Réparation d'un modèle de critique des défauts de taille crânienne Utilisation adipeuses cellules stromales prélevés sur des Lipoaspirate

L'objectif général de cette procédure est de prélever des cellules stromales multipotentes à partir de tissu adipeux en vue d'une différenciation ostéogénique, en utilisant un modèle de défaut calvarial in vivo chez la souris. Cela est réalisé en isolant d'abord les cellules progénitrices de la couche vasculaire stromale du tissu adipeux, qui peut être obtenue après une intervention de liposuccion. L'étape suivante consiste à préparer une matrice tridimensionnelle, puis à ensemencer les cellules sur ce support.

La dernière étape consiste à créer un défaut calvarial de taille critique dans un modèle murin, dans lequel sont placés le support tridimensionnel et les cellules. En définitive, les résultats montrent que les cellules stromales multipotentes isolées à partir du tissu adipeux présentent un potentiel de régénération squelettique in vivo. Les applications de cette technique offrent un large éventail de possibilités cliniques en raison de la pénurie de tissu disponible pour la régénération squelettique.

Bien que les greffes osseuses autologues soient la référence, le manque de sites donneurs et la morbidité du site donneur limitent cette option. Les allogreffes et les matériaux étrangers peuvent être utilisés, mais sont limités par leur coût, une mauvaise intégration et un risque d'infection.

L'utilisation possible du tissu adipeux ou gras pour l'isolement de cellules progénitrices en vue de l'ingénierie des tissus squelettiques est prometteuse. La démonstration de la procédure sera réalisée par mes soins et par Michael Chung du laboratoire Long Anchor. Tout d'abord, obtenir du tissu adipeux sous-cutané humain à partir de liposuccions électives.

Et observez les deux couches présentes dans l'aspirat lipidique. Le surnageant contient la majeure partie du matériel cellulaire obtenu au cours du processus. La couche inférieure est principalement constituée de sérum physiologique injecté.

Les cellules stromales dérivées du tissu adipeux peuvent être récupérées à partir de l'une ou l'autre couche, mais le rendement est nettement plus élevé dans le surnageant. Pour isoler la fraction vasculaire stromale ou le lavage SVF, laver abondamment le lipoaspirat avec des volumes équivalents de solution saline tamponnée au phosphate 1 x ou PBS contenant 2,5 % de Bétadine, puis aspirer un volume égal de PBS 1 x sans Bétadine. Laisser le lavage précipiter.

Veillez à maintenir une technique stérile tout au long du processus afin d'éviter toute contamination par des tissus humains manipulés. Ensuite, aspirez la couche inférieure et jetez-la après chaque lavage, puis transférez 15 millilitres de tissu adipeux dans des tubes coniques Falcon de 50 millilitres. Procédez ensuite à la digestion du tissu adipeux dans 15 millilitres de solution filtrée à 0,075 % filtrée.

Incubez la collagénase de type II dans une solution saline équilibrée de Hank ou HBSS à 37 degrés Celsius dans un bain-marie pendant 60 minutes sous agitation constante, en veillant à ventiler les tubes toutes les 15 minutes. Neutralisez ensuite l'activité enzymatique avec 15 millilitres de PBS contenant 10 % de sérum bovin fœtal ou FBS et centrifugez. Pour obtenir un culot dense de fraction stromale-vasculaire (SVF), le culot sera composé d'un mélange de cellules souches dérivées du tissu adipeux et d'érythrocytes.

Jetez d'abord la couche de gras du surnageant, puis éliminez la couche liquide du surnageant sans perturber le culot. Resuspendez le culot dans 10 millilitres de milieu de croissance classique. Ensuite, réunissez les trois tubes dans un seul tube conique propre de 50 millilitres à l’aide d’un filtre de 100 microns et centrifugez.

Jetez le surnageant sans perturber le culot, puis resuspendez le culot. Dans cinq millilitres de milieu de croissance traditionnel, combinez deux tubes coniques de 50 millilitres par plaque de 10 centimètres, ou cinq tubes coniques de cinq millilitres pour une plaque de 15 centimètres. Établissez les cultures primaires pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 21 % d'oxygène et 5 % de dioxyde de carbone.

Après une incubation nocturne, laver les plaques avec du PBS pour éliminer les globules rouges résiduels non adhérents. Les populations cellulaires obtenues sont des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux. Maintenir les cellules à des niveaux subconfluents afin d'éviter une différenciation spontanée.

À 37 degrés Celsius, 21 % d'oxygène et 5 % de dioxyde de carbone. Dans le milieu de croissance, les cellules doivent généralement être divisées tous les trois à quatre jours dans un milieu de croissance standard. Lorsqu'elles sont ensemencées à une confluence de 50 %, préparez le support comme indiqué dans le manuscrit accompagnant.

Lorsque les cellules atteignent un niveau de sous-confluence, laver les cellules deux fois avec du PBS et les traiter à la trypsine. Compter les cellules pour les quantifier. Pour la mise en culture, préparer l'ensemencement des cellules sur des supports prédécoupés de quatre millimètres de diamètre avec 1,5 × 10⁵ cellules.

Placer un support individuel dans un puits d'une plaque 96 puits, puis resuspendre les cellules dans un milieu de croissance ordinaire à une concentration d'environ 1,5 × 10⁵ cellules par 20 microlitres de milieu. Ensemencer le support en pipetant 20 microlitres de la solution directement dans le support, puis placer celui-ci dans l'incubateur de culture cellulaire pendant 30 minutes.

Après 30 minutes, ajouter 200 microlitres de milieu et laisser les cellules s'incuber sur le support toute la nuit. Avant la chirurgie, il n'est pas nécessaire de s'assurer de l'adhésion des cellules au support lors du semis. Un nombre suffisant de cellules garantira qu'une majorité d'entre elles s'attachera au support.

Après avoir anesthésié une souris adulte CD1 nue âgée de 60 jours, stérilisez le site chirurgical avec de la Bétadine et de l'alcool trois fois et appliquez un lubrifiant sur les yeux des souris. Ensuite, pratiquez une incision sagittale médiane dans le cuir chevelu de la souris afin d'exposer l'os pariétal droit. Retirez le perran de l'os pariétal droit par raclage émoussé.

Ensuite, créez un défaut unilatéral de quatre millimètres de pleine épaisseur dans l’os pariétal droit non associé aux sutures. À l’aide d’un foret à pointe diamantée, veillez scrupuleusement à ne pas perturber la dure-mère sous-jacente, car l’épaisseur du crâne du souriceau est inférieure à 0,3 millimètre avant l’implantation. Rincez les échafaudages avec du PBS stérile afin d’éviter le transfert de facteurs de croissance provenant du milieu.

Placer la charpente dans le défaut. Enfin, suturer la peau et surveiller l'animal selon les protocoles postopératoires établis. Réaliser une micro-TDM sur la souris et obtenir une image reconstruite en 3D à l'aide du logiciel MicroView.

Utilisez Adobe Photoshop pour redimensionner les images à une hauteur standard. Généralement, nous mesurons la régénération calvarienne toutes les deux semaines. Les souris sont anesthésiées pendant l'analyse pour un suivi à long terme et finalement euthanasiées.

Pour l'analyse histologique, utilisez la fonction baguette magique pour mesurer les pixels du défaut calvarien. Déterminez le pourcentage de cicatrisation du défaut par des scanners TDM ultérieurs. Mesurez la surface du défaut calvarien, déterminez le nombre de pixels et divisez-le par le nombre de pixels du défaut d'origine ; effectuez une coloration de plusieurs sections le long de l'étendue du défaut à l'aide de colorants histologiques tels que l'anneau bleu et le pen aro afin de mettre en évidence la formation ostéo.

Utilisez Adobe Photoshop pour recadrer toutes les zones qui ne se trouvent pas dans le défaut calvarien et utilisez l'outil baguette magique pour déterminer le nombre de pixels correspondant à la formation osseuse de novo dans la zone du défaut, puis comparez ces valeurs aux témoins ou à d'autres variables. Voici un aperçu de la récolte et de l'application du lipoaspirat, depuis l'isolement des cellules stromales dérivées du tissu adipeux jusqu'à leur expansion, leur différenciation et leur utilisation in vitro et in vivo. Voici une micro-TDM montrant la cicatrisation in vivo d'un défaut calvarien de taille critique grâce à l'application de cellules stromales adipeuses (ASC) via une matrice en hydroxyapatite, visible sur la ligne inférieure.

Les témoins, visibles sur la rangée supérieure, incluent l'absence de support et de défaut. La rangée du milieu montre le défaut avec la mise en place du support sans cellules. LS représenté ici correspond à la quantification de la cicatrisation osseuse provenant de la micro-TDM, qui montre une cicatrisation significativement accrue dans le groupe A SC.

Il s'agit d'une image histologique montrant une formation osseuse accrue dans le groupe A SC par l'andal. En bleu et au stylo AROM, coloration pour l'al. En bleu, l'ostéoïde se colore en bleu foncé au stylo arom.

Les ostéoïdes colorés en jaune visibles ici sont des ASC humaines marquées par la GFP, qui ont été ensemencées sur une matrice et sacrifiées après deux semaines. La coloration a été réalisée à l'aide d'un anticorps marqué à la GFP afin de montrer la contribution des cellules humaines à la régénération dans la zone du défaut. On observe ici une immuno-histochimie de l'antigène nucléaire humain, montrant la prévalence des cellules humaines dans la zone du défaut après deux semaines.

Une fois maîtrisée, la préparation du tissu adipeux peut être effectuée en moins de quatre heures, et la procédure chirurgicale peut prendre environ 10 minutes par souris. Il est important de se rappeler que l'os pariétal est rond tandis que le foret est plat, il faut donc faire attention à traverser toute la circonférence du défaut de quatre millimètres. Veillez à procéder lentement afin d'éviter de lésionner la dure-mère au niveau du cerveau.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler les couches progénitrices à partir du tissu adipeux. Réalisez la mise en place de ces cellules sur un échafaudage et insérez-les dans la souris.