsi des dommages irréparables à l&#39;individu. En outre, les organes du fœtus ont un taux de prolifération cellulaire accrue par rapport aux organes adultes, ce qui pourrait permettre à un gène ou d&#39;un transfert plus efficace de cellules souches dans le foetus. En outre, la délivrance de gènes in utero est effectuée lorsque le système immunitaire de l&#39;individu n&#39;est pas complètement mature. Par conséquent, la transplantation de cellules hétérologues ou la supplémentation d&#39;une protéine non fonctionnelle ou absente avec une version correct ne devrait pas entraîner une sensibilisation à l&#39;abri de la cellule, vecteur ou un produit transgénique, qui a récemment été prouvé être le cas avec les thérapies cellulaires et génétiques 7 . Dans la présente étude, nous avons étudié la possibilité de cibler directement la trachée fœtale dans un m de la sourisodèle. Cette procédure est en cours d&#39;utilisation dans des modèles animaux plus grands comme les lapins et les moutons 8, et même dans un contexte clinique 9, mais n&#39;a jusqu&#39;à présent pas été effectuée avant dans un modèle murin. Lorsque l&#39;on étudie le potentiel de la thérapie génique pour les maladies génétiques du fœtus tels que CF, le modèle de souris est très utile en tant que première preuve de concept en raison de la grande disponibilité des différentes souches de souris transgéniques, l&#39;embryogenèse bien documenté et le développement du fœtus, moins strictes règles d&#39;éthique, de gestation courte et la taille de la portée large. Voies d&#39;accès différentes ont été décrites pour cibler les poumons des rongeurs fœtale, y compris injection intra-amniotique 10-12, (écho-guidée) intrapulmonaire d&#39;injection et 13,14 administration intraveineuse dans les vaisseaux du sac vitellin 15,16 ou 17 veine ombilicale. Notre nouvelle procédure chirurgicale permet aux chercheurs d&#39;injecter l&#39;agent de choix directement dans la trachée de souris foetale qui permetpour une livraison plus efficace pour les voies respiratoires que les techniques existantes 18.

Nous avons développé une nouvelle approche chirurgicale pour l&#39;administration intratrachéale d&#39;agents bioactifs dans le fœtus de souris. L&#39;itinéraire de livraison est plus efficace en ciblant les poumons de foetus de souris que l&#39;couramment utilisés injection intra-amniotique. Cette procédure n&#39;a jusqu&#39;à présent pas été décrits dans un modèle de souris.

Une nouvelle approche chirurgicale pour l&#39;administration intratrachéale d&#39;agents bioactifs dans un modèle de souris fœtale

L'administration prénatale pulmonaire de cellules, de gènes ou d'agents pharmacologiques pourrait constituer la base de nouvelles stratégies thérapeutiques pour diverses pathologies génétiques et...

L'objectif général de l'expérience suivante est de pouvoir injecter un agent de choix directement dans la trachée du fœtus de souris, ce qui permet une délivrance plus efficace dans les voies respiratoires que les techniques existantes. Cela est réalisé en extériorisant la tête du fœtus par une hystérotomie et en accédant à la trachée fœtale. Ensuite, une incision cervicale verticale est pratiquée pour visualiser la trachée, et une aiguille est insérée sous guidage visuel.Ensuite, des billes fluorescentes ou un vecteur viral sont injectés dans la trachée afin de délivrer efficacement la substance choisie aux voies respiratoires fœtales. L'analyse microscopique de coupes tissulaires provenant de poumons traités montre que l'injection intratrachéenne permet un délivrance plus efficace de molécules fluorescentes ou de vecteurs viraux aux voies respiratoires fœtales par rapport à la voie de délivrance intra-amniotique la plus couramment utilisée. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'injection fœtale intra-amniotique, est qu'elle évite la dilution de la substance injectée dans le liquide amniotique.Cela maximise l'effet de la quantité de particules présentes dans le poumon de souris fœtale. En général, les personnes novices dans cette technologie trouveront extrêmement difficile d'effectuer une injection endotrachéale parfaite. Cela s'explique par le fait que la trachée fœtale est extrêmement fragile et peut donc être perforée très facilement.Lorsque vous effectuez cette manipulation, vous réalisez une injection par trajectoire trachéenne et, par conséquent, vous ne parvenez pas à cibler le poumon fœtal. Mais, comme toujours, la pratique rend parfait. En prévision d'une injection intratrachéenne ou d'une injection it, préparez des souris gestantes soumises à une IRM. Elles doivent être enceintes de 18 jours au moment de l'intervention chirurgicale, avant et après celle-ci.Ils sont logés dans des cages à grille filtrante à température ambiante normale et en lumière du jour normale, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Après avoir anesthésié la souris à l'isoflurane, placez-la sur un tapis chauffant à 37 degrés Celsius afin de maintenir la température corporelle, puis vérifiez le niveau d'anesthésie en effectuant une pression sur l'orteil. Désinfectez l'abdomen avec de la bétadine, puis pratiquez une laparotomie médiane pour exposer l'utérus gestant, extériorisez les deux cornes utérines et comptez le nombre de sacs gestationnels.Un fœtus par corne est opéré en fonction de la position optimale pour l'extériorisation de la tête fœtale. Pour fixer le fœtus à l'intérieur de l'utérus au niveau des épaules, passez six points de suture en proline par cordon, d'environ un centimètre de diamètre, à travers la paroi utérine et les membranes fœtales dans la zone où la tête fœtale sera exposée. Ensuite, pratiquez une incision dans la paroi utérine à l'intérieur du point de suture en bourrelet d'environ 0,8 centimètre à l'aide de petites ciseaux à pointe fine.Ensuite, faites doucement passer la tête et le cou du fœtus à travers l'hystérotomie. Puis tirez délicatement sur le point de bourrelet, serrez la suture autour du cou et utilisez deux pinces micro-moustiques. Pour le fixer en position, utilisez du polyactine 5-0.Neuf points de suture 10 sur deux pinces placées dans la bouche autour de la mâchoire supérieure afin de maintenir la tête fœtale en hyperextension sous un microscope stéréo. Visualiser la trachée à l’aide d’une dissection fine et émoussée pour pratiquer une incision verticale du cou, puis disséquer davantage les tissus sous-jacents afin d’atteindre la trachée. À l’aide d’une seringue en verre Hamilton de 50 microlitres équipée d’une aiguille fine de calibre 30, injecter un volume total de 30 microlitres de substance.Un afflux minimal du liquide injecté lors du retrait de l'aiguille garantit que l'injection a été effectuée correctement. Pour replacer la tête dans l'utérus, appliquez une pression douce sur le museau. D'abord, le cou retourne dans l'utérus, suivi par la tête.Et enfin, le nez. Insérer une aiguille contenant du sérum physiologique dans l'incision située à l'intérieur du point de suture en bourdon. Fermer l’hystérotomie en resserrant le point de suture en bourdon et injecter un volume total d’environ 500 microlitres de sérum physiologique dans la cavité amniotique afin de prévenir l’oligohydramnios.Après avoir remis l'utérus dans l'abdomen, utilisez un point continu en soie Vicryl 5-0 en deux couches distinctes. Pour fermer la paroi abdominale maternelle, injectez 0,2 % de Xylocaïne dans l'incision afin de soulager la douleur postopératoire. Maintenez la souris sur un tapis chauffant jusqu'à ce qu'elle se soit complètement rétablie avant de réaliser une injection intra-amniotique ou IA chez le fœtus.Après avoir anesthésié la souris gestante, utiliser de l'iodure de povidone pour désinfecter l'abdomen et pratiquer une laparotomie médiane afin d'exposer l'utérus gestant, d'extérioriser les deux cornes utérines et de compter le nombre de poches gestationnelles. À l’aide d’une seringue en verre Hamilton de 50 microlitres équipée d’une aiguille fine de calibre 30, insérer l’aiguille dans la poche, près de la bouche du fœtus sans entrer en contact avec celui-ci, et injecter 30 microlitres de solution dans le liquide amniotique.Une fois que tous les fœtus ont été injectés, remettre l'utérus en place dans l'abdomen et suturer la paroi abdominale et la peau avec du fil Vicryl 5-0. Après l'euthanasie de la mère, 36 heures après l'intervention fœtale, extraire les fœtus par césarienne et évaluer leur viabilité en recherchant la présence d'un battement cardiaque, d'une coloration cutanée rose et de mouvements spontanés. Placer les nouveau-nés à proximité d'une source d'oxygène pour stimuler la respiration et l'apport en oxygène.Ensuite, marquer les petits à la base de la queue. À l’aide d’encre chinoise, une injection réussie peut être évaluée en euthanisant un fœtus opéré et en disséquant les poumons pour examiner macroscopiquement la présence du colorant visible dans les poumons, par rapport aux poumons témoins non injectés. Ensuite, couvrir le reste des petits qui répondent aux critères de viabilité.Utilisez un matériau de litière contenant des fèces et de l'urine provenant d'une mère nourricière ayant des petits âgés d'un jour, puis placez les petits avec la portée de la mère nourricière. Ne laissez pas plus de 10 petits au total dans la portée de la mère nourricière. Ensuite, placez la cage dans un environnement calme et sans perturbation pendant 12 heures et évaluez le taux de survie du transfert pour déterminer le volume optimal.Des volumes de 10, 20 et 30 microlitres de molécules rouges fluorescentes de 100 nanomètres ont été choisis empiriquement. On observe ici des images confocales de coupes pulmonaires fixées avec coloration des noyaux. Bien qu'au moment de la chirurgie fœtale un reflux ait été détecté uniquement après l'injection de 30 microlitres, indiquant un excès de liquide injecté, l'injection de 30 microlitres a donné la quantité la plus élevée de signal fluorescent dans le parenchyme pulmonaire, comme quantifié par la mesure de la fluorescence relative illustrée ici ; cette injection a entraîné une délivrance significativement plus importante de microbilles fluorescentes au poumon fœtal par rapport à la racine I A.Le tractus gastro-intestinal s'est également révélé positif chez les animaux injectés par voie IT et IA. Aucune fluorescence rouge n'a été observée dans d'autres tissus provenant des fœtus traités ni chez les animaux contrôles négatifs. Pour évaluer l'efficacité de la transduction virale après injection, des injections IT et IA ont été réalisées à l'aide de vecteurs RAAV à enveloppe ENC exprimant la luciférase de luciole sous le contrôle du promoteur de l'actine bêta de poulet à l'âge d'une semaine. Le flux total de photons pour le groupe IT était significativement plus élevé que celui des nouveau-nés IA et du témoin négatif.Pour distinguer une injection IT correcte d'une injection incorrecte, une combinaison d'imagerie par résonance magnétique ou IRM et d'imagerie par bioluminescence ou BLI a été réalisée afin d'obtenir une image superposée qui combine le signal BLI de surface à une visualisation des structures anatomiques profondes provenant de l'imagerie IRM, comme illustré ici. À l'âge d'une semaine, l'imagerie BL a révélé un signal provenant de la région cervicale et thoracique.La co-localisation de l'IRM avec la bioluminescence a permis de détecter une expression du gène luciférase dans la région pulmonaire suite à une injection correcte, mais dans la région cervicale et abdominale après une injection incorrecte. L'analyse histologique par coloration ex-gal a confirmé la co-localisation in vivo. Une fois maîtrisée, l'ensemble de la procédure d'injection intra peut être réalisée en une demi-heure, de l'incision à la fermeture chez l'animal femelle.Une durée d'opération courte entraînera une meilleure survie fœtale et permettra d'étudier un plus grand nombre d'animaux après la naissance.

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Cette vidéo décrit une approche intrabronchique pour administrer sélectivement un agent expérimental dans les poumons distaux droit et gauche. Dans le protocole présenté, nous administrerons la bléomycine par voie intrabronchique à une souris afin d’obtenir un meilleur modèle de fibrose pulmonaire.

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Source : Venuprasad, K., et al. Administration intra-trachéale d’Haemophilus influenzae dans des modèles murins pour étudier l’inflammation des voies respiratoires. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo démontre l’administration intratrachéale d’un inoculum bactérien pathogène pulmonaire dans une souris anesthésiée pour modéliser une infection des voies respiratoires inférieures.

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L'utilisation d'un modèle qui reproduit l'état de maladies pulmonaires chez les humains est essentielle pour l'étude de la pathophysiologie et / ou de l'étiologie d'une maladie particulière et pour développer une intervention thérapeutique. Voici une méthode d'intubation trachéale non invasive qui peut directement livrer les matériaux exogènes aux poumons de souris est présentée.

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Cet article présente une méthode rapide et simple pour l'administration de la bléomycine directement dans la trachée de souris par intubation. Les principaux avantages de cette méthode est qu'il est hautement reproductible, facile à maîtriser, et ne nécessite pas d'équipement spécialisé ou de longs temps de récupération.

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L'administration intratrachéale (IT) des agents expérimentaux chez les souris a souvent comme conséquence la livraison asymétrique aux poumons distal.  Dans ce rapport, nous décrivons une approche intrabronchique directe (IB) pour cannuler chaque poumon dans les souris vivantes non-opératoirement.  Cette approche peut être utilisée pour administrer sélectivement des agents à un poumon ou peut être adaptée pour améliorer l'administration d'agents symétriques aux deux poumons.

Administration intrabronchique directe pour améliorer le dépôt sélectif d'agent dans le poumon de souris

Cette technique consistant à instiller des médicaments directement dans la trachée des rongeurs néonatals est importante pour étudier l’impact des médicaments ou des produits biologiques administrés localement sur les maladies pulmonaires néonatales. En outre, cette méthode peut également être utilisée pour induire des lésions pulmonaires dans des modèles animaux.

Une méthode mini-invasive pour l’instillation intratrachéale de médicaments chez les rongeurs néonatals pour traiter les maladies pulmonaires

Divers modèles animaux d’hernie diaphragmatique congénitale et d’occlusion trachéale fœtale présentent des avantages et des inconvénients en ce qui concerne les questions éthiques, le coût, la difficulté chirurgicale, la taille, les taux de survie et la disponibilité des outils génétiques. Ce modèle fournit un nouvel outil pour étudier l’impact de l’occlusion trachéale et de la pression luminaire accrue sur le développement pulmonaire.

Modèle transuté d’occlusion trachéale foetale chez la souris

Ici, nous proposons un protocole pour l’administration intratrachéale de lipopolysaccharides (LPS) via une intubation endotrachéale oropharyngée non invasive. Cette méthode minimise le traumatisme de l’intervention chirurgicale pour l’animal et délivre avec précision le LPS à la trachée, puis aux poumons.

Instillation intratrachéale non invasive de lipopolysaccharides chez la souris

Ce protocole montre comment le positionnement optimal d’une souris et l’insertion transorale d’un otoscope basé sur une caméra permettent de visualiser la glotte, une intubation rapide avec un traumatisme tissulaire minimal et une distribution constante de liquide dans les poumons.

Méthodologie améliorée pour l’administration de liquide dans le poumon de souris : intubation à l’aide d’un otoscope grand public

Découvrez une technique chirurgicale innovante pour l'administration intratrachéale d'agents bioactifs chez les fœtus de souris. Cette méthode améliore le ciblage pulmonaire et évite la dilution observée avec l'injection intra-amniotique.

Une nouvelle approche chirurgicale pour l'administration intratrachéale d'agents bioactifs dans un modèle de souris fœtale

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