Name: Réparation dun modèle de critique des défauts de taille crânienne Utilisation adipeuses cellules stromales prélevés sur des Lipoaspirate (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T10:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Apprenez à isoler des cellules stromales dérivées du tissu adipeux pour la régénération osseuse dans un modèle de défaut calvarien critique chez la souris. Cette méthode offre des applications cliniques prometteuses en ingénierie tissulaire.

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Nous tenons à remercier le Dr George communes et le Dr Dean Vistnes pour leur soutien et la collaboration de nos recherches. Ce travail est soutenu par l&#39;Institut national de bourses de recherche dentaire et craniofaciale 1 R21 DE019274-01, RC2 et R01EB009689 DE020771-02, la Fondation Oak et Hagey Laboratoire de médecine régénérative de pédiatrie à MTL Dr Hyun est pris en charge par le Saint Joseph Mercy Hospital GME .

1. Isolement cellulaire et l&#39;expansion <ol><li> Tout le consentement du patient et des protocoles expérimentaux ont été examinés et approuvés par l&#39;Université de Stanford institutionnel commission d&#39;examen (Protocole # 2188 et # 9999). </li><li> Obtenir humaine tissu adipeux sous-cutané des procédures électives lipoaspiration sous local / anesthésie générale. </li><li> Il y aura deux couches dans le lipoaspirate (figure 1A). Le surnageant contient la grande majorité de la matière traitée cellulaire. La couche inférieure est le plus souvent injecté une solution saline. Adipeuses cellules stromales peuvent être récoltées à partir de chaque couche, mais le rendement est beaucoup plus élevé dans le surnageant. </li><li> Pour isoler la fraction stroma vasculaire (SVF), laver abondamment avec de l&#39;lipoaspirate volumes égaux de 1X tampon phosphate salin (PBS) contenant 2,5% de bétadine (x2), suivi par un volume égal de PBS 1X (x1) sans bétadine. Laissez le lavage à précipiter. </li><li> Veillez à maintenir stérile technique tout au long du processus de la contamination avec les tissus humains transformés peut arriver. </li><li> Aspirer la couche de fond et jeter après chaque lavage. </li><li> Aliquote de 15 ml de tissu adipeux dans 50 ml tubes coniques Falcon BD. </li><li> Digérer le tissu adipeux avec un volume égal (15 ml) d&#39;eau filtrée 0,075% collagénase de type II dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) à 37 ° C dans un bain-marie pendant 60 min sous agitation constante (environ 180 secousses / min) - ventiler chaque tube toutes les 15 min. </li><li> Neutraliser l&#39;activité de l&#39;enzyme avec 15 ml de PBS contenant 10% (sérum de veau foetal) FBS, et centrifuger à 1000 rpm pendant 5 min à 4 ° C pour obtenir une haute densité SVF granulés. Le culot sera un mélange de adipeuses cellules stromales et les érythrocytes. </li><li> Jeter le surnageant sans perturber le culot. </li><li> Reprendre le culot dans 10 ml de milieu de culture traditionnels (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] / FBS à 10% / 1% de pénicilline-streptomycine solution). </li><li> Filtrer suspension<html> sion à travers une passoire en nylon 100 um cellule pour éliminer les débris cellulaires. </li><li> Combinez 3 tubes dans un propre conique 50 ml. Centrifuger à 1000 rpm pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Jeter le surnageant sans perturber le culot. </li><li> Reprendre le culot dans 5 ml de milieu de culture traditionnels </li><li> Combinez deux 50 ml coniques, par une plaque de 10 cm ou cinq Coniques 50 ml pour une plaque 15 cm. </li><li> Mettre en place des cultures primaires pendant la nuit à 37 ° C/21% d&#39;O 2, 5% de CO 2. </li><li> Après une nuit d&#39;incubation, laver les assiettes abondamment avec du PBS pour éliminer résiduels non adhérentes globules rouges. Les populations de cellules adipeuses qui en résultent sont dérivées de cellules stromales. </li><li> Maintenir les cellules en sous-confluentes les niveaux pour prévenir la différenciation spontanée à 37 ° C/21% d&#39;O 2, 5% de CO 2 dans les milieux de croissance. Les cellules doivent généralement être divisés tous les trois à quatre jours dans un milieu de croissance réguliers lorsque étalées à 50% de confluence. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. Préparation d&#39;échafaudage <ol><li> Les échafaudages ont été faites par le Dr Min Lee de l&#39;Université de Californie, Los Angeles - School of Dentistry. </li><li> Échafaudages ont été fabriquées à partir de PLGA 85/15 de poly (acide lactique-co-acide glycolique) (viscosité inhérente = 0,61 dl / g, Birmingham Polymers) par coulée en solvant et un processus de lessivage particulaire. </li><li> PLGA / chloroforme solutions ont été mélangées avec du saccharose 200-300 um de diamètre pour obtenir 92% (fraction volumique) la porosité et comprimé en feuilles minces dans un moule en téflon. </li><li> Après lyophilisation du jour au lendemain, les échafaudages ont été immergés dans trois changements de bidistillée (dd) H 2 O pour dissoudre le saccharose, et doucement retiré de la plaque en téflon avec une spatule fine pointe. </li><li> Après le lessivage de particules, tous les échafaudages ont été désinfectés par immersion dans 50%, 60% et 70% d&#39;éthanol pendant 30 minutes chacun, suivis par trois rinçages de ddH 2 O. </li><li> Tous les échafaudages ont été séchés sous une hotte à flux laminaire. </li><li> Après échafaudage fabrication, scaffolds ont été revêtues d&#39;apatite. <ol class="ualpha"><li> SBF (fluide corporel simulé) On prépare une solution avec des concentrations en ions qui sont 5 fois supérieure à celle du plasma sanguin humain. Toutes les solutions sont stérilisées par filtration à travers une membrane de 0,22 um PSE (Nalgene). Immédiatement avant l&#39;opération de revêtement, on sèche échafaudages PLGA ont été soumis à une décharge luminescente, le plasma d&#39;argon-gravure (Harrick Scientific) pour améliorer le mouillage et l&#39;uniformité du revêtement. </li><li> Gravées échafaudages PLGA ont ensuite été incubées dans du SBF à 37 ° C dans un incubateur à chemise d&#39;eau pendant 12 heures, suivie par Mg 2 + et HCO 3 - libre SBF 2 pour un autre h 12 à 37 ° C sous agitation douce. </li><li> Enduits échafaudages PLGA ont été rincés doucement avec ddH 2 O stérile pour laver l&#39;excès de solution de chlorure de sodium, séchées dans une hotte à flux laminaire et désinfectés avec de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> L&#39;intégrité du revêtement d&#39;apatite ont été analysées avec un microscope électronique à balayage (MEB). Apatite enduit scaffolds ont été montés sur les talons de SEM (Ted Pella) et revêtue de carbone pour améliorer la conductivité. Le mode électrons secondaires a été appliqué pendant SEM (FEI / Phillips XL-30) d&#39;observation. Dispersion d&#39;énergie de rayons X du spectre a été obtenu pour les composition élémentaire des structures d&#39;apatite. </li></ol></li></ol> 3. L&#39;ensemencement de cellules <ol><li> Après avoir atteint des niveaux sous-confluence, laver les cellules avec du PBS (x2) et trypsiniser. </li><li> Compter les cellules de quantifier pour l&#39;ensemencement </li><li> Semences sur échafaudages 4,0 prédécoupées mm de diamètre avec 1,5 x 10 5 cellules. <ol class="ualpha"><li> Place de l&#39;individu échafaudage dans un puits d&#39;une plaque de 96 puits </li><li> Remettre en suspension les cellules dans un milieu de croissance réguliers avec une concentration d&#39;environ 1,5 x 10 5 cellules par 20 pi de médias </li><li> Pipeter 20 pl directement sur l&#39;échafaud, puis placer en incubateur de culture cellulaire pendant 30 min. </li><li> Après 30 minutes, ajouter 200 ul de médias et de permettre aux cellules à incubersur l&#39;échafaud pendant la nuit avant la chirurgie </li><li> Il n&#39;est pas nécessaire pour assurer l&#39;adhérence des cellules sur l&#39;échafaud comme l&#39;ensemencement d&#39;un nombre suffisant de cellules veillera à ce que la majorité se fixer sur l&#39;échafaud. Ceci a été validé dans notre laboratoire in vivo avec la bioluminescence et l&#39;analyse histologique. </li></ol></li></ol> 4. Création de défauts crânienne et une implantation in vivo <ol><li> Anesthetize adulte (60 jours d&#39;âge) CD-1 souris nude avec cocktail anesthésiant. (Kétamine / xylazine / acépromazine) à une concentration de 50% (1:1 dilution avec 0,9% de NaCl) ou par recommandé régime anesthésique selon les protocoles institution. Ces souris sont athymiques si les hASCs ne sera pas provoquer une réaction immunitaire. <ol class="lalpha"><li> Dosage: Le chlorhydrate de kétamine (80 mg / kg), xylazine (2,5 mg / kg) acépromazine (2,5 mg / kg) </li><li> Durée de l&#39;effet: environ 30 min </li></ol></li><li> Chirurgicale drapent l&#39;animal et stériliser la chirurgiele site avec de la bétadine et de l&#39;alcool (x3) et couvrir les yeux de souris avec une pommade avant de faire une incision médiane sagittale dans le cuir chevelu de l&#39;animal pour exposer l&#39;os pariétal droit. Retirez le péricrâne de l&#39;os pariétal droit avec grattage pointu (figure 1B). </li><li> Créer un unilatéral de 4 mm d&#39;épaisseur totale défaut dans le droit fil de suture non-pariétal associée en utilisant une solution stérile diamanté foret trépan. Précautions extrêmes doivent être prises pour ne pas perturber la dure-mère sous-jacente (figure 1B) que l&#39;épaisseur crânienne de souris est &lt;0,3 mm. </li><li> Avant l&#39;implantation, rincer échafaudages avec du PBS stérile pour empêcher le transfert de facteurs de croissance à moyen dérivés. </li><li> Placez l&#39;échafaud dans le défaut. </li><li> Enfin, suturer la peau ferme et de surveiller l&#39;animal par les protocoles établis postopératoires. </li><li> Utilisez une analgésie établi selon les directives de vos protocoles de soins aux animaux, au besoin en post-opératoire, par exemple-. buprénorphine 0,1 mg / kg. </li></ol> 5. Quantification de la formation ostéoïde <ol><li> Après microCT a été réalisée sur la souris, l&#39;image en trois dimensions a été reconstruite en utilisant un logiciel tel que décrit précédemment MicroView 1. </li><li> Utilisation d&#39;Adobe Photoshop, les images ont été dimensionnés pour une hauteur standard. </li><li> Utilisation de la fonction Magic Wand, les pixels ont été mesurées de la défectuosité crânienne. </li><li> Pourcentage de guérison de la lésion a été déterminée par la suite tomodensitométrie mesure de la zone de défaut crânienne et de déterminer le nombre de pixels et en le divisant par le nombre de pixels le défaut original </li><li> Par conséquent, si le microCT n&#39;est pas disponible, une alternative est d&#39;utiliser Adobe Photoshop et la récolte de la calvaria à des moments déterminés pour l&#39;histologie. </li><li> Utilisation colorations histologiques comme le bleu d&#39;aniline et Pentachrome qui dénotent formation ostéoïde, plusieurs sections le long de la durée du défaut doit être teinté </li><li> Utilisation d&#39;Adobe Photoshop, culture sur tous les domaines qui ne sont pasdans le défaut crânienne </li><li> Utilisez la fonction de baguette magique et déterminer le nombre de pixels de la formation de l&#39;os novo dans la zone de la lésion et de comparer à des contrôles ou d&#39;autres variables. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Le tissu adipeux a le potentiel de jouer un rôle essentiel dans la production de cellules souches pour une application clinique. Le tissu adipeux a un avantage unique en ce qu&#39;il est une source facilement disponible qui peut être récoltée dans une procédure relativement simple qui consiste à la morbidité et de la mortalité minime. Une fois que le tissu est récolté et recueilli, notre protocole est décrit dans la figure 2. Adipeuses cellules stromales sont isolés par une série d&#39;étapes de lavage, digestion à la collagénase, et la centrifugation. Une fois que les cellules sont étalées dans la culture, ils peuvent être étendus, placés dans des protocoles de différenciation in vitro différents, ou placés directement in vivo. Le création de la critique 4 mm taille de défaut crânienne offre un accès facile et reproductible modèle in vivo pour tester la capacité de différenciation ostéogénique de nos tissus adipeux provenant des cellules stromales. Grâce à l&#39;utilisation de microCT, nous sommes en mesure de suivre la formation de tissu osseux in vivo et suivre l&#39;évolution de nos interventions (figure 3). Le défaut de taille critique crânienne ne guérit pas dans la vie de l&#39;animal et l&#39;on voit à peu près 90% de l&#39;anomalie reste de brevets autour de 8 semaines. L&#39;échafaud lui-même (voir la discussion) a ostéogéniques propriétés inductives et a démontré sa capacité à induire une régénération osseuse. Les résultats typiques de placement échafaudage sans cellules montre que près d&#39;un tiers de la défectuosité aura formation de l&#39;os novo à 8 semaines. Avec l&#39;augmentation du tissu adipeux dérivés de cellules stromales, plus des deux tiers ou plus du défaut indique la régénération osseuse autour de 8 semaines, mais il est variabilité entre chaque animal et de la chirurgie. La formation de tissu osseux peuvent être quantifiés par l&#39;histologie et montrent des résultats typiques augmentation de la formation ostéoïde dans les échantillons avec ASC par le bleu d&#39;aniline et la coloration Pentachrome (figure 3C). En outre, nous montrons que les cellules implantées humaines contribuent à la formation sous-jacente de novo osseuse grâce à l&#39;utilisation de hASCs GFP-étiquetés qui montrent une coloration in vivo à 2 semaines près de la zone de formation de l&#39;os novo dans le défaut crânienne (figure 3D) . En outre, nous utilisons immunohistochimie avec un anticorps spécifique de l&#39;homme pour montrer la survie des cellules humaines et de la contribution dans le domaine de l&#39;anomalie (figure 3E). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig1.jpg" /> Figure 1 -. L&#39;lipoaspirate a deux couches. La couche supérieure contient les adipocytes et la majorité de la processes matériel cellulaire tandis que la couche inférieure contient la solution saline utilisée lors de la procédure lipoaspiration. B - la création de l&#39;anomalie crânienne par une incision médiane sur le péricrâne d&#39;isoler l&#39;os pariétal droit, de la création ultérieure d&#39;un défaut critique 4 mm taille crânienne sans interruption de la dure-mère sous-jacente. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig2.jpg" /> Figure 2. Vue d&#39;ensemble de la récolte et l&#39;application de lipoaspirate de l&#39;isolement de adipeuses cellules stromales à leur expansion, la différenciation et l&#39;utilisation in vitro et in vivo. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig3.jpg" /> La figure 3. MicroCT-A montre la cicatrisation in vivo de la taille critique défaut crânienne avec l&#39;application de l&#39;ASC à travers une hydroxyapatitie échafaudage (rangée du bas). Les contrôles comprennent pas d&#39;échafaudage et de défauts (rangée du haut) et le défaut de mise en place de l&#39;échafaud sans cellules (rangée du milieu) B - Quantification de la cicatrisation osseuse de la microCT montrant la guérison significativement augmenté dans le groupe ASC. C - Histologie montrant augmentation de la formation ostéoïde du groupe ASC (rangée du bas) par le bleu d&#39;aniline et la coloration Pentachrome. Pour le bleu d&#39;aniline, les taches ostéoïdes bleu foncé et Pentachrome, les taches ostéoïdes jaune. D - hASCS étiquetées avec la GFP ont été ensemencées sur un échafaudage et placé dans un défaut crânienne et sacrifiés à 2 semaines. La coloration a été fait avec une GFP anticorps marqué pour montrer les cellules humaines qui contribuent à la régénération dans la zone du défaut. E -. Human immunohistochimie montrant la prévalence antigène nucléaire des cellules humaines dans le domaine de la défectuosité à 2 semaines <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4221/4221fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Depuis l&#39;isolement de tissu adipeux dérivé des cellules stromales de 2 lipoaspirate, ces cellules ont été différenciées en une grande variété de lignées cellulaires. Le tissu adipeux est d&#39;origine mésodermique et, par conséquent, multipotentes dérivées du tissu adipeux cellules stromales sera probablement plus efficace avec une application vers un lignage mésodermique. La capacité à générer du tissu squelettique est particulièrement important compte tenu de la pénurie de sites donneurs pour une autogr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif: </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lipoaspirate récolte </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010-023 </td><td></td></tr><tr><td> Hank Balanced Salt Solution </td><td> Cellgro </td><td> 21-023 CV- </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase </td><td> Sigma </td><td> C6885-500MG </td><td></td></tr><tr><td> Crépine cellule 100 um </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td><td></td></tr><tr><td> Steri-dessus 500 ml 0,22 um filtre </td><td> Millipore </td><td> SCGPT05RE </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Défaut crânienne </td></tr><tr><td> Z500 Brushless MicromotorsUM50C </td><td> NSK </td><td> NSKZ500 </td><td></td></tr><tr><td> Couteau circulaire 4,0 mm </td><td> Xemax chirurgicale </td><td> CK40 </td><td></td></tr></tbody></table>

réparation d&#39;un modèle de critique des défauts de taille crânienne utilisation adipeuses cellules stromales prélevés sur des lipoaspirate

Repair of a Critical-sized Calvarial Defect Model Using Adipose-derived Stromal Cells Harvested from Lipoaspirate

Craniofaciale réparation et la régénération osseuse offre la promesse de la formation de novo des tissus grâce à une approche basée sur des cellules en utilisant des cellules souches. Adipeuses cellules stromales (ASC) se sont révélés être une source abondante de cellules souches multipotentes capables de subir ostéogénique, chondrogénique différenciation, adipogénique et myogénique. De nombreuses études ont exploré le potentiel ostéogénique de ces cellules in vivo avec l&#39;utilisation de biomatériaux divers échafaudages pour la livraison cellulaire. Il a été démontré qu&#39;en utilisant une ostéoconducteur, recouverte d&#39;hydroxyapatite poly (acide lactique-co-acide glycolique) (PLGA-HA) échafaudage ensemencé avec CSA, un défaut critique entreprises crânienne, un défaut qui est défini par son incapacité à subir spontanée la guérison au cours de la vie de l&#39;animal, peuvent être effectivement montrer robuste régénération osseuse. Ce modèle in vivo démontrent la base de l&#39;approche translationnelle visant à régénérer le tissu osseux - le cellulairecomposant et la matrice biologique. Cette méthode sert de modèle pour l&#39;application ultime clinique d&#39;une cellule souche vers la réparation d&#39;un défaut spécifique au tissu.

Ce protocole décrit l&#39;isolement de tissu adipeux dérivé des cellules stromales de lipoaspirate et la création d&#39;une 4 mm de taille critique défaut crânienne pour évaluer la régénération osseuse.

Réparation d&#39;un modèle de critique des défauts de taille crânienne Utilisation adipeuses cellules stromales prélevés sur des Lipoaspirate

La réparation et la régénération du squelette cranio-facial offrent la perspective d'une formation tissulaire de novo grâce à une approche cellulaire utilisant des cellules souches.

Le but global de cette procédure est de prélever des cellules stromales multipotentes à partir de tissu adipeux en vue d'une différenciation ostéogénique, en utilisant un modèle de défaut calvarial in vivo chez la souris. Cela est réalisé en isolant d'abord les cellules progénitrices de la couche vasculaire stromale du tissu adipeux, qui peut être obtenue après une intervention de liposuccion. L'étape suivante consiste à préparer une matrice tridimensionnelle, puis à ensemencer les cellules sur ce support.La dernière étape consiste à créer un défaut calvarial de taille critique dans un modèle murin, dans lequel sont placés le support tridimensionnel et les cellules. En définitive, les résultats montrent que les cellules stromales multipotentes isolées du tissu adipeux possèdent un potentiel de régénération squelettique in vivo. Les applications de cette technique couvrent un large spectre de possibilités d'applications cliniques en raison de la pénurie de tissu disponible pour la régénération squelettique.Bien que les greffes osseuses autologues soient la référence, le manque de sites donneurs et la morbidité associée au site donneur limitent cette option. Les allogreffes et les matériaux étrangers peuvent être utilisés, mais sont limités par leur coût, une mauvaise intégration et un risque d'infection.L'utilisation possible du tissu adipeux ou gras pour l'isolement de cellules progénitrices en vue de l'ingénierie des tissus squelettiques est prometteuse. La démonstration de la procédure sera réalisée par mes soins et par Michael Chung du laboratoire Long Anchor. Tout d'abord, obtenir du tissu adipeux sous-cutané humain à partir de prélèvements par lipoaspiration élective.Et observez les deux couches présentes dans l'aspirat lipidique. Le surnageant contient la grande majorité du matériel cellulaire obtenu. La couche inférieure est principalement constituée du sérum physiologique injecté.Les cellules stromales dérivées du tissu adipeux peuvent être récupérées à partir de l'une ou l'autre couche, mais le rendement est nettement plus élevé dans le surnageant. Pour isoler la fraction vasculaire stromale ou lavage SVF, laver abondamment le lipoaspirat avec des volumes équivalents de solution saline tamponnée au phosphate 1 x ou PBS contenant 2,5 % de Bétadine, puis aspirer un volume équivalent de PBS 1 x sans Bétadine. Laisser le lavage précipiter.Veillez à maintenir une technique stérile tout au long du processus afin d'éviter toute contamination par des tissus humains manipulés. Ensuite, aspirez la couche inférieure et jetez-la après chaque lavage, puis transférez 15 millilitres de tissu adipeux dans des tubes coniques Falcon de 50 millilitres. Digestez ensuite le tissu adipeux dans 15 millilitres de solution filtrée à 0,075 % filtrée.Incubez la collagénase de type II dans une solution saline équilibrée de Hank ou HBSS à 37 degrés Celsius dans un bain-marie pendant 60 minutes sous agitation constante, en veillant à aérer les tubes toutes les 15 minutes. Ensuite, neutralisez l'activité enzymatique avec 15 millilitres de PBS contenant 10 % de sérum bovin fœtal ou FBS et centrifugez. Pour obtenir un culot dense de fraction stromale-vasculaire (SVF), le culot sera composé d'un mélange de cellules souches mésenchymateuses adipeuses et d'érythrocytes.Jetez d'abord la couche lipidique du surnageant, puis éliminez la couche liquide du surnageant sans perturber le culot. Resuspendez le culot dans 10 millilitres de milieu de croissance classique. Ensuite, réunissez les trois tubes dans un tube conique propre de 50 millilitres à l’aide d’un filtre de 100 microns et centrifugez.Jetez le surnageant sans perturber le culot, puis resuspendez le culot. Dans cinq millilitres de milieu de croissance traditionnel, combinez deux tubes coniques de 50 millilitres par plaque de 10 centimètres, ou cinq tubes coniques de cinq millilitres pour une plaque de 15 centimètres. Établissez les cultures primaires pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 21 % d'oxygène et 5 % de dioxyde de carbone.Après une incubation nocturne, laver les plaques avec du PBS pour éliminer les globules rouges résiduels non adhérents. Les populations cellulaires obtenues sont des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux. Maintenir les cellules à des niveaux subconfluents afin d'éviter une différenciation spontanée.À 37 degrés Celsius, 21 % d'oxygène et 5 % de dioxyde de carbone. Dans le milieu de croissance, les cellules doivent généralement être divisées tous les trois à quatre jours dans un milieu de croissance standard. Lorsqu'elles sont ensemencées à une confluence de 50 %, préparez le support comme indiqué dans le manuscrit accompagnant.Lorsque les cellules atteignent un niveau de confluence subconfluent, laver les cellules deux fois avec du PBS et les traiter à la trypsine. Compter les cellules pour les quantifier. Pour la mise en culture, préparer à semer les cellules sur des supports prédécoupés de quatre millimètres de diamètre avec 1,5 fois 10 à la puissance 5 cellules.Placer un support individuel dans un puits d'une plaque 96 puits, puis resuspendre les cellules dans un milieu de croissance ordinaire à une concentration d'environ 1,5 × 10⁵ cellules par 20 microlitres de milieu. Ensemencer le support en pipetant 20 microlitres de la solution directement dans le support, puis placer celui-ci dans l'incubateur de culture cellulaire pendant 30 minutes.Après 30 minutes, ajouter 200 microlitres de milieu et laisser les cellules s'incuber sur le support toute la nuit. Avant la chirurgie, il n'est pas nécessaire de s'assurer de l'adhésion des cellules au support lors du semis. Un nombre suffisant de cellules garantira qu'une majorité d'entre elles s'attacheront au support.Après avoir anesthésié une souris nude CD adulte âgée de 60 jours, stérilisez le site chirurgical avec de la Bétadine et de l'alcool trois fois et appliquez un lubrifiant sur les yeux des souris. Ensuite, pratiquez une incision sagittale médiane dans le cuir chevelu de la souris afin d'exposer l'os pariétal droit. Retirez le perran de l'os pariétal droit par raclage émoussé.Ensuite, créez un défaut unilatéral de quatre millimètres de pleine épaisseur dans l'os pariétal droit non associé aux sutures. À l’aide d’un foret à pointe diamantée, faites extrêmement attention à ne pas perturber la dure-mère sous-jacente, car l’épaisseur du calvaria de la souris est inférieure à 0,3 millimètre avant l’implantation. Rincez les échafaudages avec du PBS stérile afin d’éviter le transfert de facteurs de croissance provenant du milieu.Placer la charpente dans le défaut. Enfin, suturer la peau et surveiller l'animal selon les protocoles postopératoires établis. Réaliser une micro-TDM sur la souris et obtenir une image reconstruite en 3D à l'aide du logiciel MicroView.Utilisez Adobe Photoshop pour redimensionner les images à une hauteur standard. Généralement, nous mesurons la régénération calvarienne toutes les deux semaines. Les souris sont anesthésiées pendant l'analyse pour un suivi à long terme et finalement euthanasiées.Pour l'analyse histologique, utilisez la fonction baguette magique pour mesurer les pixels du défaut calvarien. Déterminez le pourcentage de cicatrisation du défaut par des scanners TDM ultérieurs. Mesurez la surface du défaut calvarien, déterminez le nombre de pixels et divisez-le par le nombre de pixels du défaut d'origine ; effectuez une coloration de plusieurs coupes réalisées le long de l'étendue du défaut à l'aide de colorants histologiques tels que l'anneau bleu et le pen aro afin de mettre en évidence la formation ostéo. Utilisez Adobe Photoshop pour recadrer toutes les zones qui ne se trouvent pas dans le défaut calvarien et utilisez l'outil de baguette magique pour déterminer le nombre de pixels correspondant à la formation osseuse de novo dans la zone du défaut, puis comparez ces valeurs aux témoins ou à d'autres variables. Voici un aperçu de la récolte et de l'application du lipoaspirat, depuis l'isolement des cellules stromales dérivées du tissu adipeux jusqu'à leur expansion, leur différenciation et leur utilisation in vitro et in vivo. Voici une micro-TDM montrant la cicatrisation in vivo d'un défaut calvarien de taille critique grâce à l'application de cellules stromales adipeuses (ASC) via une matrice en hydroxyapatite, visible sur la ligne inférieure.Les témoins, visibles sur la rangée supérieure, incluent l'absence de support et de défaut. La rangée du milieu montre le défaut avec la mise en place du support sans cellules. LS représenté ici correspond à la quantification de la cicatrisation osseuse obtenue par micro-tomodensitométrie, qui révèle une cicatrisation significativement accrue dans le groupe A SC.Il s'agit d'une image histologique montrant une augmentation de la formation osseuse dans le groupe A SC par andal. En bleu et au stylo AROM, coloration pour al. En bleu, l'ostéoïde se colore en bleu foncé au stylo aromatase.Les ostéoïdes colorés en jaune visibles ici sont des ASC humaines marquées par la GFP, qui ont été ensemencées sur une matrice et sacrifiées après deux semaines. La coloration a été réalisée à l'aide d'un anticorps marqué à la GFP afin de montrer la contribution des cellules humaines à la régénération dans la zone du défaut. On observe ici une immuno-histochimie de l'antigène nucléaire humain montrant la prévalence des cellules humaines dans la zone du défaut après deux semaines.Une fois maîtrisée, la préparation du tissu adipeux peut être effectuée en moins de quatre heures, et la procédure chirurgicale peut prendre environ 10 minutes par souris. Il est important de se rappeler que l'os pariétal est rond tandis que le foret est plat, il faut donc veiller à traverser toute la circonférence du défaut de quatre millimètres. Procédez lentement afin d'éviter de lésionner la dure-mère au niveau du cerveau.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler les couches progénitrices à partir du tissu adipeux. Semez ces cellules sur un support et placez-les dans la souris.

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